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朱砂叶螨HSP90基因克隆及原核表达

昆虫学报 2009年第8期52卷 845-851页

作者：冯宏祖刘映红何林李明卢文才薛传华西南大学植物保护学院重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室重庆400716 塔里木大学植物科学学院新疆阿拉尔843300

采用RT-PCR及RACE技术克隆朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus的热激蛋白90(HSP90)基因,并进行序列分析,得到一条长2595bp的cDNA序列,该序列开放阅读框(open reading frame,ORF)为2169bp,编码722个氨基酸,分子量约为83.45kDa,理论等电点为4.81,3′非编码区(untranslated region,UTR)为249bp,5′UTR为177bp。通过Antheprot分析发现5个HSP90家族的签名序列及胞质HSP90特征序列MEEVD。同源性分析表明,朱砂叶螨HSP90编码区核苷酸序列和其他已知的HSP90,尤其是节肢动物昆虫的HSP90,具有很高的相似性。将鉴定正确的原核重组表达质粒pET43a-TcHSP90,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(origami)进行原核表达,应用SDS-PAGE和Western blotting技术分离并检测融合蛋白,结果表明构建的原核表达质粒可以在宿主菌中稳定、正确表达。朱砂叶螨TcHSP90基因的克隆、原核表达,为进一步研究HSP90的性质和功能的研究提供有用的实验材料。

关键词：朱砂叶螨热激蛋白90 基因克隆序列同源性分析原核表达

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昆虫质多角体病毒研究的若干新进展

昆虫学报 2002年第6期45卷 815-821页

作者：洪靖君彭辉银段家龙中国科学院武汉病毒研究所病毒室武汉430071 安徽农业大学蚕业丝绸系合肥230036

质多角体病毒隶属呼肠孤病毒科质多角体病毒属 ,病毒粒子为二十面体球形颗粒 ,具有 3～ 5种结构蛋白 ,基因组由10或 11个节段双链RNA构成。按病毒基因组RNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异 ,将质多角体病毒分为 15个电泳... 详细信息

质多角体病毒隶属呼肠孤病毒科质多角体病毒属 ,病毒粒子为二十面体球形颗粒 ,具有 3～ 5种结构蛋白 ,基因组由10或 11个节段双链RNA构成。按病毒基因组RNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异 ,将质多角体病毒分为 15个电泳型。随着RNA病毒序列测定策略的逐步成熟与完善 ,质多角体病毒的序列测定方面取得一定的进展 ,家蚕质多角体病毒 1的两个毒株 (H株和I株 ) ,舞毒蛾质多角体病毒 1和 14 ,及粉纹夜蛾质多角体病毒 15的基因组全序列得到了测定 ,但质多角体病毒的进化与起源的研究因缺乏足够的遗传信息仍受到限制。

关键词：昆虫质多角体病毒双链RNA 电泳型序列同源性分析研究进展

鼠伤寒沙门氏菌purB受purR调控的实验证据

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科学通报 2001年第2期46卷 145-149页

作者：张海宁黄谊秦浚川王敖全南京大学生物化学系国家医药生物技术重点实验室南京210093 中国科学院微生物研究所遗传室北京100080

通过遗传图和序列同源性分析获得了鼠伤寒沙门氏菌purB核苷酸序列. 为揭示鼠伤寒沙门氏菌purB是否受purR调控, 对purB基因的PUR box进行了功能分析. PCR扩增野生型PUR box和其第14位保守碱基发生突变(C→T)的DNA片段, 分别与从鼠伤寒沙... 详细信息

通过遗传图和序列同源性分析获得了鼠伤寒沙门氏菌purB核苷酸序列. 为揭示鼠伤寒沙门氏菌purB是否受purR调控, 对purB基因的PUR box进行了功能分析. PCR扩增野生型PUR box和其第14位保守碱基发生突变(C→T)的DNA片段, 分别与从鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株LT2提取的PurR粗制品进行了凝胶阻滞实验. 结果表明, purB基因的PUR box与PurR阻遏蛋白有很好的结合能力, 而突变的PUR box则不能与PurR阻遏蛋白结合. 可见, 野生型鼠伤寒沙门氏菌purB与嘌呤从头合成途径中其他结构基因一样是受purR基因协同调控的. 此外还对不受调控的实验现象的机制做了研究. 结果表明purB组成型表达是purB∷MudJ基因融合发生在PUR box上游(-554 bp)的结果. 这一结果还为鼠伤寒沙门氏菌purB基因与其上游ycfC基因属于同一个操纵子提供了有力的证据.

