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预防性丙型肝炎病毒疫苗研究新策略

病毒学报 2020年第2期36卷 336-342页

作者：金坤张健胡雅彬赵品刘文培瞿小旺南华大学附属郴州医院转化医学研究所郴州423000

全球有超过7 000万名丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)慢性感染患者,给社会带来严重的公共卫生安全问题。直接抗病毒药物(Direct antiviral drugs,DAA)能够有效地治愈慢性丙型肝炎病毒感染,但治愈后患者仍存在再感染的可能,预防性疫... 详细信息

全球有超过7 000万名丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)慢性感染患者,给社会带来严重的公共卫生安全问题。直接抗病毒药物(Direct antiviral drugs,DAA)能够有效地治愈慢性丙型肝炎病毒感染,但治愈后患者仍存在再感染的可能,预防性疫苗(Prophylactic vaccine)是彻底切断HCV传播的最有效途径。目前HCV预防性疫苗的研发已取得一定进展,能够诱导极少数受试者产生广谱中和抗体(Broadly neutralizing antibodies),如何在绝大多数个体中诱导保护性广谱中和抗体则是当前HCV预防性疫苗研究所面临的最大挑战。本文总结了当前疫苗免疫学的研究进展:包括抗原特异的B细胞前体(Precursor B cell)、滤泡辅助性T细胞(Follicular T helper cell,Tfh)、滤泡调节性T细胞(Follicular T regulatory cell,Tfr)、抗体重链基因1-69(VH1-69)编码抗体成熟特点;基于胚系靶向(Germline-targeting)的免疫原设计与序贯免疫策略(Sequential immunization)等,期望能为HCV疫苗研究提供新的思路。

关键词：广谱中和抗体 E1/E2蛋白滤泡辅助性T细胞滤泡调节性T细胞抗原特异的B细胞前体序贯免疫抗体重链基因VH1-69

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抗新型冠状病毒中和抗体研究现状及展望

中国科学基金 2022年第4期36卷 624-629页

作者：鞠斌周兵张政深圳市第三人民医院肝病研究所南方科技大学第二附属医院

中和抗体是一种卓越的抗病毒“特效药”,在对抗新型冠状病毒肺炎疫情中被寄予厚望，然而新冠病毒变异株不断出现，完全或者部分逃逸了中和抗体，显著降低了中和抗体的抗病毒作用。本文综述了当前新冠中和抗体的研发现状，重点阐明了这... 详细信息

中和抗体是一种卓越的抗病毒“特效药”,在对抗新型冠状病毒肺炎疫情中被寄予厚望，然而新冠病毒变异株不断出现，完全或者部分逃逸了中和抗体，显著降低了中和抗体的抗病毒作用。本文综述了当前新冠中和抗体的研发现状，重点阐明了这些抗体的作用靶点、机制以及分类特征等；并在新冠病毒变异株全球大流行的背景下，探讨中和抗体面临的严峻挑战和未来可能的发展方向，旨在为研发更加广谱中和抗体对抗病毒突变提供重要思路。

关键词：新型冠状病毒中和抗体受体结合区域 ACE2受体病毒突变免疫逃逸广谱中和抗体

1例慢性HIV-1感染者体内CD4结合位点特异性记忆B细胞分选及抗体表达研究

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中国艾滋病性病 2016年第6期22卷 402-406页

作者：李丹王铮任莉梁华洪坤学鞠斌王硕李亚峰邵一鸣中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心传染病预防控制国家重点实验室北京102206

目的通过抗原特异性记忆B细胞(Memory B)分选、抗体基因克隆表达和鉴定方法,从艾滋病病毒1型(HIV-1)感染者中获得HIV-1中和抗体,并进一步探讨获得抗体的特征。方法通过检测血浆中和抗体活性和表位筛选,挑选出1例含有CD4结合位点(CD4bs)... 详细信息

