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重组犬干扰素-λ的高效原核表达及抗病毒活性测定

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重组犬干扰素-λ的高效原核表达及抗病毒活性测定

作者：崔灿山东农业大学

学位级别：硕士

干扰素（Interferon,IFN）是由淋巴细胞和单核细胞产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤及调节机体免疫功能等多种生物学活性的糖蛋白。IFN不能直接作用于病毒,而是通过与其相应的受体结合激活IFN信号通路发挥抗病毒作用。在干扰素家族中,III型... 详细信息

干扰素（Interferon,IFN）是由淋巴细胞和单核细胞产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤及调节机体免疫功能等多种生物学活性的糖蛋白。IFN不能直接作用于病毒,而是通过与其相应的受体结合激活IFN信号通路发挥抗病毒作用。在干扰素家族中,III型IFN是最新鉴定的成员,与I型IFN具有相似的抗病毒功能。与I型IFN受体的广泛分布不同,III型IFN的受体主要分布于上皮细胞和部分树突状细胞,具有组织特异性好、毒副作用小的优点。因此III型IFN在临床应用中有巨大潜力,有望在将来成为新的基因工程药物。但目前宠物临床上尚无犬用III型干扰素生物制品。原核表达系统是已经普遍应用于外源蛋白表达的系统,具有廉价和易于纯化的特点,可通过高密度发酵大量表达,拥有良好的工业化基础,是实现外源蛋白大规模生产进而推动其实现商品化的重要方法。为了高效制备大量重组CaIFN-λ蛋白,本研究合成了优化的CaIFN-λ基因序列,构建了重组CaIFN-λ蛋白原核载体,并将重组质粒转化进入大肠杆菌进行诱导与表达,通过优化表达条件实现了重组CaIFN-λ蛋白的体外大量表达。由于重组CaIFN-λ蛋白以包涵体的形式表达,利用尿素处理和亲和层析方法,获得了纯化的重组CaIFN-λ蛋白,进一步利用透析技术实现了重组蛋白的复性和浓缩。为了检测复性蛋白的生物学活性,将复性后蛋白处理犬肾上皮细胞系MDCK,发现重组CaIFN-λ可显著诱导干扰素刺激基因MXI、ISG15和2’-5’OAS等的表达,暗示了复性CaIFN-λ可以活化干扰素信号通路。利用表达绿色荧光标签蛋白的水疱性口炎病毒（VSV-GFP）和甲型流感病毒进一步检测重组CaIFN-λ蛋白的抗病毒活性,发现重组CaIFN-λ蛋白剂量依赖性的抑制了VSV-GFP和流感病毒的复制,表明制备的重组CaIFN-λ蛋白具有较高的抗病毒活性。综上所述,本研究构建了高效表达重组CaIFN-λ蛋白的原核表达载体,实现了重组CaIFN-λ蛋白的高效表达,通过纯化和复性获得了具有较高抗病毒活性的重组CaIFN-λ蛋白,为研制新型宠物抗病毒制剂奠定基础。

关键词：犬干扰素-λ 原核表达蛋白纯化抗病毒活性

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干扰素-λ与支气管哮喘

现代免疫学 2014年第2期34卷 169-170,164页

作者：王芳王敏三峡大学第一临床医学院宜昌443000

干扰素-λ(IFN-λ)是干扰素家族的新成员,具有广泛的生物学作用,近几年研究发现,其可能对支气管哮喘也有一定的治疗作用。本文整理归纳了IFN-λ与治疗哮喘相关的生物学作用,并分析了其治疗哮喘的潜在应用价值,以期为哮喘新药的开发寻求... 详细信息

干扰素-λ(IFN-λ)是干扰素家族的新成员,具有广泛的生物学作用,近几年研究发现,其可能对支气管哮喘也有一定的治疗作用。本文整理归纳了IFN-λ与治疗哮喘相关的生物学作用,并分析了其治疗哮喘的潜在应用价值,以期为哮喘新药的开发寻求更多理论依据。

关键词：干扰素-λ 支气管哮喘治疗作用机制

干扰素-λ真核表达体系的建立及其与化疗药物协同抗增殖作用机制的研究

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干扰素-λ真核表达体系的建立及其与化疗药物协同抗增殖作用机制...

