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库蠓核糖体DNA内转录间隔区1序列的测定与分析

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中国人兽共患病学报 2018年第12期34卷 1087-1094页

作者：岑常活韩晓静常琼琼段琛侯晓晖遵义医学院遵义563000

目的测定核糖体DNA内转录间隔区1(nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer 1,rDNA-ITS1)序列进行库蠓种类鉴别与系统发育分析,以探究rDNA-ITS1序列在库蠓分子鉴定和系统发育研究方面的适用性。方法采用DNA扩增、纯化、克隆... 详细信息

目的测定核糖体DNA内转录间隔区1(nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer 1,rDNA-ITS1)序列进行库蠓种类鉴别与系统发育分析,以探究rDNA-ITS1序列在库蠓分子鉴定和系统发育研究方面的适用性。方法采用DNA扩增、纯化、克隆及测序的方法获得荒川库蠓Culicoides arakawai、凹缘库蠓***、连斑库蠓***、印度库蠓***、霍飞库蠓***和肩宏库蠓***等6种库蠓的rDNA-ITS1序列,基于Kimura 2-parameter公式计算种内和种间遗传距离,应用MEGA 6.06软件分析DNA序列碱基组成并以环纹埃蠓Allohelea annulata为外群构建系统发育树(邻接法和最大似然法)。结果上述6种库蠓的rDNA-ITS1序列经过Clustal W比对及人工校对和编辑后的长度为352bp,其中T、C、A、G 4种碱基的含量分别为36.8%、13.0%、30.0%和20.1%,A+T的含量(66.8%)高于C+G的含量(33.1%);K-2p遗传距离在种内和种间具显著差异(t=32.430,P库蠓各自构成单系(群),同种类不同地理种群聚为一支,其与形态学鉴定结果一致。结论本研究证实了rDNA-ITS1序列可用于进行库蠓及其近似种的分子鉴定和系统发育分析。

关键词：库蠓近似种分子鉴定系统发育 rDNA-ITS1

1株分离自云南省师宗县库蠓的新型西藏环状病毒

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畜牧兽医学报 2021年第1期52卷 166-176页

作者：杨振兴谢佳芮李占鸿李卓然廖德芳牛保生姚萍芬李乐杨恒云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224 云南省师宗县动物疫病预防控制中心曲靖655700

西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)为环状病毒属的新成员,病毒于2009年首次从我国西藏墨脱县采集的圆斑按蚊中分离,目前,对该病毒的认识仍十分有限。本研究对1株分离自我国云南省师宗县库蠓的新型TIBOV毒株YNSZ/V290/2019进行了鉴定... 详细信息

西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)为环状病毒属的新成员,病毒于2009年首次从我国西藏墨脱县采集的圆斑按蚊中分离,目前,对该病毒的认识仍十分有限。本研究对1株分离自我国云南省师宗县库蠓的新型TIBOV毒株YNSZ/V290/2019进行了鉴定,结果表明,病毒可在C6/36与BHK-21细胞上引起明显的细胞病变,电镜下观察,病毒粒子呈球形,直径55~75 nm,具有环状病毒属病毒典型形态特征。电泳结果显示,病毒基因组为十节段双链RNA,呈现“3-3-3-1”的电泳带型特征。对环状病毒属病毒高度保守的基因节段及其编码蛋白(Seg-3/T2)的序列分析显示,YNSZ/V290/2019为TIBOV的成员,与其他TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为80.90%~81.70%与97.20%~97.30%。对决定环状病毒属病毒血清型的基因节段及其编码蛋白(Seg-2/OC1)的序列分析显示,YNSZ/V290/2019与已知TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为26.90%~30.60%与28.50%~33.20%,表明该毒株可能是一种新血清型的TIBOV。对采集于师宗县牧场的40份黄牛与68份山羊血清进行血清中和试验,结果显示,新型TIBOV在牛、羊的阳性率分别为22.50%与4.41%。新型TIOBV在我国的发现,丰富了我国虫媒病毒的研究,为深入研究我国TIBOV的分布、致病性、感染宿主范围与诊断试剂的开发提供了基础。