目的通过抗原特异性记忆B细胞(Memory B)分选、抗体基因克隆表达和鉴定方法,从艾滋病病毒1型(HIV-1)感染者中获得HIV-1中和抗体,并进一步探讨获得抗体的特征。方法通过检测血浆中和抗体活性和表位筛选,挑选出1例含有CD4结合位点(CD4bs)特异性抗体的慢性HIV-1感染者。采用一对含有/缺失CD4-bs的探针RSC3/ΔRSC3进行Memory B分选,获得抗体可变区基因后进行抗体的表达纯化,并检验所得抗体的结合能力和中和能力。结果从9×106外周血单核淋巴细胞(PBMCs)中分离得6个特异性Memory B。通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别扩增出3对重链和轻链可变区基因,配对得到3个抗体,其中有一个抗体具有HIV-1CD4bs结合能力。中和实验表明,这个抗体能中和毒株SF162[50%抑制浓度(IC50=0.89μg/mL]。抗体可变区基因家系分析表明,该抗体属于IGHV1-18家系,重链可变区(VH)自体突变率为12%,低于广谱中和抗体VRC01VH的自体突变率(32%)。结论建立的单克隆特异性Memory B分选方法,可以获得有中和能力的抗体。该平台有希望获得具有我国自主知识产权的广谱中和抗体,并为开发抗体药物和设计新型免疫原提供技术支持。

关键词：艾滋病病毒1型广谱中和抗体 CD4结合位点单个B细胞分选

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表达gp120三聚体的腺病毒载体疫苗构建及免疫原性研究

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表达gp120三聚体的腺病毒载体疫苗构建及免疫原性研究

作者：于欣吉林大学

学位级别：硕士

自1981年首次报告以来,HIV-1感染已在全球范围内造成了深远的影响,并导致约3300万人死亡。尽管在全球范围内采取了多项控制措施,HIV-1大流行仍在不断蔓延,突显出开发有效的HIV-1疫苗的迫切需求。疫苗开发的一个关键挑战在于其能否诱导... 详细信息

