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海洋菌株Aeromonas ***-54来源几丁质酶的制备与性质研究

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食品工业科技 2024年第16期45卷 182-190页

作者：陈苏南冷凯良闫鸣艳李银平于源青岛科技大学海洋科学与生物工程学院山东青岛266042 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部极地渔业可持续利用重点实验室山东青岛266071

为实现甲壳类原料的高效降解与N-乙酰氨基寡糖的绿色制备,本研究以青岛近海土壤中筛选的菌株YS-54为材料,使用60%硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤层析制备几丁质酶;对几丁质酶的最适温度、最适pH、底物偏好性等性质进行表征;使用质... 详细信息

为实现甲壳类原料的高效降解与N-乙酰氨基寡糖的绿色制备,本研究以青岛近海土壤中筛选的菌株YS-54为材料,使用60%硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤层析制备几丁质酶;对几丁质酶的最适温度、最适pH、底物偏好性等性质进行表征;使用质谱技术确认了酶解产物的聚合度。结果表明,菌株YS-54为Aeromonas属,该菌株来源几丁质酶比活力为23.44 U/mg,分子量为63与75 kDa。几丁质酶在40℃和pH为5.0条件下具有良好的稳定性,Ba^(2+)、Co^(2+)、Mg^(2+)与TritonX-100显著促进了几丁质酶活力(P<0.05),而Fe^(3+)、Cu^(2+)、SDS对酶活力起抑制作用。几丁质酶对α-几丁质的比活力为7.99 U/mg,为水解胶体几丁质比活力的34.09%。几丁质酶对胶体几丁质与α-几丁质的酶解产物聚合度分别为1~4与1~3。Aeromonas ***-54来源几丁质酶在较宽的温度与pH范围内保持稳定,同时对α-几丁质具有良好的水解能力,可为甲壳类废弃物的高效综合利用提供技术支持。

关键词：几丁质酶酶学性质底物偏好性 N-乙酰氨基寡糖海洋菌株Aeromonas sp

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双歧杆菌源亚油酸异构酶的原核表达及功能分析

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食品与发酵工业 2023年第23期49卷 64-69页

作者：嵇熠彬梅永超杨波陈海琴江南大学食品学院江苏无锡214122

来源于短双歧杆菌CCFM683的亚油酸异构酶(Bifidobacterium breve isomerase,BBI)是目前唯一已知的乳酸菌源单酶转化亚油酸生成共轭亚油酸c9,t11-CLA单体的亚油酸异构酶。该文以pET-28a(+)为表达载体,构建组氨酸标签分别位于C端和N端的... 详细信息

来源于短双歧杆菌CCFM683的亚油酸异构酶(Bifidobacterium breve isomerase,BBI)是目前唯一已知的乳酸菌源单酶转化亚油酸生成共轭亚油酸c9,t11-CLA单体的亚油酸异构酶。该文以pET-28a(+)为表达载体,构建组氨酸标签分别位于C端和N端的重组载体pET-28a(+)-bbi-His和pET-28a(+)-His-bbi,分别实现其在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)3种类型的大肠杆菌(Escherichia coli)宿主中的异源表达和条件优化。结果表明表达BBI的最优重组菌为*** Rosetta/pET-28a(+)-bbi-His,最佳诱导条件为以1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导8 h,且当用BBI粗酶转化脂肪酸时,相较于亚油酸和γ-亚麻酸,BBI更偏好转化α-亚麻酸。

关键词：大肠杆菌亚油酸异构酶共轭脂肪酸条件优化底物偏好性

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嗜热菌PIF1解旋酶的生化活性研究

中国生物化学与分子生物学报 2021年第9期37卷 1220-1232页

作者：李丹李海红戴阳雪刘娜女侯锡苗奚绪光西北农林科技大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室陕西杨凌712100

小整合频率1(petite integration frequency 1,PIF1)解旋酶广泛存在于生物体内,在核酸的代谢过程中发挥着重要作用。近年来,人们已经报道了多种PIF1解旋酶的生化活性及三维结构,但对极端环境下细菌的PIF1解旋酶的报道仍较少。本文利用... 详细信息