关键词：库蠓病毒分离鉴定西藏环状病毒序列分析

云南省墨江县库蠓中一株西藏环状病毒的分离及全基因组序列分析

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病毒学报 2022年第6期38卷 1419-1428页

作者：杨振兴孟锦昕何于雯李楠王静林云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)于2009年首次从中国西藏自治区采集的圆斑按蚊中分离出,目前在中国的云南省、广东省、湖南省和临国日本均有分离报道。2017年我们从云南省墨江县采集的库蠓样品中分离到一株病毒(MJC1-7),接种BHK-21... 详细信息

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)于2009年首次从中国西藏自治区采集的圆斑按蚊中分离出,目前在中国的云南省、广东省、湖南省和临国日本均有分离报道。2017年我们从云南省墨江县采集的库蠓样品中分离到一株病毒(MJC1-7),接种BHK-21和C6/36细胞后均可产生聚集、皱缩和脱落等明显细胞病变。1%的琼脂糖凝胶电泳显示,病毒基因组为十节段的双链RNA,呈现“3-3-3-1”的带型。通过病毒全长cDNA扩增和测序获取MJC1-7毒株的全基因组核苷酸序列,病毒基因组全长为19260 bp(包括编码区18495 bp和非编码区735 bp),由Seg-1(3950 bp)至Seg-10(832 bp)的10个基因节段构成,可编码6165个氨基酸残基。对环状病毒保守的VP1(Pol)、VP3(T2)和VP7(T13)蛋白氨基酸序列及系统发育分析显示,MJC1-7毒株与TIBOV亲缘关系最近,氨基酸序列相似度为95.4%~99.7%。对决定环状病毒血清型VP2(OC1)蛋白氨基酸序列与系统发育分析显示,MJC1-7与云南(SX-2017a、DH13C120和YN15-283-01)和广东(D181/2008)分离的TIBOV毒株聚为一簇,氨基酸序列相似度为97.3%~98.6%,而中国西藏毒株(XZ0906)和日本毒株(KSB-8/C/09和KSB-3/C/10)形成了另外3个独立的进化分支,MJC1-7与其相似度仅为27.8%~41.8%,以上结果表明MJC1-7毒株与云南和广东毒株有更近的亲缘关系,而中国西藏和日本毒株可能为Seg-2(OC1)基因变异较大毒株。本研究报道了一株TIBOV在我国云南省墨江县库蠓上的分离以及全基因组序列分析,研究结果进一步丰富了我们对TIBOV的认知,为深入研究我国TIBOV的分布、致病性与病原学检测技术提供了基础数据。

关键词：库蠓病毒分离西藏环状病毒序列分析

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广东省中山市库蠓形态与分子鉴定

中国人兽共患病学报 2019年第11期35卷 1021-1028页

作者：叶雅芳刘德星李婷婷邱德义刘环宇广东药科大学广州510006 中山海关技术中心中山528403

目的采用形态与分子的鉴定方法对在中山市不同生境采集的库蠓进行鉴定,明确中山市库蠓的种类。方法2018年4月至2019年3月在中山市采集库蠓样本,采用不损伤外部形态的方法提取基因组DNA,用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因和线粒体... 详细信息

目的采用形态与分子的鉴定方法对在中山市不同生境采集的库蠓进行鉴定,明确中山市库蠓的种类。方法2018年4月至2019年3月在中山市采集库蠓样本,采用不损伤外部形态的方法提取基因组DNA,用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因和线粒体DNA细胞色素b(Cytb)基因特异引物进行PCR扩增和序列测定,用DNAMAN V6和Mega 6.1软件进行构建N-J树。然后将库蠓虫体压片,在体视显微镜下进行形态学鉴定。结果共采集到的104只库蠓,鉴定结果为原野库蠓Culicoides homotomus、苏岛库蠓Culicoides sumatrae、异域库蠓Culicoides peregrinus、琉球库蠓Culicoides actoni、残肢库蠓Culicoides imicola、连斑库蠓Culicoides jacobsoni、抚须库蠓Culicoides palpifer、荒川库蠓Culicoides arakawai、环斑库蠓Culicoides circumscriptus、尖喙库蠓Culicoides oxystoma、霍飞库蠓Culicoides huffi、似同库蠓Culicoides similis等12种。在构建的COI和Cytb NJ树中,12个种均能各自聚为一支,且支持率均达99%,与形态学鉴定结果一致。结论雄性库蠓可根据其尾器进行有效鉴定,分子鉴定为形态鉴定的有效补充。联合形态和分子的鉴定方法可进行库蠓种类的准确鉴定。