关键词：鼠伤寒沙门氏菌 PURB 序列同源性分析 PURBOX PU

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彩色马蹄莲病毒的分子检测和鉴定

彩色马蹄莲病毒的分子检测和鉴定

作者：马书智甘肃农业大学

学位级别：硕士

彩色马蹄莲(Calla lily,***)是世界驰名的切花,广泛分布于世界各地。近几年来,随着我国彩色马蹄莲栽培规模不断扩大和从国外大量引种,导致彩色马蹄莲遭受病毒侵染和衰退的现象越来越严重。然而,目前在国内关于彩色马蹄莲病毒病的报道很... 详细信息

彩色马蹄莲(Calla lily,***)是世界驰名的切花,广泛分布于世界各地。近几年来,随着我国彩色马蹄莲栽培规模不断扩大和从国外大量引种,导致彩色马蹄莲遭受病毒侵染和衰退的现象越来越严重。然而,目前在国内关于彩色马蹄莲病毒病的报道很少,因此对其进行研究,以及建立一套快速、准确的彩色马蹄莲病毒检测技术,对搞清彩色马蹄莲病毒病害的组培脱毒、有效防治、种苗检疫以及增加出口创汇将具有很重要的现实意义。本研究运用生物学和分子生物学的方法对侵染甘肃省部分地区彩色马蹄莲的植物病毒进行了系统研究。研究的主要内容包括调查了解彩色马蹄莲病毒病的发生和侵染情况、通过电镜观察海芋嵌纹病毒(ZaMV)的粒子形态及内含体的有无和形态、植物总RNA的提取及RT-PCR检测体系的建立、外壳蛋白基因的克隆和同源性分析。结果表明ZaMV是在自然环境下侵染甘肃省彩色马蹄莲的主要病毒,它属于马铃薯Y病毒属。田间调查发现甘肃省彩色马蹄莲普遍受到病毒侵染,在嘉峪关市温室种植区发病最为严重,发病率高达80.9%,而在榆中县和临洮县发病率相对较低,分别为28.1%和27.5%,而且彩色马蹄莲病毒病症状相当复杂,主要有花叶、斑驳、畸形等。寄主反应试验表明:侵染彩色马蹄莲的植物病毒的寄主范围很窄,主要侵染天南星科植物,所以难以通过寄主反应对它们进行鉴定。电镜检测结果表明:在38个样品中有20个样品被线状病毒侵染,侵染率达52.6%;组织病理学观察结果显示:在20个被线状病毒侵染的样品中有12个样品检测到风轮状内含体,表明受到马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒成员的侵染,侵染率达60%。通过提取感病彩色马蹄莲叶片组织中的总RNA,并设计特异性引物进行RT-PCR扩增,然后进行基因克隆,获得ZaMV病毒衣壳蛋白(CP)的基因序列。结果显示ZaMV的克隆片断全长为833bp,其中CP基因由579bp的组成,另外有254bp组成的3'-末端非编码区。对ZaMV同马铃薯Y病毒属一些种和已知的ZaMV进行同源性比较和进化树分析表明,ZaMV的CP序列和马铃薯的Y病毒属成员之间核苷酸有56.0%～62.4%的同源性,氨基酸有51.8%～62.1%之间的同源性。而且同源性分析的结果也显示ZaMV与李痘病毒(PPV)和芜菁花叶病毒(TuMV)属于同族,而与ZaMV和芋花叶病毒(DsMV)这两种能同时侵染天南星科植物的病毒在并不表现出亲缘关系,几乎没有同源性,这些结果和已经报道的结果相一致。ZaMV和国内外已经报道的ZaMV相比,有93%以上的

关键词：彩色马蹄莲海芋嵌纹病毒电子显微技术 RT-PCR检测体系基因克隆序列同源性分析

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基于蛋白质组学的鱼类过敏原检测方法研究

基于蛋白质组学的鱼类过敏原检测方法研究

作者：张晶宇大连海洋大学

学位级别：硕士

鱼类中富含丰富的蛋白质,其中蕴含着多种已知和未知的过敏原。这些过敏原蛋白质对消化酶常常具有抵抗作用,研究鱼类蛋白质在体外模拟胃液消化中的稳定性对预测蛋白是否具有致敏性具有重要的参考价值。本文通过体外模拟胃液消化得到牙鲆... 详细信息

