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药学学报 2023年第5期58卷 1372-1382页

作者：刘琦闫锐琪谢冰寒隋颂扬解可波戴均贵杨林中央民族大学生命与环境科学学院北京100081 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室中国医学科学院酶与天然药物生物催化重点实验室国家卫生健康委员会天然药物生物合成重点实验室北京100050

O-甲基转移酶(O-methyltransferases,OMTs)是许多天然产物生物合成途径中的关键后修饰酶之一,O-甲基化不仅可降低化合物的化学反应活性,而且能显著改善其溶解性、稳定性等理化性质和生物活性等。本研究根据紫金牛转录组测序结果,首次从... 详细信息

O-甲基转移酶(O-methyltransferases,OMTs)是许多天然产物生物合成途径中的关键后修饰酶之一,O-甲基化不仅可降低化合物的化学反应活性,而且能显著改善其溶解性、稳定性等理化性质和生物活性等。本研究根据紫金牛转录组测序结果,首次从紫金牛中克隆获得1条OMT基因(命名为AjOMT1),并成功进行了大肠杆菌异源表达,体外酶催化活性结果表明重组AjOMT1能高效催化槲皮素发生O-甲基化反应。底物谱考察结果表明,AjOMT1能催化黄酮类、茋类、香豆素类、生物碱类、苯丙素类等不同结构类型的化合物进行甲基化反应,具有非常宽泛的底物谱;AjOMT1偏好于具邻二酚羟基的化合物,并表现出位置选择性。本研究结果表明,AjOMT1可用作O-甲基化工具酶实现不同类型化合物的O-甲基化、获取多样化的活性甲基化产物,可为药物发现提供新方法,并可为天然产物合成生物学研究提供普适性元件。

关键词：紫金牛 O-甲基转移酶 O-甲基化底物杂泛性位置选择性

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非核糖体肽Skyllamycin B生物合成中Ⅰ型硫酯酶底物杂泛性的初步研究

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微生物学通报 2021年第7期48卷 2374-2388页

作者：宋娟于佳慧李安南关梦铁耿彤彤张中义杨东辉马明北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室北京100191

【背景】Skyllamycins是一类从链霉菌中发现的具有血小板生长因子抑制和生物膜抑制作用的非核糖体肽类,其环肽环合反应是由非核糖体肽合成酶中的硫酯酶功能域催化完成。【目的】克隆和表达Skyllamycin非核糖体肽合成酶最后一个模块中的... 详细信息

【背景】Skyllamycins是一类从链霉菌中发现的具有血小板生长因子抑制和生物膜抑制作用的非核糖体肽类,其环肽环合反应是由非核糖体肽合成酶中的硫酯酶功能域催化完成。【目的】克隆和表达Skyllamycin非核糖体肽合成酶最后一个模块中的硫酯酶(Skyxy-TE)基因,合成Skyxy-TE底物类似物,通过体外催化实验表征Skyxy-TE的底物杂泛性。【方法】采用Ligation Independent Cloning(LIC)方法,从一株含有Skyllamycin B生物合成基因簇的链霉菌Streptomycessp.PKU-MA01239中克隆和表达skyxy-TE,通过镍离子柱亲和层析纯化Skyxy-TE。运用固相多肽合成法合成2个底物类似物1和2,进行Skyxy-TE的体外催化实验。【结果】通过对Skyxy-TE的表达纯化,获得了纯度较好的可溶性蛋白;通过固相多肽合成,得到了能够模拟Skyllamycin B底物类似物的化合物1和2,硫酯酶蛋白体外催化化合物1和2得到了化合物3和4,化合物3和4通过核磁共振和高分辨质谱确认为环肽。【结论】Skyllamycin B生物合成中Skyxy-TE表现出一定的底物杂泛性,可以识别底物类似物催化环化反应,该研究为将来利用化学-酶联法制备更多环肽类似物提供了依据。

关键词：化学-酶联法 Skyllamycin 固相多肽合成法底物杂泛性硫酯酶

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木姜叶柯中根皮苷和三叶苷生物合成途径相关基因的鉴定及研究

木姜叶柯中根皮苷和三叶苷生物合成途径相关基因的鉴定及研究

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作者：孙术富安徽中医药大学

学位级别：硕士

木姜叶柯[Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun]为壳斗科柯属常绿乔木,主要分布在中国长江以南的山区,印度、泰国也有所分布,其嫩叶可被直接煎煮做成茶汤,长期服用有养生保健功效。木姜叶柯中主要成分为类黄酮和三萜类,根皮苷和三叶苷... 详细信息