关键词：库蠓 COI Cytb 形态与分子鉴定

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荒川库蠓雌雄成虫形态和超微结构

昆虫学报 2018年第4期61卷 498-504页

作者：蒋晓红常琼琼侯晓晖遵义医学院细胞生物学教研室贵州遵义563000

【目的】为了更加准确地进行蠓科(Ceratopogonidae)昆虫的分类鉴定,获得更全面、细致的荒川库蠓Culicoides arakawai(Arakawa)雌雄成虫形态和超微结构特征。【方法】利用扫描电子显微镜对荒川库蠓雌雄成虫形态和超微结构特征进行观察研... 详细信息

【目的】为了更加准确地进行蠓科(Ceratopogonidae)昆虫的分类鉴定,获得更全面、细致的荒川库蠓Culicoides arakawai(Arakawa)雌雄成虫形态和超微结构特征。【方法】利用扫描电子显微镜对荒川库蠓雌雄成虫形态和超微结构特征进行观察研究。【结果】获得荒川库蠓雌雄成虫复眼、触角、口器、翅、盾板、足和生殖器等性状特征扫描电镜图共计31幅,其中包括精确的体躯量度值,如雌虫触角鞭节各节长度比值为4.80∶3.22∶3.56∶3.54∶3.44∶3.56∶3.56∶3.86∶7.32∶6.96∶7.02∶7.40∶9.78,雌虫触须各节长度比值为2.90∶7.47∶8.07∶2.58∶3.92;雌雄虫翅大小分别为1.34~1.36 mm×0.56~0.66 mm和1.22~1.32 mm×0.40~0.48 mm;受精囊大小为71.87μm×48.07μm。观察到已知特征未被描述的细节,如雌虫小颚齿19枚,分两排排列,雄虫小颚具12~13枚细长小颚齿;雌虫小盾片梯形,具4根粗鬃和6~8根细鬃;雌虫后足距的表面具排列成扇状细毛;雌虫爪端部分叉,爪间突具4对毛状分支;雌虫受精囊表面具刻点,基孔与受精囊宽度比值约为1/9;雄虫尾叶内表面具微毛和大毛及特殊结构。发现新特征——爪毛。通过对比发现荒川库蠓性二型现象明显,如雌雄成虫在触角形态、触角感器的类型及其分布、大颚和小颚的形态及齿的数量和形状、舌的形态及翅形等性状特点上均存在明显差异。【结论】本研究为荒川库蠓的准确鉴定及蠓科昆虫分类学和系统学研究提供参考依据,并具有重要的经济学及医学意义。

关键词：荒川库蠓吸血蠓库蠓成虫形态超微结构扫描电子显微镜

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新疆库蠓源性盖塔病毒的分离与鉴定

畜牧兽医学报 2017年第10期48卷 1998-2004页

作者：刘帅加帕尔.哈斯木薛新梅丁梦玥马晓菁叶锋马俊杰易新萍谷文喜钟旗新疆畜牧科学院兽医研究所乌鲁木齐830000 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 新疆尉犁县畜牧兽医工作站尉犁841500 新疆巴音郭楞蒙古自治州动物疾病控制与诊断中心库尔勒841000

为了解新疆尉犁县库蠓体内携带病毒情况,从该县采集18 000只库蠓,50只为一组研磨后分别接种于BHK-21、C6/36、Vero细胞,盲传5代,一组样品使BHK-21出现CPE,先用5-氟尿核苷药敏试验鉴定为RNA病毒,之后用虫媒RNA病毒引物扩增,鉴定为甲病毒... 详细信息

