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海洋渔业 2021年第2期43卷 176-183页

作者：姜伟孙兆跃施文静范瑞良李楠楠全为民上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院东海水产研究所农业农村部东海渔业资源开发重点实验室上海200090

通过2019年室内和野外附着实验,检验了牡蛎壳(新壳和旧壳)和生物膜(有生物膜和无生物膜)对牡蛎附着量的影响。室内附着实验表明,在生物膜处理下新壳上牡蛎附着量显著高于旧壳(P0.05)。野外附着实验发现,生物膜显著提升了旧壳上牡蛎附着... 详细信息

通过2019年室内和野外附着实验,检验了牡蛎壳(新壳和旧壳)和生物膜(有生物膜和无生物膜)对牡蛎附着量的影响。室内附着实验表明,在生物膜处理下新壳上牡蛎附着量显著高于旧壳(P0.05)。野外附着实验发现,生物膜显著提升了旧壳上牡蛎附着量,但对新壳上牡蛎附着量无显著影响。通过2020年野外附着实验,检验了牡蛎壳(新壳和旧壳)和潮区(滩面以上0.6 m和1.1 m)对牡蛎和藤壶附着量的影响。牡蛎附着量在每个潮区中,15 d、45 d和70 d时新壳均显著高于旧壳(P0.05)。研究发现,总体来看新壳的附苗效果好于旧壳,这种差异涵盖了整个牡蛎繁殖、附着及补充的高峰期。因此,牡蛎礁修复中应优先选取新壳作为底物。

关键词：牡蛎礁底物筛选牡蛎苗藤壶苗附着生物膜

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线性泛素化连接酶LUBAC高通量底物筛选体系的建立

线性泛素化连接酶LUBAC高通量底物筛选体系的建立

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作者：高欣中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

蛋白质泛素化修饰在细胞周期进程、信号转导、DNA损伤修复等多种细胞生命进程中发挥重要的调控作用[1]。常见的泛素化修饰可按照在泛素分子上的赖氨酸残基位置分为以下七种泛素连接形式:K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位泛素化修饰,... 详细信息