自1981年首次报告以来,HIV-1感染已在全球范围内造成了深远的影响,并导致约3300万人死亡。尽管在全球范围内采取了多项控制措施,HIV-1大流行仍在不断蔓延,突显出开发有效的HIV-1疫苗的迫切需求。疫苗开发的一个关键挑战在于其能否诱导产生广谱中和抗体(Broadly neutralizing antibodies,bn Abs),以应对全球流行的大量HIV-1毒株以及持续的快速突变。目前尚没有任何一种疫苗能够在人或动物体内诱导出针对HIV-1的bn Abs。HIV-1的包膜糖蛋白Env是病毒表面由gp120-gp41异源二聚体形成的三聚体,是HIV-1 bn Abs的唯一靶点。近来的研究表明,理性设计的类天然构象的Env三聚体能够更好地呈现保守中和表位,在动物体内展现出了诱导交叉中和活性的优势。但仍需对免疫原和免疫策略进一步优化,以提升疫苗诱导bn Abs的潜力。课题组前期在HIV-1广谱中和抗体产生机制研究基础上,通过序列和结构优化设计了一种gp120三聚体免疫原PCM。以AS03为佐剂免疫豚鼠及恒河猴发现,其能够诱导较为广泛的交叉中和活性(中和>70%的tier-2病毒株,共12株)。但研究中也发现,针对tier-2毒株的血清中和抗体的滴度和持续性都需要进一步提升。基于PCM在表达时主要以三聚体形式存在的特点,本论文旨在构建一种表达PCM三聚体的腺病毒载体,并初步评价其免疫原性,特别是诱导生发中心(Germinal Center,GC)应答以及中和抗体的能力。论文首先通过穿梭质粒构建、病毒包装、筛选及纯化等步骤,成功构建了表达PCM三聚体的knob5型腺病毒(Ad5-PCM)以及knob37替换型腺病毒(Ad5K37-PCM)。以Ad5-PCM和Ad5K37-PCM感染HEK293及多种抗原提呈细胞后,通过流式和Western blot检测了两种腺病毒载体的感染和表达能力,结果表明Ad5K37-PCM能够更有效地感染抗原提呈细胞并表达PCM。随后,通过免疫小鼠后评价两种腺病毒载体疫苗的免疫原性,结果显示,三次免疫后Ad5K37-PCM诱导了较Ad5-PCM更为显著的Ig G抗体,但产生的中和抗体水平无显著性差异。为了进一步探究腺病毒载体疫苗诱导GC应答的能力,在三免后两周对小鼠的淋巴结进行了流式分析,发现Ad5K37-PCM诱导的GC相关B细胞尤其是浆细胞和GC B细胞水平更高,但Ad5-PCM和Ad5K37-PCM诱导的调节性T细胞(Treg)、滤泡辅助T细胞(Tfh)以及滤泡调节T细胞(Tfr)等淋巴结T细胞变化无明显差异。为了进一步提升腺病毒载体疫苗诱导的GC应答,我们在课题组前期构建的p IX蛋白修饰型腺病毒载体(p IX蛋白C末端融合了zipper)基础上,构建了表达PCM的衣壳双修饰型腺病毒载体疫苗AZK37-PCM。通过表达N端融合zipper的gp120三聚体蛋白ZCM,可以进一步在AZK37-PCM表面连接并展示gp120三聚体免疫原,从而获得了一种全新的结合表达型腺病毒载体疫苗ZCM/AZK37-PCM。Dot blot检测证实病毒与ZCM的特异性结合后,将疫苗通过皮下途径免疫小鼠,并以ZCM蛋白疫苗、Ad5K37-PCM和不表达PCM的结合型疫苗ZCM/AZK37作为对照,进行了免疫原性评价。结果显示,两种结合型疫苗在每次免疫后诱导的Ig G抗体水平均显著高于ZCM和Ad5K37-PCM疫苗组。在三次免疫后,两种结合型疫苗也诱导了更强的血清中和抗体水平。尽管两种结合型疫苗之间未观察到中和抗体水平的显著差异,但对抗体水平的持续检测显示,ZCM/AZK37-PCM诱导的抗体水平持续时间更长。之后,通过流式更全面地分析了疫苗接种后小鼠淋巴结的GC应答变化。结果表明,相比于ZCM和Ad5K37-PCM,两种结合型疫苗能够更为显著地激活gp120特异的B细胞和GC B细胞。同时还发现ZCM/AZK37-PCM在有效激活Tfh的同时,还下调了对抑制性细胞Treg的激活。综上,本论文首先构建了两种表达gp120三聚体的腺病毒载体疫苗并初步评价了其免疫原性,在此基础上进一步设计构建了一种结合表达型腺病毒载体疫苗ZCM/AZK37-PCM,显著提升了GC应答水平以及HIV-1 gp120特异的体液免疫反应,为后续设计可诱导bn Abs的疫苗或疫苗组合提供了基础。本论文的研究为诱导bn Abs的HIV-1疫苗设计与开发提供了新的思路和策略。

关键词： HIV-1疫苗广谱中和抗体 gp120三聚体腺病毒载体疫苗生发中心

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4E10-MAP4多肽疫苗制剂稳定性研究

4E10-MAP4多肽疫苗制剂稳定性研究

作者：李逍吉林大学

学位级别：硕士

艾滋病,即AIDS(Acquired Immune Deficiency Syndrome),是危害人类生存发展的重要传染病,现在世界上已经有大约总人口1%的人感染了艾滋病,中国是世界上艾滋病疫情较为严重的国度,对抗艾滋病已经刻不容缓。自从三十年前发现并确认HIV病毒... 详细信息