鱼类中富含丰富的蛋白质,其中蕴含着多种已知和未知的过敏原。这些过敏原蛋白质对消化酶常常具有抵抗作用,研究鱼类蛋白质在体外模拟胃液消化中的稳定性对预测蛋白是否具有致敏性具有重要的参考价值。本文通过体外模拟胃液消化得到牙鲆鱼和大黄鱼蛋白质酶解液,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、介孔材料分离富集两种鱼蛋白酶解液中耐消化的蛋白质。结合蛋白质组学及蛋白质序列同源性的分析方法,研究了牙鲆鱼和大黄鱼酶解液中含有的潜在过敏原,为食物中潜在过敏原的筛选提供参考。研究结果如下:(1)将提取的牙鲆鱼、大黄鱼蛋白质进行体外模拟胃液消化。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离耐胃蛋白酶酶解的蛋白质,运用蛋白质组学的方法和高效液相色谱-串联质谱联用(HPLC-MS/MS)技术对蛋白质进行分析。在牙鲆鱼中共鉴定到5种耐胃蛋白酶酶解的蛋白质,大黄鱼中共鉴定到7种耐胃蛋白酶酶解的蛋白质。其中来源于牙鲆鱼的原肌球蛋白alpha-1以及来源于大黄鱼的原肌球蛋白alpha-1和alpha-4分别与已知过敏原Ore m 4的蛋白质序列进行对比,三组蛋白质的一致性分别为96.5%、81%和78%。相似性分别为97.9%、82%和89%。三组蛋白序列的相似性较高,说明牙鲆鱼的原肌球蛋白alpha-1、大黄鱼的原肌球蛋白alpha-1和alpha-4这三种蛋白是潜在的过敏原。牙鲆鱼的肌酸激酶1和大黄鱼的肌酸激酶M分别与已知过敏原Pen m 2序列进行对比,其一致性分别为42%和45%,相似性均为63%。牙鲆鱼的甘油醛-3-磷酸脱氢酶与已知过敏原Tri a 34序列对比的一致性和相似性分别为72%和83%。这三组序列也存在一定的相似性,说明牙鲆鱼的肌酸激酶1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和大黄鱼的肌酸激酶M这三种蛋白质也具有潜在过敏原的可能。(2)制备了SBA-15和MCM-41两种介孔材料,并对二者的外表面进行烷基二醇基修饰。采用中孔孔径分布测试、傅里叶红外光谱对介孔材料进行结构表征。结果表明四种介孔材料具有较大的比表面积、孔径和孔容。烷基二醇基均成功嫁接于介孔材料SBA-15和MCM-41的骨架上。考察了牙鲆鱼和大黄鱼酶解液的pH和浓度对四种介孔材料吸附性能的影响。发现四种介孔材料的吸附量在一定浓度范围内随着酶解液浓度的增大而增大,当pH在5.5～7范围内四种介孔材料的吸附性能较好。(3)采用超滤法和介孔材料吸附法对牙鲆鱼和大黄鱼体外模拟胃液消化液中分子量较大的且耐胃蛋白酶酶解的蛋白质进行分离。再利用蛋白质组学的方法通过LC-MS/MS对耐酶解蛋白质进行分析鉴定。超滤法和介孔材料吸附法对酶解液中潜在的过敏原均可起到有效分离的作用。通过超滤法在牙鲆鱼的截留液中共鉴定到15种蛋白质。和已知过敏原序列比对发现,其中含有5种潜在的过敏原。大黄鱼截留液中共鉴定到38种蛋白质,其中含有5种潜在的过敏原。通过Alkyl-diol-SBA-15吸附牙鲆鱼和大黄鱼酶解液,牙鲆鱼中共鉴定到2种蛋白质,其中包含1种潜在的过敏原;大黄鱼中共鉴定到6种蛋白质,其中包含两种过敏原。介孔材料吸附法虽然较超滤法鉴定到的蛋白数目少,但介孔材料对潜在过敏蛋白质选择性较高,但介孔材料分离潜在过敏原的通量需进一步提高。

关键词：鱼类过敏原蛋白质组学介孔材料液相色谱-串联质谱法序列同源性分析

反相液相色谱-串联质谱法筛选牙鲆鱼蛋白质中潜在的过敏原

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食品安全质量检测学报 2019年第7期10卷 1797-1803页

作者：张晶宇翟子扬顾盼赵前程祁艳霞大连海洋大学食品科学与工程学院辽宁省水产品分析检验及加工技术科技服务中心大连116023

目的建立反相液相色谱-串联质谱法(reversed phase liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, RPLC-MS/MS)筛选牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)中潜在过敏原。方法采用RPLC-MS/MS技术对牙鲆鱼的蛋白质样品进行蛋白质组学分析。再将牙鲆鱼蛋白质样品在体外模拟胃液中消化,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳观察不同酶解时间下鱼蛋白的酶解情况,将耐酶解的蛋白通过胶内酶解处理后采用RPLC-MS/MS法进行分析。最后将鉴定到的蛋白质与已知过敏原进行序列同源性分析。结果在SDS-PAGE中酶解时间为3 h时位于40 kDa处的条带仍清晰可见,此处的蛋白为耐酶解的蛋白质,经胶内酶解后共鉴定到5种蛋白质。与已知过敏原蛋白进行蛋白序列同源性分析,牙鲆鱼的原肌球蛋白alpha-1与已知过敏原Ore m4的序列相似度较高。2种蛋白质的一致性和相似性分别为96.5%和97.9%。甘油醛-3-磷酸脱氢酶与已知过敏原Tri a 34序列对比一致性和相似性分别为72%和83%。肌酸激酶1与已知过敏原Penm2序列对比的一致性和相似性分别为42%和63%,2组序列相似度大于35%,说明也具有相似性。结论耐胃蛋白酶酶解的大部分蛋白质是潜在的过敏原,其序列与其他物种已知的蛋白过敏原高度相似。该方法可作为筛选食物中潜在过敏原的一种新方法。

关键词：牙鲆鱼过敏原液相色谱-串联质谱法序列同源性分析

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睫状神经营养因子的研究进展

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