蛋白质泛素化修饰在细胞周期进程、信号转导、DNA损伤修复等多种细胞生命进程中发挥重要的调控作用[1]。常见的泛素化修饰可按照在泛素分子上的赖氨酸残基位置分为以下七种泛素连接形式:K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位泛素化修饰,又可根据泛素的数目分为单泛素化修饰和多聚泛素化修饰[2]。不同的泛素连接形式发挥不同的生物学功能,如单泛素化修饰多参与膜转运和胞内吞,而多聚泛素化修饰中,K48位多聚泛素化修饰最常见,是26S蛋白酶体的降解信号,K63位多聚泛素化修饰主要是参与DNA损伤修复和信号转导,K11位多聚泛素化修饰参与细胞周期过程中的蛋白质降解[1]。蛋白泛素化过程涉及包括泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme,E1),泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)和泛素连接酶(ubiquitin ligase,E3)在内一系列酶的级联反应。在ATP供能的情况下,E1酶连接泛素,泛素分子的赖氨酸残基被激活,E1将激活的泛素转移给E2酶,E3酶识别底物蛋白,E2酶携带激活的泛素与E3酶结合,将泛素连于底物上,完成对底物的泛素化修饰,在不同蛋白质的泛素化修饰过程中E3酶起关键作用。2006年日本大阪大学Kazuhiro Iwai教授实验室发现了一种新的泛素化修饰,其泛素连接形式不是已知的泛素内部赖氨酸相关的,而是泛素首尾相连形成线性泛素化链,即一个泛素单体N端的甘氨酸与上一个泛素单体C端的甲硫氨酸之间形成线性泛素化链,称为线形泛素化修饰[3]。在已知发现的600多种E3酶中,LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)复合物是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。该复合物由HOIP(HOIL-1-interacting protein,又称RNF31、ZIBRA或PAUL)、SHARPIN(Shank-associated RH domain-interacting protein)和HOIL-1L(longer isoform of haem-oxidizediron-regulatory proteinubiquitin ligase 1)组成,其中HOIP是核心组分,主要行使线性泛素化E3酶的活性,HOIP的突变或缺失均不能使该复合物发挥线性泛素化修饰E3酶的功能。自从线性泛素化修饰和线性泛素化E3酶LUBAC被发现后,人们对LUBAC的功能和底物产生了极大兴趣。目前报道LUBAC复合物的底物有NEMO(NF-kappa-B essential modulator)[4]、TRIM25(ISG15 ligase TRIM25)[5]、RIPK2(Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2)[6]和ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)[7]。初步发现的线性泛素化修饰的生物学功能主要体现在先天性免疫和抑制炎症反应等过程,更多的由线性泛素化所调控的生物学功能尚待探索,因此系统筛选和鉴定LUBAC的线性泛素化底物对于充分理解线性泛素化的生物学功能具有重要意义。本论文拟采用新型的crispr/cas9基因编辑技术结合高分辨亲和质谱分析技术,建立高通量线性泛素化位点鉴定和底物筛选体系,为进一步深入探索线性泛素化的生物学功能提供线索。crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences)技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具被广泛应用。crispr/cas9技术通过单链向导rna(singleguide-rna,sgrna)对目的基因上下游进行靶标并招募cas9核酸酶对dna双链进行切割,利用细胞非同源性末端接合(non-homologousendjoining,nhej)的dna修复机制的不准确性,从而达到敲除目的基因的作用[9]。和锌指核酸酶技术(zinc-fingernuclease,zfn)和转录激活样效应因子核酸酶技术(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,talen)相比,crispr/cas9技术更简单更容易实现,也越来越受瞩目,是目前靶向基因编辑的重要技术。作为蛋白质组学研究的重要工具,质谱分析在蛋白翻译后修饰类型识别、位点鉴定、结构解析以及定量测定等方面发挥着不可或缺的作用。质谱技术的发展有力推动了蛋白翻译后修饰研究,促进修饰位点的鉴定效率、覆盖率、定位精确度以及定量准确度不断提高。目前以质谱技术为

关键词： LUBAC CRISPR/Cas9 HOIP 线性泛素化修饰底物筛选

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利用噬菌体肽库筛选胰凝乳蛋白酶的底物

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中国生物化学与分子生物学报 2000年第2期16卷 240-243页

作者：杨凌燕刘莹周慧李维吉林大学生命科学学院长春130012

利用脱水胰凝乳蛋白酶 (保持天然酶的完整结合部位 ,但没有催化活性 )作为靶蛋白 ,在噬菌体肽库中钓取一些有结合活力噬菌体 ,再将得的噬菌体同固定化的天然酶一起保温 ,能够被天然酶水解的那部分噬菌体即为底物噬菌体 .利用 DNA测序技... 详细信息

利用脱水胰凝乳蛋白酶 (保持天然酶的完整结合部位 ,但没有催化活性 )作为靶蛋白 ,在噬菌体肽库中钓取一些有结合活力噬菌体 ,再将得的噬菌体同固定化的天然酶一起保温 ,能够被天然酶水解的那部分噬菌体即为底物噬菌体 .利用 DNA测序技术测出筛得的短肽序列 ,分析序列保守性 ,发现 WR和 YF的组合具有很强的保守性 .合成相应的几个短肽 ,与天然酶作用 ,发现芳香族氨基酸与碱性氨基酸的组合较易被胰凝乳蛋白酶切割 .而且 ,当 P2 、P3 位置为侧链较小的氨基酸或碱性氨基酸时 ,更有利于水解的发生 .精氨酸无论处在任何位置。

关键词：胰凝乳蛋白酶底物筛选噬菌体肽库

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利用泛素结合结构域UBAN探针鉴定线性泛素化底物

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中国药理学与毒理学杂志 2019年第1期33卷 30-37页