艾滋病,即AIDS(Acquired Immune Deficiency Syndrome),是危害人类生存发展的重要传染病,现在世界上已经有大约总人口1%的人感染了艾滋病,中国是世界上艾滋病疫情较为严重的国度,对抗艾滋病已经刻不容缓。自从三十年前发现并确认HIV病毒,经过无数的努力,研究者取得了很大的进步,目前的鸡尾酒疗法用于治疗艾滋病患者可以很大的延长他们的发病周期,并且帮助他们重新建立免疫系统,但是这种方法并不能从根本上去消除艾滋病病毒。因此控制HIV蔓延的最佳方法之一,无疑是安全有效的疫苗,但是目前开发的蛋白质、病毒载体、核酸和多肽疫苗,没有一个能在临床中被证明有效。并且有些疫苗加剧了HIV的感染。安全的广谱中和抗体,在HIV疫苗中是值得期待的。HIV包膜蛋白的gp41的MPER区,是多种广谱中和抗体的靶点(4E10、2F5、10E8和Z13),HIV病毒侵染细胞时,MPER会产生一系列构象的改变,短暂暴露的表位可以被免疫系统所识别,抗体与被识别的表位结合,抑制MPER区构象更进一步的改变,终止HIV病毒对细胞的侵染。2013年,有相关的研究表明,以MAPs(分支肽)的形式来呈递MPER区广谱中和抗体4E10的表位,并且辅以油相佐剂来调理后,免疫豚鼠,能够成功诱导出表位特异性抗体应答,假病毒中和试验的结果也表明,4E10-MAP4诱导所产生的广谱中和抗体的活性,并且后续相关的研究,初步建立了4E10-MAP4的制剂处方,以及最佳免疫程序。依据前期4E10 MAP4免疫原的质量研究,本论文主根据中国药典相关规定对4E10-MAP4临床制剂的稳定性进行研究。根据2015年版《中国药典》(第四部的指导原则9001,制剂的稳定性的指导原则)中规定的长期试验及加速试验制定考察时间,长期试验考察时间为第0月、3月、6月、12月、18月、36月。加速试验为考察时间为第0天、7天、14天、21天、28天,考察温度为205℃、36±1℃。以紫外分光光度法和HPLC测定介质中游离多肽含量。以MS和HPLC测定制剂多肽含量。通过蛋白免疫印迹和ELISA对制剂有效成分抗原性进行检定。证明制剂抗原性始终符合标准。通过动物免疫测定计算转阳率,证明制剂有效性。通过外观检查、装量测定、pH测定证明制剂的理化性质。试验结果表明制剂的多肽含量及质量不会随着时间而改变,理化性质符合药典要求。接下来通过205℃、36±1℃下加速试验,对制品的外观、装量、pH进行测定,试验结果表明,制剂并不会因为短期温度升高,理化性质有所改变。综上所述,本实验室研制的多肽艾滋病疫苗按上市销售包装于2℃条件保存36个月,各项指标均符合规定且性质稳定,因此暂定本多肽疫苗有效期为36个月。制剂可以在205℃、36±1℃进行包装、运输、贮存,只要时间不超过28天,不会对产品质量产生影响。

关键词：制剂处方稳定性研究广谱中和抗体 MPER HIV-1

新型冠状病毒刺突蛋白兔单抗的制备及初步应用

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新型冠状病毒刺突蛋白兔单抗的制备及初步应用

作者：王倩厦门大学

学位级别：硕士

由新型冠状病毒引起的新冠肺炎疫情对世界公共卫生构成严重的威胁。迄今为止,新冠大流行已在全球造成了超过4.3亿人感染和592.2万人死亡,新冠病毒突变株仍在不断的进化发展中。抗体是机体中重要的免疫球蛋白,具有高效的靶向性、低毒副... 详细信息