为了解新疆尉犁县库蠓体内携带病毒情况,从该县采集18 000只库蠓,50只为一组研磨后分别接种于BHK-21、C6/36、Vero细胞,盲传5代,一组样品使BHK-21出现CPE,先用5-氟尿核苷药敏试验鉴定为RNA病毒,之后用虫媒RNA病毒引物扩增,鉴定为甲病毒,疑似盖塔病毒,最后用中和试验、免疫电镜观察和盖塔病毒C基因特异性引物PCR等方法鉴定分离毒株为盖塔病毒。本研究首次从新疆库蠓体内分离到盖塔病毒,该毒株与2005年日本分离株相似性高达98%,推测可能是由于引进日本带病种公畜或精液有关,提示在进出口畜牧贸易活动中,应加强盖塔病毒的检疫工作。

关键词：新疆库蠓盖塔病毒鉴定

我国东北九种库蠓蛹的形态记述(双翅目:蠓科)

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昆虫学报 1989年第2期32卷 235-241页

作者：刘国平沈阳军区后勤部军事医学研究所

库蠓属(Culidoices Latreille)幼期形态的矿究早已为国外学者所注意,自Goetghebuer(1919)描述了Culicoides pulicaris幼虫以来已有70余种库蠓幼期形态研究的报道。国内裘明华、荣云龙(1981)对同体库蠓(Culicoides homotmus)的幼期形态... 详细信息

库蠓属(Culidoices Latreille)幼期形态的矿究早已为国外学者所注意,自Goetghebuer(1919)描述了Culicoides pulicaris幼虫以来已有70余种库蠓幼期形态研究的报道。国内裘明华、荣云龙(1981)对同体库蠓(Culicoides homotmus)的幼期形态作了详细描述。这些研究大大丰富了库蠓幼期的生物学。

关键词：库蠓蛹形态

完达山林区库蠓组成及其空间分布(双翅目:蠓科)

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军事医学 1989年第2期13卷 114-117页

作者：虞以新邹民吉高永刚安继尧刘国平徐政府军事医学科学院微生物流行病研究所沈阳军区军事医学研究所

我们于1982～1983年在黑龙江省虎林、饶河两县接壤处的完达山林区采获库蠓27种,其中有新种2种,国内新记录4种.应用紫外线灯和以兔、鸡为饵动物的方法,在林缘地区由地面至11m高度的诱集,进行了空间分布结构的观察.结果证明,不显库蠓和刺... 详细信息

我们于1982～1983年在黑龙江省虎林、饶河两县接壤处的完达山林区采获库蠓27种,其中有新种2种,国内新记录4种.应用紫外线灯和以兔、鸡为饵动物的方法,在林缘地区由地面至11m高度的诱集,进行了空间分布结构的观察.结果证明,不显库蠓和刺螫库蠓是当地任何生境和各种场所的优势吸血蠓种,其吸血活动主要在2m以下近地层,飞舞活动可达11m以上空间.边缘库蠓和环斑库蠓则多见于5m以上空间.这些结果反映了该林区库蠓空间分布的特点.

关键词：库蠓不显库蠓刺螫库蠓空间分布

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库蠓吸血习性分析及其小鼠过敏模型构建研究

库蠓吸血习性分析及其小鼠过敏模型构建研究

作者：卢雪遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:通过对库蠓种类进行鉴别,并对其腹部血粉进行PCR鉴定,判断库蠓胃血来源,分析不同种类库蠓吸血偏好,了解其吸血习性,确定库蠓可能的取食范围及病原体传播的物种类群,为库蠓防治工作提供参考依据。利用库蠓提取物,构建库蠓-小鼠过敏... 详细信息