作者：司甜杜现礼刘峰段小涛军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

目的根据已知线性泛素化底物NF-κB必需调节蛋白(NEMO)的泛素结合结构域UBAN构建蛋白探针,在目的细胞中富集线性泛素化底物并应用质谱技术进行鉴定,探索线性泛素化在不同生物学事件中发挥调控功能的分子机制。方法 (1)首先通过大肠杆菌... 详细信息

目的根据已知线性泛素化底物NF-κB必需调节蛋白(NEMO)的泛素结合结构域UBAN构建蛋白探针,在目的细胞中富集线性泛素化底物并应用质谱技术进行鉴定,探索线性泛素化在不同生物学事件中发挥调控功能的分子机制。方法 (1)首先通过大肠杆菌表达系统表达纯化特异性识别线性泛素链的蛋白UBAN,通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签将其与GST琼脂糖微珠连接制成UBAN探针。随后在293T细胞中共转染阳性底物NEMO和线性泛素化链组装复合体(LUBAC)使之过表达,利用UBAN探针免疫共沉淀富集NEMO上的线性泛素链,并通过Western蛋白印迹法验证UBAN探针与线性泛素化链的结合能力,从而确定体系是否建立成功。(2)在293T细胞裂解液中免疫共沉淀富集线性泛素化底物并对其进行质谱鉴定和生物信息学分析,得到潜在线性泛素化底物。在293T细胞中共转染潜在线性泛素化底物极光激酶A(Aurora-A)和LUBAC,用Western蛋白印迹法鉴定。(3)用siRNA干扰Hela细胞LUBAC,并使细胞周期同步化,用Western蛋白印迹法观察线性泛素化对潜在底物Aurora-A生物学功能的调控。结果 (1) Western蛋白印迹法结果表明,UBAN探针能够结合NEMO上的线性泛素链,从而确定体系建立成功。(2)质谱鉴定结果显示,免疫共沉淀法富集到包括极光激酶A(Aurora-A)在内的403个潜在线性泛素化底物;在293T细胞中共转染Aurora-A和LUBAC后,用Western蛋白印迹法测定结果发现,Aurora-A具有线性泛素链特征性条带,具有与线性泛素化链结合的能力。(3) Western蛋白印迹实验结果显示,与对照组相比,干涉LUBAC后Aurora-A苏氨酸288位磷酸化水平上调,表明其被激活。结论运用泛素结合结构域UBAN探针可以实现线性泛素化底物的有效捕捉与富集,在293T细胞中鉴定到底物Aurora-A的自激活可能受线性泛素化调控。本研究建立的线性泛素化底物鉴定策略为进一步探索蛋白质线性泛素化修饰的更多生物学功能提供了新的思路和方法。

关键词： UBAN结构域线性泛素化修饰底物筛选极光激酶A

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3个典型海湾中牡蛎幼体附着补充的时空格局

3个典型海湾中牡蛎幼体附着补充的时空格局

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作者：姜伟上海海洋大学

学位级别：硕士

牡蛎幼体附着的时空格局及影响因素对牡蛎礁修复策略的制定具有重要意义。不同修复区域内牡蛎幼体的附着格局往往存在巨大差异,在制定修复方案前有必要对特定研究系统内本地牡蛎繁育与幼体附着的时空格局以及潜在的影响因素进行全面调... 详细信息