由新型冠状病毒引起的新冠肺炎疫情对世界公共卫生构成严重的威胁。迄今为止,新冠大流行已在全球造成了超过4.3亿人感染和592.2万人死亡,新冠病毒突变株仍在不断的进化发展中。抗体是机体中重要的免疫球蛋白,具有高效的靶向性、低毒副作用和有效的抗病毒功能,因此在各个领域的研究中都取得了显著的成果。在抗击新冠疫情中,抗体不仅能迅速提高机体的免疫能力,预防或治疗疾病,而且能作为体外诊断工具在疫苗研发及疾病快速诊断中发挥积极作用,因此抗体具有重要的科研价值。研究发现,新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域(RBD)在病毒结合人类细胞血管紧张素转换酶受体2(ACE-2)入侵宿主细胞中起着关键作用,且RBD蛋白具有良好的免疫原性,能诱导机体产生高效免疫应答和长效免疫记忆,因此RBD被认为是新冠疫苗及治疗性抗体药物研发的重要靶点。此外,研究表明兔单克隆抗体具有特异性强和亲和力高的优势,兔抗筛选平台也不受限于外周血样本来源,实验周期更短,筛选效率更高。因此利用兔抗筛选技术筛选抗原特异性兔B细胞,可以获得丰富的RBD抗体,同时兔抗表位的丰富性和作用机制的多样性也可能为疫苗的作用机制提供一定的理论指导。在本研究中,我们以SARS-CoV-2膜表面刺突蛋白RBD区作为研究靶标,通过实验室高效的兔单抗筛选平台,制备了 30株抗SARS-CoV-2的特异性单克隆抗体,并对其进行详细的性质鉴定和初步应用的研究。首先我们筛选到能用于新型冠状病毒病理和功能性研究的工具抗体9E1,并将其识别的抗原表位定位于RBD区域12个氨基酸构成的线性表位;其次我们评价了针对新冠病毒野生型和部分变异株RBD蛋白的高特异性高灵敏度配对抗体,并进行初步体外诊断应用;此外我们对制备的10株中和抗体进行广谱中和活性的评价,并选择优势抗体3E6评估了其对新冠Beta株致死性攻毒的动物体内治疗效果,证明了广谱中和抗体在仓鼠模型上具有一定的抗病毒保护活性。综上所述,本研究对RBD特异性兔单抗进行制备与应用研究,为新冠病毒的诊断及治疗性抗体药物研发提供丰富的兔单抗候选株,为靶向冠状病毒刺突蛋白的疫苗研究提供一定的设计思路。

关键词：新冠病毒刺突蛋白 RBD 兔单抗广谱中和抗体

利用单个B细胞抗体技术研制口蹄疫病毒O型全牛源单克隆工程抗体

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利用单个B细胞抗体技术研制口蹄疫病毒O型全牛源单克隆工程抗体

作者：王省中国农业科学院

学位级别：硕士

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)是引起猪、牛、羊等偶蹄动物口蹄疫的重要病原,有七个血清型。全球范围内FMDV O型的流行状况最为复杂,我国近年来就先后有3个拓扑型中的4个谱系的病毒株传入并造成流行,是目前防控难度最... 详细信息