作者：李竞河北医科大学

学位级别：硕士

目的:食管癌是常见消化道恶性肿瘤之一,亚洲东部为食管癌高发区。因其早期症状隐匿,患者在就诊时多为中晚期,失去根治性手术机会,化疗和放疗技术虽然有一定疗效,但中晚期患者预后无显著改善,且放化疗副反应明显。为此,干扰素抗肿瘤治疗... 详细信息

目的:食管癌是常见消化道恶性肿瘤之一,亚洲东部为食管癌高发区。因其早期症状隐匿,患者在就诊时多为中晚期,失去根治性手术机会,化疗和放疗技术虽然有一定疗效,但中晚期患者预后无显著改善,且放化疗副反应明显。为此,干扰素抗肿瘤治疗作为一种新型治疗方法,获得疗效同时副反应轻,并且调节增强机体免疫力,从而成为恶性肿瘤治疗研究热点。多项研究证实,干扰素λ具有抗病毒、抗增殖及免疫调节等生物学作用,受体表达的组织特异性使其不会导致严重造血系统及神经系统副作用,因而有较广的临床应用前景。本研究的目的是建立IFN-λ基因真核表达系统,评估真核表达的IFN-λ的生物学作用;进而探索干扰素λ与化疗药物联用是否存在协同抑制作用,并探索细胞分子学机制,为IFN-λ在食管癌等恶性肿瘤新治疗中的临床应用提供理论依据及实验基础。方法:1 IFN-λ基因克隆及目的基因的表达:从poly I:C刺激的Hu H-7细胞m RNA中克隆IFN-λ基因全长,构建pc DNA3-IFN-λ载体,酶切鉴定后转染COS-7细胞,Western印迹检测IFN-λ基因的表达。2细胞增殖率检测:CCK-8法检测:以空白对照组的为100%,COS-7细胞表达的IFN-λ蛋白处理的食管癌YES5和T.Tn细胞株增殖率;IFN-λ1与CDDP及ADM联合处理的细胞株T.Tn和YES5的增殖率,Calcusyn软件处理数据。3 Western印迹检测:凋亡蛋白caspase-3在食管癌细胞株T.Tn和YES5（COS-7细胞表达的IFN-λ蛋白处理;IFN-λ1与CDDP或ADM联合处理）的表达。4实时荧光定量PCR检测:COS-7细胞表达的IFN-λ诱导食管癌YES5和T.Tn细胞株ISG15及Mx A抗病毒基因表达;IFN-λ1与CDDP联合处理食管癌T.Tn细胞株后,凋亡相关基因Cyto-C、ISG15、TRAIL表达和化疗敏感性相关基因survivin、ERCC1、BRCA1、Smac的表达。5应用SPSS16.0软件进行统计学分析,对各组数据进行正态性检验及方差齐性检验,数据资料用均数±标准误（x±SE）表示,方差齐的数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,方差不齐数据采用秩和检验,需比较的数据组以最小显著差法（Student-Newman-Keuls,SNK）作两两比较,每组实验不少于3个独立的重复样本,P＜0.05为有显著性差异。结果:1成功构建IFN-λ基因真核表达体系克隆IFN-λ基因并构建pc DNA3-IFN-λ,经PCR、DNA测序和酶切鉴定,IFN-λ基因与Gen Bank公布的序列一致;经Western印迹条带提示IFN-λ蛋白在pc DNA3-IFN-λ转染的COS-7细胞中成功表达。2真核体系表达的IFN-λ生物学作用评估2.1真核体系表达的IFN-λ在食管癌细胞中的抗增殖作用应用上述真核细胞体系（pc DNA3-IFN-λ）表达的IFN-λ作用于人食管癌细胞株YES5和T.Tn,显示IFN-λ可明显抑制细胞增殖（空白对照组增殖率为100%;IFN-λ1处理组:YES5和T.Tn细胞增殖率分别为78.33%和59.75%;IFN-λ2处理组分别为72.92%和49.79%。）,（P＜0.05）。提示真核细胞体系表达的IFN-λ具有抗增殖作用。2.2真核细胞表达的IFN-λ诱导凋亡蛋白caspase-3活化Western印迹实验结果显示,真核细胞表达的IFN-λ1/2可显著诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞中cleaved caspase3表达,提示真核细胞表达的IFN-λ可通过活化caspase3诱导肿瘤细胞凋亡。2.3真核细胞表达的IFN-λ上调抗病毒基因表达实时荧光定量PCR检测显示,真核细胞表达的IFN-λ作用于T.Tn和YES5细胞后,细胞ISG15和Mx A基因转录明显上调（P＜0.05）,提示真核细胞表达的IFN-λ可上调细胞抗病毒基因表达。3 IFN-λ与化疗药物联合应用的生物学效应及分子学机制3.1 IFN-λ与化疗药物联合应用的协同抗增殖作用以不同浓度的CDDP或ADM和不同浓度的IFN-λ1联合作用于食管癌细胞株T.Tn和YES5,Calcu Syn软件分析数据显示,IFN-λ和CDDP或ADM联合应用可产生协同抗增殖作用（CI＜1）。提示IFN-λ与ADM或CDDP联合对细胞的增殖抑制活性较IFN-λ或化疗药单用时增强。3.2 IFN-λ与化疗药物联合应用诱导凋亡增加蛋白质印迹显示IFN-λ与ADM或CDDP联合作用于食管癌T.Tn细胞,较单药作用于细胞后cleaved caspase3的表达增加,提示IFN-λ与ADM或CDDP协同作用的机制是诱导肿瘤细胞凋亡增加。实时荧光定量PCR结果显示:联合应用后线粒体凋亡通路相关基因Cyto-C、死亡受体相关基因TRAIL及类泛素蛋白基因ISG15表达增加。3.3 IFN-