牡蛎幼体附着的时空格局及影响因素对牡蛎礁修复策略的制定具有重要意义。不同修复区域内牡蛎幼体的附着格局往往存在巨大差异,在制定修复方案前有必要对特定研究系统内本地牡蛎繁育与幼体附着的时空格局以及潜在的影响因素进行全面调查。本研究探讨了我国中东部3个典型海湾内牡蛎繁育与幼体附着的时空格局,同时对潜在的影响因素进行了初步分析。主要研究结果如下:1、蛎蚜山及周边水域牡蛎幼体附着补充的时空格局了解牡蛎幼体的附着动态对牡蛎礁修复地点的选择与修复方案的制定具有重要意义。本研究阐述了2019-2020年期间在中国蛎蚜山(LYS)附近的海岸牡蛎和藤壶补充的时空格局,并从环境因素(食物丰度,水文条件)、竞争者(有、无藤壶附着)、捕食者(有、无捕食者)三个方面深入分析了蛎蚜山牡蛎礁幼体低附着丰度的原因。2019和2020年两个年度,牡蛎幼体附着均从6月开始,并持续至11月下旬或12月初,且幼体附着丰度在8月份达到高峰。我们在10公里的小尺度上监测了牡蛎的附着差异,结果显示受保护的近岸监测点牡蛎幼体附着密度显著高于远岸监测点(P底物上附着的藤壶显著抑制了牡蛎幼体的附着(P底物的质量可能是导致蛎蚜山牡蛎礁群附着幼体丰度显著低于近岸监测点的主要原因。建议在7月下旬在牡蛎高附着区增加合适的附着底物,确保幼体的成功附着。同时应加强对近岸牡蛎繁殖的保护,将其作为蛎蚜山牡蛎种群修复的幼体补充区域。2、健跳港上游湾区牡蛎繁育与幼体附着补充的时空格局2020年5月-2021年3月对健跳港上游潮间带三种牡蛎(熊本牡蛎、近江牡蛎、葡萄牙牡蛎)繁育与幼体附着的时空格局进行了同步分析。各个时期内熊本牡蛎与近江牡蛎性腺发育成熟度无显著差异(P>0.05),两种牡蛎性腺横切指数均在6月、7月、8月处于较高水平,近江牡蛎性腺横切指数最高值出现在6月,熊本牡蛎性腺横切指数最高值出现在8月;对比牡蛎性腺发育的四个分期(未分化期、性分化期、成熟排放期、休止期)发现,熊本牡蛎未分化期为1-3月,近江牡蛎相对滞后,未分化期为2-3月;两种牡蛎均在4-5月进入性分化期;5月中下旬,两种牡蛎性腺发育成熟,开始进入成熟排放期,该阶段熊本牡蛎可持续至10月下旬,11、12月仍可采集到成熟排放期的熊本牡蛎,近江牡蛎则只持续至10月中上旬。11月-次年1月,两种牡蛎绝大部分处于休止期状态。三种牡蛎幼体的附着与生长模式呈现极显著的时空差异(P<0.01)。熊本牡蛎附着高峰期出现在7月上旬-8月下旬,并在8月下旬达到峰值;近江牡蛎附着高峰期与熊本牡蛎一致,但附着的峰值出现在7月上旬,比熊本牡蛎提前约1个月达到附着峰值;葡萄牙牡蛎仅在5月有较高的附着量并到达峰值,随后始终处于较低附着量。熊本牡蛎幼体在1.6 m潮区附着丰度显著高于其他潮区,其次在0.1m、0.6 m和1.1 m有较高附着量;近江牡蛎附着偏好出现在较低潮区(0.1 m-0.6m),随着潮区的升高,近江牡蛎的附着丰度随之下降;葡萄牙牡蛎最佳附着潮区分布范围较广,在0.1 m、0.6 m、1.1 m和1.6 m高程均有相似的附着丰度。藤壶附着高峰期出现在6月中下旬,最适附着高程为0.6 m,与三种牡蛎最适附着潮区存在重叠。此外,熊本牡蛎幼体早期(1 d、3 d)附着的空间模式与累积监测(15d)结果相似,均在1.6 m潮区出现较高附着量,进一步证实了熊本牡蛎在潮间带的垂直分布格局是幼体选择性附着的结果。熊本牡蛎幼体在低潮区的生长速率显著高于高潮区(P<0.01),稚贝生长的黄金时期为8月下旬。考虑到熊本牡蛎幼体丰度在整个繁殖期占主导优势,应首选熊本牡蛎作为造礁物种进行修复活动,最佳投礁时期为7月下旬。3、象山港熊本牡蛎幼体分布、附着及生长的空间格局本研究通过野外调查,监测了1个完整潮汐周期(9个潮时采样)内象山港2个试验点(采苗场和产卵场)表层、底层水体中熊本牡蛎幼体的时空动态,并开展野外附着试验,检验了熊本牡蛎在2个试验点和3个潮区(上层T、中层M和底层B)附着及生长的空间格局。结果表明:在1个完整潮汐周期内,2个试验点表层水体中牡蛎幼体丰度均有显著的时间变化(P<0.05),采苗场表层水体中熊本牡蛎幼体丰度最大值(20.8±5.6 ind·L)出现于高平潮时,显著高于其8个潮时;而产卵场相反,高平