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)是引起猪、牛、羊等偶蹄动物口蹄疫的重要病原,有七个血清型。全球范围内FMDV O型的流行状况最为复杂,我国近年来就先后有3个拓扑型中的4个谱系的病毒株传入并造成流行,是目前防控难度最大的病毒血清型。FMDV O型不同谱系病毒的抗原结构存在明显差异,表现为抗原匹配性与交叉免疫保护效果的不同;抗原结构变异分析是口蹄疫防控产品研制需要重点关注的问题。单个B细胞抗体技术是目前筛选识别不同位点中和抗体的最新方法,为研究抗原结构变异提供了丰富的抗体工具。本研究首先用FMDV O型3个谱系的毒株免疫牛,然后采集抗凝血分离牛外周血单个核细胞(PBMCs)。利用生物素标记的FMDV O型146S颗粒作为诱饵抗原,通过流式细胞术从免疫牛PBMCs中分选抗原特异性单个B细胞;通过单细胞PCR技术从单个B细胞中扩增牛IgG抗体重链与轻链可变区(VH与VL)基因序列,将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整IgG抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。通过酶联免疫吸附试验(ELISA),病毒中和试验(VNT),间接免疫荧光实验(IFA),Western-blot(WB)验证抗体的生物学活性。本研究共筛选表达了69株IgG亚型的全牛源单克隆抗体(mAbs),经ELISA、IFA、VNT验证,确定55株mAbs为FMDV O型特异性抗体。55株mAbs中,28株具有中和活性,其中13株为型内广谱中和抗体(broadly neutralizing antibody,bnAbs),可以中和FMDV O型3个拓扑型中的4个不同谱系毒株。采用多抗血清阻断ELISA发现13株型内bnAbs识别的抗原表位均表现出一定的免疫优势性。WB结果显示55株mAbs中有4株mAbs(E32、E53、F104、B66)结合线性表位,其中3株非中和mAbs(E32、E53、F104)结合衣壳蛋白VP2,另一株中和性mAb(B66)结合衣壳蛋白VP1的C末端。通过搜索IMGT数据库对55株mAbs的IGHV(D)J胚系基因定位分析,发现含有超长HCDR3的全部VH序列均使用牛胚系IGHV 1-7*02基因片段,而且中和抗体较非中和抗体偏爱使用牛胚系IGHV(D)J基因片段中的4个IGHV(1-7*02;1-10*01/2;1-2*01;1-21*01/1-33*01),3个IGHD(6-2*01;7-3*01;5-2*01)和一个单独的IGHJ(2-4*01)基因片段。综上所述,本研究首次建立了快速筛选制备FMDV O型全牛源广谱中和抗体的技术平台,获得了28株FMDV O型特异性中和抗体,为解析FMDV O型抗原结构变异奠定了基础。