小整合频率1(petite integration frequency 1,PIF1)解旋酶广泛存在于生物体内,在核酸的代谢过程中发挥着重要作用。近年来,人们已经报道了多种PIF1解旋酶的生化活性及三维结构,但对极端环境下细菌的PIF1解旋酶的报道仍较少。本文利用多种生物化学与生物物理学技术,对黄石热脱硫弧菌PIF1(***1)解旋酶进行了多方面研究。通过原核表达纯化系统,获得了纯度90%以上,均一性好的***1蛋白。***1在溶液中为单体,分子量约为60 kD。***1具有很高的热稳定性,在65℃以下时,二级结构保持稳定,大于70℃时,二级结构才会发生改变。***1在体外最适解旋温度为45℃,并非黄石热脱硫弧菌生存的最适温度,预示着***1在体内发挥活性时,可能需要其他辅助因子的参与。***1的酶活力温度范围较宽,在20~55℃均具有解旋活性,在55℃能解旋预示了***1具有耐热特性。***1偏向于同含有单链的底物结合,但对单链长度有一定要求,其长度至少大于4 nt;***1也会较好地结合无单链尾链的G4结构,说明***1可能有专门结合G4结构的区域。***1能解开一系列带有5′-单链尾链的类似于复制中间体的底物,且对底物结构有一定的偏好性;***1也可以解开含有G4结构的底物,DNA-RNA杂交链、RNA-loop结构,预示着***1在生物体内有着多种生物学功能。***1解旋带有不同长度5′-单链尾链的双链底物时,尾链长度越长,解旋速率越快,预示着***1可能与***1一样有着较低的解旋持续性。本文将***1的生化活性与其它物种的PIF1解旋酶进行了比较,找出了其中的共性与差异,加深了人们对嗜热菌PIF1解旋酶的认识,为今后研究其它极端环境微生物的PIF1解旋酶提供了一些思路。

关键词：小整合频率1解旋酶热稳定性结合活性解旋活性底物偏好性

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野猪DHX36解旋酶酶学特性及保守性分析

中国生物化学与分子生物学报 2022年第12期38卷 1681-1693页

作者：徐思颖郭海磊奚绪光西北农林科技大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室陕西杨凌712100

DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道... 详细信息

DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道。本文以哺乳动物野猪(Sus scrofa)DHX36解旋酶(SsDHX36)为研究对象,通过生物化学与生物物理研究技术系统研究了其酶学性质,并对比其与低等无脊椎动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)DHX36解旋酶(DmDHX36)的活性,探究DHX36在物种间的功能保守性。本研究通过原核表达系统,分离纯化得到了纯度大于95%的SsDHX36解旋酶;利用荧光偏振和快速停留技术得到SsDHX36的最佳酶学反应条件,发现SsDHX36对G4 DNA具有平行构型的亲和选择性,对富含鸟嘌呤的ssDNA具有结合和解旋的底物偏好性;结合单分子荧光共振能量转移技术对SsDHX36和DmDHX36进行活性比较,发现两者与G4 DNA结合的构型选择性和对富含鸟嘌呤DNA的底物偏好性是保守的。但两者对不同序列长度ssDNA的亲和性差异显著,SsDHX36受序列长度影响较大且亲和力随序列长度的增加而增强,而DmDHX36则完全相反。本文克隆纯化了SsDHX36解旋酶并研究了其酶学活性,着重分析了SsDHX36和DmDHX36的功能保守性,为理解DHX36的保守功能机制,探究基于DHX36与富含鸟嘌呤序列互作的免疫反应酶学活性基础和靶向药物设计提供了理论与实验基础。

关键词：野猪DHX36解旋酶 G-四链体酶学活性底物偏好性功能保守性

樟树长链脂肪酰CoA合成酶1鉴定与功能初步分析

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分子植物育种 2018年第16期16卷 5255-5264页

作者：汪信东江香梅章挺伍艳芳李江江西省林业科学院樟树研究所南昌330013

樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)籽油富含中链脂肪酸,但其生物合成机制尚未可知。长链脂肪酰基CoA合成酶(long chain fatty aycl-CoA synthetases,LACSs)亚家族在植物脂肪酸合成与分解代谢中具有重要作用。以樟树转录组数据为参考... 详细信息

樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)籽油富含中链脂肪酸,但其生物合成机制尚未可知。长链脂肪酰基CoA合成酶(long chain fatty aycl-CoA synthetases,LACSs)亚家族在植物脂肪酸合成与分解代谢中具有重要作用。以樟树转录组数据为参考、本研究克隆并鉴定了一个LACS基因亚家族成员,序列比对显示其编码氨基酸序列与拟南芥At LACS1序列相似性高达65%,故将之命名为Cc LACS1。实时荧光定量PCR检测显示Cc LACS1基因在花与种仁中优势表达,叶、茎组织中次之。缺陷型酵母互补实验证明Cc LACS1具有脂酰CoA合成酶活性,可广泛地将外源C10~C18脂肪酸活化为脂酰CoA硫酯,但C18类脂肪酸是其偏好催化底物。上述结果暗示Cc LACS1可能与樟树籽油合成与累积相关。