关键词：食管癌干扰素-λ 真核表达协同抗增殖化疗药物

干扰素-λ对肥大细胞Toll样受体表达和细胞因子分泌的调节作用的研究

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中国生化药物杂志 2014年第8期34卷 12-14,18页

作者：兰亚明何韶衡湖北民族学院附属民大医院急诊科湖北恩施445000 南京医科大学临床医学系江苏南京210029

目的探究干扰素-λ(interferon-λ,INF-λ)对肥大细胞Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达和细胞因子分泌的调节作用。方法采用干扰素-λ激发肥大细胞P815,收集激发后2、6、16 h不同时间点的细胞及其上清液。采用MTT方法检测不同... 详细信息

目的探究干扰素-λ(interferon-λ,INF-λ)对肥大细胞Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达和细胞因子分泌的调节作用。方法采用干扰素-λ激发肥大细胞P815,收集激发后2、6、16 h不同时间点的细胞及其上清液。采用MTT方法检测不同时间点干扰素-λ对肥大细胞P815的细胞活力的影响;采用酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞因子IL-4和IL-13的释放量;通过Western blot方法检测干扰素-λ对肥大细胞Toll样受体TLR2和TLR4蛋白表达的影响。结果 MTT实验结果表明,不同时间的干扰素-λ对肥大细胞P815的细胞活力均无显著性差异;ELISA结果表明,干扰素-λ能刺激肥大细胞P815释放IL-4和IL-13细胞因子,并且其释放量与空白对照组具有显著性差异(P干扰素-λ激发肥大细胞P815后,不同时间点的给药组均可上调TLR2和TLR4蛋白的表达。当给药时间为16h时,其TLR2和TLR4蛋白的表达具有显著性上调(P干扰素-λ刺激肥大细胞P815释放IL-4和IL-13细胞因子可能是通过上调Toll样受体TLR2和TLR4蛋白的表达。

关键词：干扰素-λ 肥大细胞 Toll样受体细胞因子

USP18对干扰素α和干扰素λ抗病毒信号通路的影响及意义

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USP18对干扰素α和干扰素λ抗病毒信号通路的影响及意义