木姜叶柯[Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun]为壳斗科柯属常绿乔木,主要分布在中国长江以南的山区,印度、泰国也有所分布,其嫩叶可被直接煎煮做成茶汤,长期服用有养生保健功效。木姜叶柯中主要成分为类黄酮和三萜类,根皮苷和三叶苷属于二氢查尔酮类化合物,是木姜叶柯中的主要的活性成分,具有降血糖、降血脂、抗炎和抗肿瘤的生物活性。除此以外,三叶苷还是一种健康的天然甜味剂,其甜度是蔗糖的300倍。但是天然生长的木姜叶柯植株分散,且树形高大,采摘叶片困难,费时费力,不利于有效成分的提取。随着合成生物学技术的发展,基于根皮苷和三叶苷生物合成途径中高效关键酶基因的发现,构建细胞工厂实现相关化合物的异源生产成为一种新的可持续的生产方式。目前,苹果中根皮苷和三叶苷生物合成途径已基本被阐明,多个可以催化根皮素糖苷化的糖基转移酶已经被鉴定,但多存在催化活性低、专一性弱的问题。所以进一步从植物中鉴定催化活性更高、专一性更强的糖基转移酶,是提高根皮苷和三叶苷生物合成产量的重要前提。木姜叶柯中根皮苷和三叶苷的含量丰富,然而目前该植物中尚未有参与根皮苷和三叶苷生物合成途径基因的报道。基于此,本课题对木姜叶柯进行了高通量全长转录组的测序。深入开展了木姜叶柯中根皮苷和三叶苷生物合成途径中关键酶基因的克隆和功能研究,以期发现能够高效催化根皮苷和三叶苷形成的关键酶。主要研究内容如下:1.木姜叶柯不同组织部位根皮苷和三叶苷的含量测定使用UPLC-Q-TOF-MS对木姜叶柯嫩叶、老叶、嫩茎、老茎、根及根茎混合物当中的根皮苷和三叶苷含量进行定量。实验结果表明,根皮苷在木姜叶柯不同组织部位的含量由高到低分别为老叶、嫩茎、根茎混合物、老茎、嫩叶和根,而三叶苷仅在叶中积累,且嫩叶中的积累量是老叶的两倍之多。木姜叶柯中根皮苷和三叶苷的积累为根皮苷和三叶苷合成途径基因的筛选提供了稳定可靠的实验材料,其积累规律为制定转录组测序策略提供了参考。2.木姜叶柯不同组织部位的转录组测序及基因注释结果基于化合物含量检测的结果,采用高通量测序技术对木姜叶柯的根、茎、老叶和嫩叶进行了转录组测序,原始数据经过组装、拼接、去冗余后,共得到34,215个Unigene。比对到NR、Swiss Prot、KEGG、KOG、GO、NT、Pfam等数据库中共注释得到33,669个基因。根据注释信息,从转录组中共筛选到3条PAL基因、15条4CL基因、35条DBR基因、2条CHS基因以及135条UGT基因参与根皮苷和三叶苷生物合成的关键酶基因,为后续基因的全长克隆提供了基础。3.双键还原酶的克隆及生物信息学分析从转录组中筛选到12条候选双键还原酶基因,分别命名为Ll DBR1～Ll DBR12。设计特异性扩增引物,通过PCR技术克隆到12条全长序列。构建p ET28a-HIS-MBP原核表达载体,进行测序分析后获得14条DBR基因序列,其中Ll DBR9测序获得了4条基因序列,Ll DBR11测序获得了2条基因序列。对14条序列进行了生物信息学分析,Ll DBR1～Ll DBR12的ORF区长度在1000～1070 bp之间,编码氨基酸数量在340～360之间。亚细胞定位显示,14个蛋白主要定位在细胞质。多序列比对分析结果表明,14个蛋白均具有保守的GXXS区域和甘氨酸富集区域(AXXGXXG或GXXGXXG)。系统发育树表明,14个蛋白均与已报道功能的蛋白聚在一起,且序列一致性较高。为后期基因的功能鉴定提供了理论依据。4.糖基转移酶的克隆、功能验证和生化特性分析从转录组中筛选到24条候选糖基转移酶基因,分别命名为Ll UGT1～Ll UGT24。设计特异性引物,利用PCR技术克隆得到了20条全长序列。构建p ET28a-HIS-MBP原核表达载体,最终得到21条候选UGT基因,其中Ll UGT9测序获得了3条基因序列。异源表达及体外酶促反应表明,Ll UGT4、Ll UGT7、Ll UGT8、Ll UGT9-1、Ll UGT9-2、Ll UGT9-3、Ll UGT15均能催化根皮素生成糖苷化产物。对这7个蛋白进行了相应的生物信息学分析,选择可以在体外高效催化根皮素生成根皮苷和三叶苷的Ll UGT8和Ll UGT9-3进行酶促反应动力学分析(载体更换为p ET28a)。结果表明,Ll UGT8最佳反应时间为8 h,最适温度在50℃,最佳p H值为8.8的NaCO-Na HCO缓冲体系。Ll UGT9-3最佳反应时间为8 h,最适温度为40℃,最佳p H值为8.8的NaCO-Na HCO缓冲体系。Ll UGT8的k值47.54μM,k为0.02 s,k·k为365.97 mol·s。Ll UGT9-3的k值79.92μM,k为0.04 s,k·k为441.06 mol·s。底物谱筛选结果表明,Ll UGT8以UDP-Glc为糖基供体,可以催化6种不同结构类型的黄酮类化合物发生