关键词：牡蛎牡蛎礁修复牡蛎苗藤壶苗附着竞争捕食底物筛选

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苏云金芽胞杆菌ABC转运蛋白的功能鉴定

苏云金芽胞杆菌ABC转运蛋白的功能鉴定

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作者：林菲菲福建农林大学

学位级别：硕士

ABC(ATP-binding cassette)家族是真核和原核生物机体中存在的最大的蛋白超家族之一。本研究克隆了苏云金芽胞杆菌(Bacilllus thuringiensis,Bt)BRC-HZP7中位于chiA下游与其相距较近的ABC基因,命名为ABC-1,并克隆绿色荧光蛋白Gfp基因,... 详细信息

ABC(ATP-binding cassette)家族是真核和原核生物机体中存在的最大的蛋白超家族之一。本研究克隆了苏云金芽胞杆菌(Bacilllus thuringiensis,Bt)BRC-HZP7中位于chiA下游与其相距较近的ABC基因,命名为ABC-1,并克隆绿色荧光蛋白Gfp基因,构建融合表达载体pET32a-Gfp-ABC-1,导入大肠杆菌BL21中进行表达。通过细胞破碎将诱导表达后的菌株pET32a-Gfp-ABC-1成分分离镜检,并通过SDS-PAGE及膜蛋白提取,证实ABC-1转运蛋白在行使功能时是定位于细胞膜上的。利用在线软件对ABC-1进行生物信息学结构分析。结构分析中显示α螺旋在ABC-1所占的比例最大(47.39%),推测该ABC-1蛋白是正向“半分子”的转运模型:NBD-TMD。这些α螺旋聚集在一起,呈现出一个类似的“通道”构象,该结构可能形成了溶质跨膜的通道。预测结果显示该单体是通过形成二聚体的形成来发挥功能蛋白的作用。选取 pET32a、pET32a-Gfp、pET32a-ABC-1、pET32a-Gfp-ABC-1 四种菌株进行生长曲线的测定,显示在LB培养基中含有ABC-1基因菌株的生长量相较与对照菌株提高了170.81%。用蛋白胨和酵母提取物分别作为主要营养物质,生长量分别提高了 58.3%和61.1%。可以推测,ABC-1的存在可能更有利于菌株利用营养物质从而提高生长量。在菌株生长有机碳源筛选中,选取4种单糖:葡萄糖、果糖、半乳糖和阿拉伯糖,结果显示ABC-1可能并不以糖类作为转运底物。在有机氮源中筛选,选取了4种氨基酸:甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。结果显示ABC-1对赖氨酸和精氨酸有较高的亲和性,生长量相较与对照菌株分别提高了19.52%和38.66%。在探究ABC-1和几丁质酶可能的功能相关性,选用NAG作为筛选的营养物质进行培养,结果显示ABC-1对NAG有很高的亲和性,生长量相较与对照菌株提高了85.3%,表明NAG很有可能是ABC-1蛋白的运输底物之一,同时参考ABC-1和儿丁质酶的位置关系,ABC-1和几丁质酶具有功能相关的可能性进一步的提高。目前国内对于苏云金芽胞杆菌基因组中ABC基因进行的功能鉴定,尚未见报道。本研究对于ABC-1基因的功能定位以及分子模型的探究对于今后对Bt基因组中其它的ABC基因进行分析研究提供了参考,同时对通过改造ABC基因进而影响几丁质酶的表达的新思路的可行性提供了借鉴,对提高Bt杀虫活性有重大意义。