关键词：牛口蹄疫病毒单个B细胞抗体技术广谱中和抗体

基于AID的Flu B广谱IgM单抗类别转换及获得的IgG抗体初步的功能研究

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基于AID的Flu B广谱IgM单抗类别转换及获得的IgG抗体初步的功能研...

作者：陈静厦门大学

学位级别：硕士

流感病毒是威胁人类健康和公共卫生的一大重要问题,其中乙型流感(FluB)就是一种引发流感流行的主要病原体。由于流感病毒的持续快速变异,针对其的治疗药物必须具备广谱性。FluB的广谱中和单克隆抗体,尤其IgG型抗体是防治乙型流感病毒的... 详细信息

流感病毒是威胁人类健康和公共卫生的一大重要问题,其中乙型流感(FluB)就是一种引发流感流行的主要病原体。由于流感病毒的持续快速变异,针对其的治疗药物必须具备广谱性。FluB的广谱中和单克隆抗体,尤其IgG型抗体是防治乙型流感病毒的一种潜在的有效手段。本实验室在前期获得一株具有FluB广谱中和活性的IgM型鼠源单克隆抗体7G1。与传统IgG治疗性抗体药物相比,IgM抗体存在成产及纯化工艺较为复杂、抗体介导的杀伤作用较弱、半衰期较短等缺点。本研究开展了一种不依赖于抗体可变区基因克隆的IgG类别转换方法。我们通过在杂交瘤细胞中构建可调控表达活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)的系统,实现在杂交瘤细胞水平进行高频的抗体类别转换,之后利用流式细胞仪分选出IgG型单抗细胞并进行后续抗体体内体外性质鉴定,由此获得功能性IgG单克隆抗体杂交瘤细胞系。具体可以分为三部分。其中第一部分为可诱导表达AID的7G1杂交瘤细胞系的构建。首先,本研究将人AID基因及EGFP基因利用2A肽融合构建到慢病毒表达载体pLenti-TRE3G中,之后利用慢病毒感染并成功筛选获得一个可诱导表达AID的杂交瘤细胞株7G1-Tet-on-AID。接着,本研究利用四环素类似物强力霉素(doxycycline,DOX)诱导该细胞株表达AID,细胞内高浓度的AID再促使细胞进行抗体类别转换。本文第二部分进行类别转换效果的检测及IgG型7G1杂交瘤细胞的分选。通过ELISA抗体分型检测,我们发现7G1-Tet-on-AID细胞上清中分泌有IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3等多种免疫球蛋白,并通过流式分选获得380株具有广谱性的阳性单克隆细胞。本文的第三部分内容为:7G1原始IgM亚型抗体及型别转换所获得的7G1各IgG亚型抗体的体内外的活性的鉴定及比较。首先,本研究初步鉴定并对比了7G1-IgM和7G1-IgG各亚型抗体体外结合活性。我们分别随机挑选每个IgG亚型中的相应的3-4株细胞表达上清进行体外性质的分析,包括血凝抑制试验活性(HI)及微孔中和活性(MN)分析,发现同IgM亚型的原始抗体相比,部分型转后的IgG亚型的相应细胞株上清反应谱变宽:另外,部分经小鼠腹水纯化的7G1-IgG亚型的代表性单抗,也显示出比7G1-IgM更为广谱的病毒反应性。而且,在体外ELISA结合活性实验中,7G1各亚型抗体的病毒结合活性均大大优于7G1-IgM抗体。此外,我们还发现IgG2a和IgG2b亚型的7G1抗体具备抗体Fc介导的清除病毒的ADCC活性,而IgM亚型抗体则无此清除病毒的活性。初步评价了抗体在BALB/c小鼠模型体内的保护效果。我们发现,在高剂量给药的条件下,各7G1亚型单抗均能完全保护小鼠抵抗致死剂量的流感病毒的攻毒。因此,为区分各7G1亚型抗体体内治疗活性的区别,我们降低了抗体的给药剂量。发现在低剂量给药的条件下,IgG2a亚型的抗体治疗效果最佳,IgG1亚型的抗体次之,另外,低剂量的IgG2b和IgG3亚型抗体的体内治疗活性也优于IgM亚型抗体。同时,我们还评价了不同亚型抗体在不同给药途径的条件下体内保护效果的差别,我们发现,IgM亚型抗体仅能通过腹腔给药才能发挥保护作用,而通过尾静脉给药则不能发挥保护作用,而各亚型的IgG抗体无论是腹腔给药还是静脉给药,均能起到良好的体内保护作用。因此,在给药途径的选择上,IgG抗体也显示出了优势。总之,本研究通过对7G1杂交瘤细胞进行含AID的四环素诱导表达系统构建,利用Tet-on调控系统诱导其表达AID,增加杂交瘤细胞Ig基因类别转换的频率,实现了在细胞水平的抗体类别转换。可被借鉴和运用于流感病毒的相关抗体药物和其他抗原的新抗体的研发。

关键词：乙型流感病毒广谱中和抗体 AID 抗体类别转换

HIV-1 B’病毒包膜蛋白序列特征与广谱中和活性相关性的初步分析

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HIV-1 B’病毒包膜蛋白序列特征与广谱中和活性相关性的初步分析

作者：胡园园中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

研究背景动物实验表明被动输入中和单抗后经生殖道或者直肠黏膜攻毒能保护猴子不被SHIV感染;母婴垂直传播研究显示未传染给婴儿的孕妇体内的中和抗体反应要高于传染给婴儿的孕妇;给HIV-1病人输入中和抗体能够延缓停止抗病毒治疗后病毒... 详细信息