作者：朱战涛河北医科大学

学位级别：硕士

目的：干扰素（interferon，IFN）是目前慢性乙型病毒性肝炎（ChronicHepatitis B，CHB）和慢性丙型病毒性肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）抗病毒治疗过程中一个重要的组成部分。在抗乙型肝炎病毒药物中，IFN与核苷（酸）类似物相比... 详细信息

目的：干扰素（interferon，IFN）是目前慢性乙型病毒性肝炎（ChronicHepatitis B，CHB）和慢性丙型病毒性肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）抗病毒治疗过程中一个重要的组成部分。在抗乙型肝炎病毒药物中，IFN与核苷（酸）类似物相比具有疗程短、停换药方便等优势;在慢性丙型病毒肝炎治疗中，IFN联合利巴韦林还是其标准治疗方案。虽然目前已有数十种干扰素被发现，然而在中国仅有隶属于Ⅰ型干扰素的IFN-α应用到病毒性肝炎的抗病毒治疗中。但是，在此治疗过程中仅有30%-40%CHB患者能达到e抗原的血清学转换，约有60%的患者对其治疗应答不佳;而且有50%-60%的基因1型CHC患者无法得到持续病毒学应答（SustainedVirological Response，SVR）。与此同时，由于IFN-α的诸多副作用，部分患者在治疗过程中还因为严重的副反应而终止治疗。近期研究发现泛素特异性蛋白酶18（Ubiquitin-specific protease18，USP18）是IFN-α疗效的重要影响因子，并且进一步研究证实USP18是IFN-α治疗效果的重要负性调节因子。IFN-λ是最新发现的一类新型干扰素，隶属于Ⅲ型干扰素;与IFN-α类似它也是通过激活JAK-STAT（Janus activated kinase-signal transducerand activator of transcription，JAK-STAT）通路并调控一系列抗病毒蛋白如：双链RNA依赖的蛋白激酶R（PKR)和抗黏病毒蛋白（mixovirus resistanceprotein A，MxA）来发挥抗病毒作用。最新体外研究发现在IFN-α应答不佳的细胞中IFN-λ仍然可以发挥抗病毒作用。关于USP18在IFN-α的抗病毒通路中的研究进展很多，但对于其在IFN-λ的抗病毒信号转导通路中的影响报道甚少。本研究旨在探讨USP18对IFN-α和IFN-λ抗病毒信号通路的不同影响及其临床意义。方法：复苏Huh-7细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养基在5%CO2，37℃条件下培养至对数生长期，然后分为空白对照组、IFN-α实验组和IFN-λ实验组。 1IFN-α实验组给予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ实验组给予IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激，空白对照组常规培养并加入等体积无菌生理盐水，分别于6h，12h，24h，48h后收细胞。 2空白对照组常规培养并加入无菌生理盐水，IFN-α实验组给予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ实验组给予IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激12小时，然后三组细胞用预冷的PBS缓冲液漂洗三遍后重新置入新鲜的无干扰素培养基中培养16h，然后分别再次给予无菌生理盐水、IFN-α2a（20IU/ml）和IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后收细胞。 3空白对照组常规培养并加入无菌生理盐水，IFN-α实验组给予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ实验组给予IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激12小时，然后三组细胞用预冷的PBS缓冲液漂洗三遍后重新置入新鲜的无干扰素培养基中培养16h，然后再分别给予无菌生理盐水、IFN-λ1（10ng/ml）和IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后收细胞。实时荧光定量聚合酶连反应（Real Time-quantitative Polymerase ChainReaction, RT-qPCR）法检测Huh-7细胞USP18、STAT1、PKR和MxA的mRNA表达水平。Western-blot检测USP18、P-STAT1、STAT1、PKR及MxA的蛋白表达水平。结果： 1不同干扰素刺激时间（6h，12h，24h，48h）各组Huh-7细胞指标的变化： 1.1各组细胞USP18的表达变化：随着干扰素刺激时间的延长，IFN-α实验组和IFN-λ实验组Huh-7细胞内USP18mRNA的表达增加，但IFN-α组比IFN-λ组增加更为明显且在24h、48h USP18mRNA的表达明显高于IFN-λ组（5.33±0.47VS4.60±0.42，5.41±0.46VS4.76±0.78），差异有统计学意义（P干扰素刺激时间的延长，IFN-α组和IFN-λ组Huh-7细胞内USP18蛋白的表达也开始增加，IFN-α组比IFN-λ组增加更明显且在48h时USP18蛋白的升高明显大于IFN-λ组（1.61±0.04VS1.46±0.03），差异有统计学意义（P<0.05）。 1.2不同刺激时间各组细胞STAT1、PKR和MxA的表达变化以及STAT1磷酸化蛋白的变化： 1.2.1随着

