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两种新型甘露聚糖水解酶的生化特征、分子改造与催化特性的研究

两种新型甘露聚糖水解酶的生化特征、分子改造与催化特性的研究

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作者：宓延红山东大学

学位级别：硕士

甘露聚糖是一类具有复杂结构的植物多糖,其主链通常是由甘露糖、葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键链接而成的。根据其分支结构的糖单元组成特征,可分为纯甘露聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘聚糖。甘露聚糖具有独特的理化性质,如可... 详细信息

甘露聚糖是一类具有复杂结构的植物多糖,其主链通常是由甘露糖、葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键链接而成的。根据其分支结构的糖单元组成特征,可分为纯甘露聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘聚糖。甘露聚糖具有独特的理化性质,如可吸水成胶、具有一定化学惰性强且生物安全性高,因而广泛应用于食品、制药和纺织工业中。与多糖不同,甘露寡糖具有重要生理活性,如抗肿瘤、调节免疫力、促进细胞分裂等。研究还表明,甘露寡糖的生物活性与糖单元的组成、聚合度的大小等密切相关。甘露聚糖酶是一类糖基水解酶(Glycoside Hydrolases,GHs)的总称,能催化多糖内不同类型糖苷键的降解,从而生成分子量更小的寡糖。相比化学或物理方法,酶法降解甘露聚糖制备寡糖的策略具有因反应条件温和而可控性强、因底物选择性清晰而产物明确等优势。然而,目前市场少见能够制备具有特定结构寡糖片段的工具型β-甘露聚糖酶。因此,深入进行相关的酶学资源开发、分子改造及催化特性的研究成为重要的前期基础。甘露聚糖因结构复杂而需要多种酶,如内切酶、外切酶或糖苷酶的协同作用才能实现较为彻底的降解。其中,内切型β-甘露聚糖酶(EC 3.***.1.78)可随机切割甘露聚糖主链内部的β-1,4糖苷键,是目前关于甘露聚糖酶的研究热点,主要集中在β-甘露聚糖酶的资源开发、晶体结构以及通过分子改造来改变酶的生化特征的研究。然而,关于β-甘露聚糖酶的底物选择性、多糖底物降解模式、寡糖生成特性,及其与催化机制的关联研究则相对较少,这限制了 β-甘露聚糖酶在如寡糖定向制备、糖链测序等方面的精确应用。海洋来源的火色杆菌属(Flammeovirga sβ.)MY04菌株,能以包括甘露聚糖、琼脂糖、褐藻胶等在内的十余种多糖为唯一碳源进行生长,因此也是一株甘露聚糖酶的资源菌。本文首先对MY04菌株的全基因组进行分子挖掘,获得了两个潜在β-甘露聚糖酶基因man01929和man02066;借助生物信息学的软件分析了Man01929和Man02066的蛋白质序列特征;分别构建表达载体、异源表达并纯化了重组酶,重点比较分析了 β-甘露聚糖酶rMan01929和rMan02066在生化特征、底物选择性、底物(多糖和寡糖)降解模式、产物(寡糖)生成特性等诸多方面的差异,分析了相关的内在联系。本文基于β-甘露聚糖酶Man01929的三维结构模拟,进行了理性设计与定点突变,并通过比较研究,分析了酶的底物选择性、寡糖产物生成特性与蛋白质结构之间的内在关系,探讨了 Man01929及其系列突变体之间可进行不同催化机制类型转变的分子机制。本文主要研究结果如下:1、β-甘露聚糖酶Man01929和Man02066的序列特征、生化特征与酶学特性的比较研究(1)β-甘露聚糖酶Man01929和Man02066的序列特征β-甘露聚糖酶Man01929含有932个氨基酸,理论分子量为103.1kDa,等电点为4.25,且无信号肽。预测Man01929有五个功能模块,N端含一个GH5催化模块,447-585 位氨基酸残基为 Coagulation factor 5/8 C-terminal 模块、595-766位氨基酸含有 2 个 PKD/Chitinase 模块、C 端含有 Carbohydrate-binding module 64(CBM64)和 Secretion system C-terminal sorting domain 两个功能模块。在已鉴定的酶中,Man01929 与来自 Blue Mussel Mytilus edulis的Man5A 的一致性最大,36.79%。系统发育树分析表明Man01929属于GH5家族中10亚家族。β-甘露聚糖酶Man02066含有378个氨基酸,理论分子量为44.1kDa,等电点为5.49,N端1-22位氨基酸残基为Ⅰ型信号肽。Man02066仅含有一个GH26催化模块(Glycoside hydrolase family 26 domain)。在已鉴定的β-甘露聚糖酶中与来自Cellvibrio japonicus的CjMan26C序列一致性最高,为42.82%,系统发育树分析表明Mna02066属于GH26家族。(2)重组酶rMan01929和rMan02066的生化特征重组酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(KGM)和槐豆胶(LBG)的最适温度分别是40℃C和50℃,最适pH分别是8.0和5.0;重组酶rMan01929具有一定的热稳定性(0-40℃)和较宽的pH耐受性(5.0-10.0);金属离子Co2+加入不同底物的反应液中,对rMan01929的活性有不同的影响,如当底物为KGM时可以促进rMan01929的活性,当底物为LBG是,显著抑制rMan01929的活性。重组酶rMan020

关键词：火色杆菌 β-甘露聚糖酶底物降解模式寡糖生成特性定点突变转糖基

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来源于白长链霉菌中新型甲壳素酶的克隆、酶学性质及底物降解机制的研究

来源于白长链霉菌中新型甲壳素酶的克隆、酶学性质及底物降解机制...

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中国食品科学技术学会第十五届年会

作者：高丽孙建安 Francesco Secundo 毛相朝中国海洋大学食品科学与工程学院海洋国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室

甲壳素是存在于自然界中的生物大分子多糖,由于其高度不溶性的特点,限制了甲壳素在各个领域中的应用,而甲壳素的降解产物甲壳寡糖,可以跨越细胞膜进入生物体内,具有更好的生物活性。甲壳素酶是专一性降解甲壳素的一类糖苷水解酶,因此,... 详细信息

甲壳素是存在于自然界中的生物大分子多糖,由于其高度不溶性的特点,限制了甲壳素在各个领域中的应用,而甲壳素的降解产物甲壳寡糖,可以跨越细胞膜进入生物体内,具有更好的生物活性。甲壳素酶是专一性降解甲壳素的一类糖苷水解酶,因此,获得高效的甲壳素酶,对甲壳寡糖的制备有重要的意义。本研究成功克隆表达了一种来源于白长链霉菌（Streptomyces albolongus ATCC 27414）中的新型甲壳素酶,并对其进行纯化,然后对其酶学性质、产物特点及底物降解模式进行研究。实验结果表明:甲壳素酶（SaChiA4）的最适反应温度和pH分别:55℃和5.0,比酶活为66.2 U/mg,该酶具有较好的pH稳定性和耐热性。此外,SaChiA4具有较严格的底物特异性,而且以不连续的方式对底物进行随机切割,属于内切酶,以胶质甲壳素为底物,终产物为甲壳二糖（主要产物）和N-乙酰氨基葡萄糖。

关键词：甲壳素酶克隆表达酶学性质底物降解模式

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