研究背景动物实验表明被动输入中和单抗后经生殖道或者直肠黏膜攻毒能保护猴子不被SHIV感染;母婴垂直传播研究显示未传染给婴儿的孕妇体内的中和抗体反应要高于传染给婴儿的孕妇;给HIV-1病人输入中和抗体能够延缓停止抗病毒治疗后病毒的反弹;这些研究结果表明广谱中和抗体是保护性疫苗所需要诱导的有效免疫保护组份。然而,现有的HIV-1包膜蛋白疫苗不能有效诱导产生广谱中和抗体,是HIV疫苗研发的主要障碍。HIV-1病毒通过多种进化机制来保护自己免受中和抗体的结合。如通过改变可变环的序列长度从而改变或影响抗原表位的暴露;形成gp120-gp41三聚体结构掩盖单体蛋白分子表位;膜蛋白表面高度糖基化阻止免疫系统的识别等。尽管在体内存在多种免疫逃逸机制,但是不同亚型的HIV-1毒株可以在体外被一些HIV-1慢性感染者血清有效中和,提示不同亚型HIV-1病毒株可能存在可诱导人体产生中和反应的共同的中和表位。深入了解与广谱中和活性相关的HIV-1病毒包膜蛋白的序列特征对进一步分析鉴定这些表位及分离相关的中和单抗具有重要意义。研究目的从既往单采浆HIV-1B亚型慢性感染者中筛选有广谱中和活性的样本;应用单拷贝基因组扩增技术分析广谱中和活性样本的包膜蛋白基因(env基因);初步探讨广谱中和活性样本env基因的序列特征,为进一步分析鉴定相关抗原表位和分离广谱中和单抗提供参考信息。研究方法应用HIV-1A、B、C、B/C、A/E等不同亚型或流行重组型的25株假病毒通过假病毒单轮感染TZM-bl中和抗体分析技术从既往单采浆HIV-1B’病毒慢性感染者中筛选有广谱中和活性的样本,从具有广谱中和活性的样本(BCN)血浆提取病毒RNA,进行逆转录PCR扩增获得cDNA,然后将cDNA进行终末稀释,再经巢氏PCR扩增获得env (gp160)基因,分析gp160基因序列多样性、可变环序列长度、可变环的糖基化位点(PNGS)个数、V3环静电荷、顶端四肽和辅助受体的使用情况;分析BCN样本和NBCN样本gp120区和gp41区可能与广谱中和活性相关的特征位点,包括gp120区V1V2环的单克隆抗体(PG9、PG16)的抗原表位、多聚糖的单克隆抗体(2G12、PGT127/128)的抗原表位、CD4结合区的单克隆抗体(b12、VRCO1)的抗原表位及gp41区的单克隆抗体(2F5、4E10、10E8)的抗原表位的序列变异特征。研究结果1.从通过假病毒单轮感染TZM-bl中和抗体分析技术筛选的样品中选取6份具有广谱中和活性的样本(BCN样本),2份不具有广谱中和活性的样本(NBCN样本)和1份具有中度广谱活性的样本。6份BCN样本在体外中和实验中均能中和80%以上测试毒株(25株病毒),其中对B亚型毒株的中和广度最大,对AE亚型病毒株的中和能力最弱。2份NBCN样本对所测试的25株病毒的中和广度在50%以下。1份具有中度广谱中和活性的样本对25株病毒的中和广度为69.6%。2.系统进化树(Neighbor-Joining Tree)分析显示这些样本都为B亚型病毒感染。9份样本遗传多样性主要集中在V1V2、V4、V5高变区,其中V1/V2区平均两两比对基因距离(APD)最高。***样本毒株具有V1V2和V4环序列长度较长,V1V2、V4和V5环糖基化位点较多,V3环静电荷较少等特征。4.广谱中和单克隆抗体识别的抗原表位的序列分析结果显示：(1)2F5:CBJC438、 CBJC501、CBJC524、CBJC437、CBJC433和CBJC473样本gp160基因的662-667HXB2间序列为ELDKWA,与文献报道的2F5表位完全一致,CBJC495样本有34.4%的序列在决定2F5抗性的关键位点有K665N突变。(2)4E10：6份BCN样本和2份NBCN样本的148序列除一条序列4E10表位缺失外,其余序列为WFxI(T/S)xxLW(672-680HXB2),与文献报道的4E10表位一致。(3)10E8:CBJC501样本的17条SGA序列中1条序列10E8表位缺失,剩余8条序列为N671S,8条为R683K。80%的CBJC438序列存在R683K突变。CBJC437. CBJC515、CBJC433、CBJC495、CBJC473样本的所有序列均存在R683K突变。(4)2G12：295位点糖基化缺失与2G12抗性直接相关,CBJC524、CBJC437、 CBJC473和CBJC495在N295位点很保守,且都具有糖基化。46.7%的CBJC438序列存在N295D突变,20%的CBJC438序列存在N295I突变。76.5%的CBJC501为N295E突变,23.5%的CBJC501为N295D突变。

关键词： HIV 广谱中和抗体单克隆抗体包膜糖蛋白