目的:通过对库蠓种类进行鉴别,并对其腹部血粉进行PCR鉴定,判断库蠓胃血来源,分析不同种类库蠓吸血偏好,了解其吸血习性,确定库蠓可能的取食范围及病原体传播的物种类群,为库蠓防治工作提供参考依据。利用库蠓提取物,构建库蠓-小鼠过敏模型,研究库蠓提取物致敏小鼠免疫反应模式,为进一步深入研究库蠓叮咬过敏及其他过敏疾病机制提供模型工具,同时为吸血昆虫叮咬过敏治疗药物的筛选及开发提供基础。方法:1.利用灯诱法采集重庆綦江地区不同生境库蠓,对库蠓进行形态学分类鉴定,通过分子鉴定及发育树构建对形态学鉴定结果进行复核,分析不同生境库蠓分布。2.利用物种COⅠ基因序列,设计物种特异性引物,提取库蠓腹部血粉DNA,利用特异性引物进行PCR,根据扩增结果,判定宿主物种。3.利用库蠓提取物两步法致敏6周小鼠:在第0、7、14、21天用库蠓提取物加明矾佐剂对小鼠进行腹腔注射（IP）致敏,在第28、31和35天进行库蠓提取物皮内注射（ID）致敏,对照组则在相同条件下用PBS注射。4.对致敏后小鼠进行行为学观察,及库蠓提取物致敏部位进行形态学检测;利用ELISA每14天测定特异性抗体Ig E及Ig G亚类的表达情况;在致敏42天后,提取小鼠脾细胞,利用MTT法测定库蠓提取物对小鼠脾细胞增殖的影响,同时通过q PCR检测库蠓提取物处理后小鼠脾细胞细胞因子表达情况。结果:1.重庆地区4种不同圈舍（猪舍、羊舍、鸡舍及鸡鸭混合舍）采集到7种主要库蠓类群,扩增获得7种库蠓COⅠ基因,经测序及序列比对,库蠓种类匹配成功,以COⅠ基因序列对7种库蠓构建NJ分子树和ML分子树。分子鉴定结果均与形态学鉴定结果一致,各种类库蠓分别形成一个单支,无种类交叉情况。2.不同畜舍所分布的库蠓种群有所不同,羊舍、鸡舍和鸡鸭混合舍的优势种均为荒川库蠓***,分别占捕获总数的75.26%、93.36%和94.96%;而猪舍的优势种则为洋岛库蠓***,占捕获总数70.77%。通过随机抽样,对6种主要库蠓的190份饱血库蠓胃血进行PCR检测,结果显示6种库蠓类群都存在兼性吸血的现象,可以4～6种动物的血液为食,其中荒川库蠓***、洋岛库蠓***、琉球库蠓***和陵水库蠓***均吸食鸡血,洋岛库蠓***还喜食羊血和猪血,尖喙库蠓***和刺螫库蠓***则偏好吸食猪血和羊血,此外琉球库蠓***和荒川库蠓***兼吸食人血,两者吸食人血比例分别为56.52%和1.39%。3.制备库蠓提取物,通过腹腔注射（IP）及皮内注射（ID）库蠓提取物两步法构建库蠓-小鼠过敏模型,致敏组小鼠在库蠓提取物致敏后,对致敏部位抓挠行为较对照组明显（P＜0.001）,且致敏部位皮肤出现组织水肿及淋巴细胞浸润情况。此外,致敏组小鼠血清中Ig E（P＜0.05）及Ig G1（P＜0.05）抗体水平较对照组小鼠显著升高;而在体外利用库蠓提取物刺激引起致敏小鼠脾细胞显著增殖（P＜0.001）,诱导2型辅助T淋巴细胞（Th2）免疫反应所产生的细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13 m RNA表达较对照组显著上调（P＜0.05）。综上成功构建出库蠓-小鼠过敏模型。结论:1.初步明确重庆地区6种库蠓类群的取食偏好,6种库蠓均为兼性吸血,具有吸血多样性的特点,同时不同种群库蠓具有不同的吸血习性。2.利用库蠓提取物,通过两步致敏法成功构建库蠓-小鼠过敏模型,这为进一步深入研究库蠓叮咬过敏及其他过敏疾病机制提供模型工具,同时为吸血昆虫叮咬过敏治疗药物的筛选及开发提供基础。

关键词：库蠓分子鉴定吸血习性致敏小鼠模型