关键词：樟树长链脂肪酰基CoA合成酶1 组织表达特异性酵母互补检测底物偏好性

高山被孢霉Δ6Ⅱ-脱饱和酶的克隆、表达和功能鉴定

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中国生物工程杂志 2015年第12期35卷 37-44页

作者：史海粟陈海琴顾震南张灏陈永泉陈卫江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室无锡214122

产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对... 详细信息

产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对其中的Δ6-Ⅱ脱饱和酶进行克隆、表达和功能鉴定。首先以p YES2/NT C质粒为骨架构建了Δ6-Ⅱ脱饱和酶基因(FADS6-Ⅱ)的表达载体(p YES2/NT C-FADS6-Ⅱ),并转化至酿酒酵母中进行诱导表达,进一步通过在重组菌培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察Δ6-Ⅱ脱饱和酶对各底物的偏好作用。实验结果表明,在分别添加0.5 mmol/L亚油酸(LA)和0.5 mmol/Lα-亚麻酸(ALA)时,Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为42.94%,对ALA没有催化作用。而当底物添加方式改为同时添加LA和ALA时(分别为0.25 mmol/L),Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为37.12%,对ALA仍没有催化作用。该实验结果为高山被孢霉中Δ6-Ⅱ脱饱和酶的催化功能研究提供了理论依据。

关键词： Δ6脱饱和酶高山被孢霉底物偏好性

油菜脂酰CoA合成酶基因pXT166的鉴定和功能分析

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中国油料作物学报 2009年第3期31卷 274-278页

作者：朱福各谭小力崇保强周佳袁伟伟江苏大学生命科学研究院江苏镇江212013

长链脂酰CoA合成酶(LACSs)在脂肪酸的合成代谢与分解代谢中起着重要的作用,它把游离脂肪酸活化为脂酰CoA硫酯。pXT166经证实具有编码长链脂酰CoA合成酶活性。本研究通过酵母互补实验验证了pXT166具有LACS的酶活性。分析该基因编码蛋白... 详细信息

长链脂酰CoA合成酶(LACSs)在脂肪酸的合成代谢与分解代谢中起着重要的作用,它把游离脂肪酸活化为脂酰CoA硫酯。pXT166经证实具有编码长链脂酰CoA合成酶活性。本研究通过酵母互补实验验证了pXT166具有LACS的酶活性。分析该基因编码蛋白的底物偏好性显示,长链饱和脂肪酸是其优先底物。RT-PCR分析表明,在不同油脂含量的油菜品系种子中,授粉后35d,该基因在高含油量的种子中表达更强,表明pXT166参与了油菜种子中油脂的合成,与种籽含油量相关。

关键词：长链脂酰CoA合成酶 RT—PCR 酵母互补底物偏好性

金针菇寡肽转运蛋白编码基因fvopt1与fvopt2的鉴定与表达分析

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食用菌学报 2018年第4期25卷 17-23,137页

作者：韩星魏仲阳张晔琳黄蓉梅黄千慧谢宝贵福建农林大学园艺学院福建福州350002 福建农林大学菌物研究中心福建福州350002

基于金针菇(Flammulina velutipes)的基因组和转录组数据,通过本地BLAST方法,获得2个寡肽转运蛋白编码基因,命名为fvopt1和fvopt2,并对其结构、编码蛋白的基本性质、系统进化与表达模式进行分析。结果表明:fvopt1和fvopt2分别含有13和1... 详细信息

基于金针菇(Flammulina velutipes)的基因组和转录组数据,通过本地BLAST方法,获得2个寡肽转运蛋白编码基因,命名为fvopt1和fvopt2,并对其结构、编码蛋白的基本性质、系统进化与表达模式进行分析。结果表明:fvopt1和fvopt2分别含有13和18个外显子,编码蛋白FVOPT1与FVOPT2各含774和772个氨基酸,相对分子质量为86120.25与86192.24,等电点为7.46与7.92,且均无信号肽。保守结构域分析与系统进化分析结果表明,FVOPT1与FVOPT2为寡肽转运蛋白家族成员。实时荧光定量PCR结果表明:在菌丝阶段,fvopt1在无氮培养基中的表达量高于其在含氮培养基中的表达量;在含氮培养基中,fvopt1在整个子实体发育阶段(原基、菌柄和菌盖)中表达量上调,fvopt2只在原基中高表达,推测fvopt1和fvopt2可能与子实体和原基的发育有关。