关键词：木姜叶柯根皮苷三叶苷转录组测序双键还原酶糖基转移酶酶学性质底物杂泛性

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依托泊苷糖苷配基糖基化途径的创建

依托泊苷糖苷配基糖基化途径的创建

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作者：高辉耀湖北工业大学

学位级别：硕士

4’-去甲基表鬼臼毒素（DMEP,4’-desmethylepipodophyllotoxin）的糖基化产物4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（GDMEP）是来自于药用植物桃儿七的一种天然产物,该化合物可直接用于合成拓扑异构酶抑制剂依托泊苷（几十种恶性肿瘤的抑制剂）。DME... 详细信息

4’-去甲基表鬼臼毒素（DMEP,4’-desmethylepipodophyllotoxin）的糖基化产物4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（GDMEP）是来自于药用植物桃儿七的一种天然产物,该化合物可直接用于合成拓扑异构酶抑制剂依托泊苷（几十种恶性肿瘤的抑制剂）。DMEP的生物合成途径已经完成,而用于生物合成GDMEP的酶目前仍不清楚。本文拟创建天然产物GDMEP的酶促合成反应。拟南芥植物利用UGT-糖基转移酶的杂泛性来代谢异物。在拟南芥基因组中共发现122个类似于UGT家族-1的序列。通过广泛观察这些UGT对羟基化底物的活性,发现其中的UGT72B1是最活跃的O-糖基转移酶,并表现出高度的底物杂泛性。分析DMEP的化学结构特征,通过异源表达UGT72B1,建立了DMEP糖基化酶促合成GDMEP的反应,通过LC-MS在反应体系中检测到微量的GDMEP。为了提高酶促合成GDMEP的转化率,采用基因组挖掘策略挖掘高效合成GDMEP的糖基转移酶。通过NCBI Protein Blast对拟南芥糖基转移酶的氨基酸序列进行同源性分析,构建系统发育树,从拟南芥糖基转移酶家族的8个发育分支各选择一种糖基转移酶作为代表并对它们催化DMEP合成GDMEP的功能进行分析。发现UGT78D2酶促催化体系相对于UGT72B1有更多的GDMEP生成（转化率39%）,而与UGT78D2分属于同一发育分支的UGT78D3（同源性达76%）则不具备催化DMEP糖基化合成GDMEP的能力。将UGT78D2分成5个肽段,依次替换为UGT78D3的相应肽段构建了5种UGT78D2-78D3嵌合体。通过嵌合体活性分析、同源氨基酸序列比对,初步筛选出19个可能决定DMEP糖基化功能的氨基酸残基。对这19个氨基酸残基进行丙氨酸扫描突变分析,发现其中12个氨基酸突变为丙氨酸后活性发生了明显的变化。将这12个氨基酸残基在UGT78D2的同源3D模型上定位,发现其中6个氨基酸残基位于主链螺旋上。通过构建系统发育树和同源酶序列比对对这6个氨基酸残基的保守和变异性进行分析,发现两个未知功能蛋白Cs UGT78D2和Cs UGT78D2-like与UGT78D2聚合形成一个独立的系统发育分支且含有UGT78D2中六个必需残基中的三个。体外功能鉴定发现Cs UGT78D2和Cs UGT78D2-like具有对底物4’-去甲基表鬼臼毒素更高的糖基化功能（转化率分别达到45%和53%）。综合以上研究,本文通过探索糖基转移酶的底物杂泛性创建了DMEP的O-糖基化高效合成依托泊苷前体GDMEP的酶促反应,为GDMEP生物合成途径的建立提供了理论基础和技术支持。糖基转移酶关键残基的鉴定将促进对新型底物的糖基转移酶生物催化剂的精确鉴定,并为糖基转移酶工程化提供了理论指导。

关键词：糖基转移酶底物杂泛性 O-糖基化依托泊苷糖苷配基

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