关键词： ABC转运蛋白苏云金芽胞杆菌 Gfp 底物筛选

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基于蛋白质组学技术的复杂体系酶促动力学研究

基于蛋白质组学技术的复杂体系酶促动力学研究

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第三届全国质谱分析学术报告会

作者：邓真真叶明亮中国科学院大连化学物理研究所中国科学院分离分析化学重点实验室

复杂体系酶促反应经常出现在各种生化分析过程中,比如酶底物的筛选、酶促标记以及蛋白质的酶解等。复杂体系中的酶底物不仅种类丰富,丰度的分布也在几个数量级以上,因此充分了解酶底物自身丰度与酶促反应速率之间的相互关系,有助于我们... 详细信息

复杂体系酶促反应经常出现在各种生化分析过程中,比如酶底物的筛选、酶促标记以及蛋白质的酶解等。复杂体系中的酶底物不仅种类丰富,丰度的分布也在几个数量级以上,因此充分了解酶底物自身丰度与酶促反应速率之间的相互关系,有助于我们更好地理解复杂体系中酶促反应的进行,从而进一步从结果中提取更有意义的酶促信息,比如酶与特定底物之间的特异性常数等。我们之前的工作己经从实验结果角度己经发现复杂体系中的酶解反应速率几乎与底物的丰度无关,但是并没有足够的理论支持。这次我们在原有的工作基础上[1-3],以经典米氏动力学方程为基础,构建复杂体系中酶促反应动力学模型,从理论以及实验角度来全面地对体系中底物的丰度与其相应酶促速率之间的关系进行研究。从得到的方程p=1-(1-p)(k)/(κ)/(k)/(k))(1)中可以看到,复杂体系中任意底物的消耗百分比不仅与自身动力学性质以及浓度相关,同样受到存在竞争关系的其他底物的影响。进一步对方程进行处理,我们得到方程ln(1-p)=((ln(1-p))/((k)/(K))((k)/(K)(2),将该方程应用到多底物体系可以得到:ln(1-p):ln(1-p):…:ln(1-p):…:ln(1-p)=(k)/(K):(k)/(K):…:(k)/(k):...:(k)/(K)(3),也就是说在一个确定的复杂体系当中,当酶促反应进行一定时间后,体系中各个底物剩余百分比的自然对数值与底物的催化效率常数之间存在线性关系,并且与底物的丰度无关。再进一步,当复杂体系中底物种类不变,但是底物之间相对丰度发生变化时,同样会存在:(ln(1-p):ln(1-p):…:ln(1-p):…:ln(1-p)=(k)/(K):(k)/(K):...:(k)/(K):...:(k)/(K)=(ln(1-p):ln(1-p):...:ln(1-p):...:ln(1-p)}(4)。完善理论模型之后,我们分别利用多条标准肽段构成的模拟复杂体系对方程(2)以及细胞裂解液构成的实际复杂体系对方程(4)的准确性进行考察(见图1及图2),并且得到相应线性关系,验证我们的理论模型的正确性。因此,从我们的理论推导和实验结果中都可以发现,对于一个存在多种底物且底物丰度分布多样的复杂酶促体系,任意底物的消耗速率会受到自身以及其他共存底物性质与浓度的影响,但是底物之间的消耗速率之比与其催化效率之间存在线性关系,与丰度无关,该发现有利于进行复杂体系酶促体系的深入研究。

关键词：生物质谱酶促反应底物筛选催化效率常数反应速率

来源： cnki会议评论

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