关键词：泛素特异性蛋白酶18 干扰素-α 干扰素-λ JAK-STAT 双链RNA依赖的蛋白激酶R 抗黏病毒蛋白A

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非洲爪蟾干扰素-λ1基因的原核表达

水生生物学报 2011年第6期35卷 1060-1062页

作者：齐志涛高谦张启焕黄贝王爱民王资生聂品盐城工学院海洋技术系江苏省沿海池塘养殖生态重点实验室盐城224051 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室武汉430072 化学与生物工程学院生物实验中心盐城工学院盐城224051

干扰素（Interferon，IFN）λ包括IFNL．1、-2和-3，分别又称为白细胞介素（Interleukin，IL）-29、IL-28A和IL-28B，在基因结构上与IL-10相似，含有多个外显子，IFN-λ1基冈包含5个外显子和4个内含子，IFN-λ2和IFN-λ3则有6个外显子和... 详细信息

干扰素（Interferon，IFN）λ包括IFNL．1、-2和-3，分别又称为白细胞介素（Interleukin，IL）-29、IL-28A和IL-28B，在基因结构上与IL-10相似，含有多个外显子，IFN-λ1基冈包含5个外显子和4个内含子，IFN-λ2和IFN-λ3则有6个外显子和5个内含子。

关键词：非洲爪蟾干扰素-λ 原核表达

干扰素-λ对乳腺癌、食管癌及恶性间皮瘤细胞系的抗增殖作用以及增强化疗药物疗效的体外研究

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干扰素-λ对乳腺癌、食管癌及恶性间皮瘤细胞系的抗增殖作用以及...

作者：刘佳妮河北医科大学

学位级别：硕士

目的:目前，在世界范围内癌症总发病率呈逐渐上升趋势，我国每年因癌症去世的人数约150万。传统应用手术、放疗、化疗等手段能够达到一定的临床治愈，但是仍存在一定的局限性。近年来，生物治疗由于其治疗的全身性、个体化等得到了临床... 详细信息