关键词：氮源短肽底物偏好性 OPT家族信号肽

三角褐指藻LACS酶在脂肪酸代谢中功能的初步研究

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三角褐指藻LACS酶在脂肪酸代谢中功能的初步研究

作者：郝夏晖中国农业科学院

学位级别：硕士

近年来,长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)对于人类健康的重要性越来越受到重视。目前人类获取LC-PUFA的主要来源是深海鱼油,然而鱼油面临资源短缺和环境污染的风险,因此需要寻找新的替代来源。海洋微藻能从头合成LC-PUFA,是海洋LC-PUFA的初... 详细信息

近年来,长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)对于人类健康的重要性越来越受到重视。目前人类获取LC-PUFA的主要来源是深海鱼油,然而鱼油面临资源短缺和环境污染的风险,因此需要寻找新的替代来源。海洋微藻能从头合成LC-PUFA,是海洋LC-PUFA的初级生产者。海洋微藻LC-PUFA合成代谢途径的研究对于开发LC-PUFA的替代来源具有重要的意义。长链酰基辅酶A合成酶(LACS)在脂肪酸代谢中起关键作用。游离脂肪酸必须在LACS催化作用下活化成酰基辅酶A,才能进入后续脂肪酸的代谢途径,如碳链延长、甘油三酯合成、糖脂合成、磷脂合成、β氧化等。研究LACS在产油微藻脂肪酸代谢中的功能有助于全面解析LC-PUFA的合成途径。本论文以富含LC-PUFA的海洋微藻-三角褐指藻为对象,采用分子生物学和生化等方法研究五个长链酰基辅酶A合成酶(ptACSL1-5)的生化特性。主要研究结果如下:(1)采用逆转录PCR扩增ptACSL1-4编码基因,分别构建ptACSL1-4与GFP的融合表达质粒,转化三角褐指藻,通过观察GFP荧光确定其亚细胞定位。结果表明:ptACSL1、ptACSL2和ptACSL3定位于质体,ptACSL4定位于细胞质膜和细胞质,而ptACSL5已知定位于过氧化物酶体。进一步通过GFP自组装方法确定了ptACSL1在质体中的具体定位:ptACSL1蛋白N端跨膜区位于叶绿体内质网(chloroplast ER)膜上,而C端位于胞浆。(2)通过体外酶活实验研究了ptACSL1-5蛋白的底物特异性。分别构建ptACSL1-5蛋白C末端融合6×His标签的表达质粒并转化到大肠杆菌进行异源表达,使用亲和层析方法分别纯化得到对应ptACSL重组蛋白,在体外酶反应体系中以不同游离脂肪酸为底物采用NADH消耗法测定重组蛋白的酶活。结果表明:以C18:1为底物时,五个ptACSL蛋白都检测到较高的酶活(175.50-330.38 nmol/min/mg);分别以五种不同脂肪酸为底物时ptACSL1和ptACSL2都能检测到酶活;以C20:5为底物时,ptACSL1和ptACSL4的酶活相对其它底物高2个数量级,分别高达3135.05 nmol/min/mg和2388.8 nmol/min/mg。(3)采用Western blot方法研究了在缺氮培养和不同CO浓度(空气、1%、4%、10%)培养条件下ptACSL1-5蛋白的表达模式。缺氮72 h内,ptACSL1、ptACSL3和ptACSL4蛋白表达持续上调,而ptACSL2蛋白表达下调。随着CO浓度的提高,ptACSL1、ptACSL2和ptACSL4蛋白表达量降低;CO浓度从空气提高至4%时,ptACSL3表达量明显增加,CO浓度进一步增加至10%则抑制其表达。(4)采用CRISPR/Cas9技术分别构建ptACSL1-5基因敲除突变株。分别根据五个ptACSL基因序列各设计6个sgRNA,并构建相应CRISPR/Cas9质粒。以转化子基因组DNA为模板采用巢式PCR检测并对gRNA敲除位点区域进行测序。结果表明突变类型均为片段缺失,缺失片段大小为67-733bp,单基因突变率约为33-70%,每个ptACSL基因选取3-5个突变株用于后续分析。综上所述,本论文对三角褐指藻的五个ptACSL蛋白的亚细胞定位、底物特异性、表达模式进行了研究,并构建了ptACSL1-5基因敲除突变株,为后续阐明ptACSL1-5在脂肪酸代谢途径中的分子调控功能奠定了基础。

关键词：三角褐指藻长链酰基辅酶A合成酶底物偏好性亚细胞定位 CRISPR/Cas9