目的:目前，在世界范围内癌症总发病率呈逐渐上升趋势，我国每年因癌症去世的人数约150万。传统应用手术、放疗、化疗等手段能够达到一定的临床治愈，但是仍存在一定的局限性。近年来，生物治疗由于其治疗的全身性、个体化等得到了临床的认可，生物治疗包括：细胞因子治疗、免疫活性细胞治疗、诱导分化治疗、基因治疗等。目前，包括干扰素-α在内的细胞因子治疗肿瘤已经应用于临床，并且取得了良好的疗效。近几年，人们发现了干扰素家族的新成员-干扰素λ，它的受体复合体由特异性的IL-28Rα、IL-10Rβ链组成。干扰素λ与干扰素α具有相似的抗病毒、抗肿瘤细胞生长及免疫调节等作用，但与干扰素α相比，干扰素λ无明显的骨髓抑制作用及毒副作用且其作用长效，目前干扰素λ在各项体外研究中初步显示了抗肿瘤作用。本实验旨在通过检测干扰素λ受体在乳腺癌细胞系,食管癌细胞系及恶性间皮瘤细胞系中表达，并确定其对于上述细胞系是否存在明显的增殖抑制作用，进而初步探索干扰素λ的抗癌机理及其联合化疗药物时是否对肿瘤细胞系存在协同抑制作用。此研究结果将为干扰素λ成为一种有效抗击癌症的新兴生物治疗手段提供理论依据。方法：首先采用PCR技术检测乳腺癌231、453、MCF-7细胞，食管癌TE1、TE2、TE10、YES6、T.Tn细胞，恶性间皮瘤H2452、H2052、H226、211H、H28细胞，正常的食管上皮Het-1A细胞等14种细胞是否表达IFN-λ受体复合体;同时应用MTT技术检测经IFN-λ处理后细胞的增殖情况;选取表达IFN-λ受体且IFN-λ对细胞增殖有明显抑制作用的细胞株，应用MTT技术检测IFN-λ联合应用化疗药物时，两者是否存在协同作用;应用westernblotting技术，检测细胞系中caspase3、PARP、caspase8等，初步探索IFN-λ的抗肿瘤增殖机制。结果： 1乳腺癌、食管癌、正常的食管上皮细胞及恶性间皮瘤细胞中干扰素-λ受体复合体的表达情况乳腺癌细胞、食管癌细胞、正常的食管上皮细胞及恶性间皮瘤细胞的RT-PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳后，结果显示：食管癌TE1、TE2、TE10、YES6、T.Tn细胞，正常的食管上皮Het-1A细胞、乳腺癌453细胞、恶性间皮瘤H2052细胞出现了与预期相符的片段，说明其表达IL-28Rα、IL-10Rβ基因，即表达IFN-λ受体复合体;而乳腺癌231、MCF-7细胞,恶性间皮瘤H2452、H226、211H、H28细胞未出现与预期相符的片段，说明其不表达IFN-λ受体复合体。提示：IFN-λ受体复合体在不同细胞系中的表达具有特异性。 2IFN-λ对乳腺癌细胞、食管癌细胞、正常的食管上皮细胞及恶性间皮瘤细胞的增殖影响将以上14种细胞株分别分为5组进行培养，分别是无处理组，IFN-λ（1ng/ml）处理组，IFN-λ（10ng/ml）处理组，IFN-λ（100ng/ml）处理组，IFN-λ（1000ng/ml）处理组。培养96h后应用MTT法检测细胞增殖情况。结果显示，不同浓度的干扰素-λ对乳腺癌231、453、MCF-7细胞、恶性间皮瘤H2452、H2052、H226、211H、H28细胞、食管癌TE1、TE2、TE10、YES6细胞、正常的食管上皮Het-1A细胞不具有增殖抑制活性,经统计学分析，差别无统计学意义（P＞0.05）;不同浓度的干扰素-λ对食管癌T.Tn细胞具有明显的增殖抑制活性，经统计学分析，差别有统计学意义（P＜0.05）;并且其增殖抑制活性在一定范围内随着干扰素-λ浓度的升高而增强。提示：干扰素-λ的抗肿瘤增殖活性在不同细胞中表现不同。 3IFN-λ与化疗药物联合应用时对细胞增殖的影响选取IFN-λ受体阳性且IFN-λ对其增殖抑制作用明显的食管癌T.Tn细胞株 3.1以无处理组的细胞增殖活性为100%，单纯应用IFN-λ（10ng/ml）组细胞增殖活性为93%，单纯应用5-FU（10uM）组细胞增殖活性为63.5%，同时应用IFN-λ（10ng/ml）和化疗药物5-FU（10uM）组细胞增殖活性为35.8%;经统计学分析，各组间差别有统计学意义（P＜0.05）。 3.2以无处理组的细胞增殖活性为100%，单纯应用IFN-λ（10ng/ml）组的细胞增殖活性为96.3%，单纯应用CDDP（10uM）组的细胞增殖活性为66.2%，同时应用IFN-λ（10ng/ml）和CDDP（10uM）组的细胞增殖活性为45.5%;经统计学分析，各组间差别有统计学意义（P＜0.05）。提示：IFN-λ可明显增强化疗药物5-FU或CDDP对细胞的增殖抑制活性，两者同时应用时可产生协同作用。 4IFN-λ诱导食管癌T.Tn细胞凋亡酶的检测 4.1IFN-λ可诱导剪切形式的caspase3蛋白增加正常细胞内，c

关键词：干扰素-λ 增殖抑制化疗药物肿瘤细胞凋亡

肿瘤坏死因子-α和干扰素-λ2对肥大细胞Toll样受体表达的调节以及干扰素-λ2在过敏性鼻炎鼻息肉中的表达

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肿瘤坏死因子-α和干扰素-λ2对肥大细胞Toll样受体表达的调节以...

作者：宋为娟南京医科大学

学位级别：硕士

背景Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一个结构上高度保守的模式识别受体(Pathogen-associated molecular patterns,PAMP)家族。近年来研究表明TLRs可能通过多个环节调节过敏性疾病的进程,这为研究过敏性疾病机制和寻找更为合理... 详细信息

背景Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一个结构上高度保守的模式识别受体(Pathogen-associated molecular patterns,PAMP)家族。近年来研究表明TLRs可能通过多个环节调节过敏性疾病的进程,这为研究过敏性疾病机制和寻找更为合理有效的治疗方法提供了契机。近年来,过敏性疾病的发生率在全世界范围内显著增加,这不仅影响患者的生活质量,症状严重者甚至可危及生命。肥大细胞(Mast cell,MC)作为重要的效应和调节细胞,不仅在宿主防御病原菌的天然免疫中发挥关键作用,在过敏性疾病的病程发展中也处于核心地位。新近研究发现,宿主发生防御反应或过敏性疾病时,肥大细胞上的TLRs通过激活TLR信号传导通路,引起肥大细胞活化,在局部细胞因子的产生、多种免疫相关细胞的募集以及受累组织的重组等事件中均扮演重要角色。这表明,肥大细胞在过敏性疾病中,特别是在感染状态下,存在着与传统机制不同的一种新的致病机制,即肥大细胞TLRs的激活效应机制,这为TLRs在过敏性疾病中的作用研究提供了一个新的思路。进一步了解TLRs的作用机制,对肥大细胞的复杂分子机制和TLRs应答的多样性进行深入研究,可为治疗过敏性疾病开辟新的途径,有望在过敏性疾病的治疗方面获得突破性进展。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)是具有多种生物活性的多肽调节因子,其既参与机体的免疫防御功能,又作为机体的炎症、损伤、甚至休克发病中的重要介质,在过敏性疾病中发挥了重要作用。研究发现,过敏性炎症时肥大细胞释放的TNF-α,通过多种机制促进或者加重过敏性疾病的发生发展。然而,TNF-α是否可以通过调节TLRs的表达而影响肥大细胞活化,继而对过敏性炎症的病程发挥重要调控作用,尚待深入研究。干扰素-λ(Interferon-lambda,IFN-λ)是2003年发现的干扰素超家族,包括IFN-λ1(IL-29)、2(IL-28A)、3(IL-28B)。其中以IL-29和IL-28A的生物学活性最强,目前相关研究主要集中在抗病毒活性,而与炎症相关疾病关系的报道较少。新近研究发现,IL-28A可以改善小鼠与人过敏性哮喘相似的呼吸道症状;本实验室前期研究亦发现哮喘和过敏性鼻炎患者血浆IL-29水平增高,过敏原刺激肥大细胞可引起IL-29大量释放,外源性IL-29对肥大细胞有调节作用,均提示IFN-λ参与过敏性疾病的发生和发展过程。鉴于IL-28A与IL-29的同源性高达80%,IL-29与肥大细胞及过敏性疾病密切相关,提示IL-28A除了其明确的抗病毒作用外,抗炎和抗过敏的作用亦不容忽视,故深入探索IL-28A的生物学活性,其与炎症及过敏性疾病的关系,以及其是否可以通过调节肥大细胞的TLRs应答参与宿主的防御反应,将有助于探讨过敏性疾病的发病机制及为临床治疗提供新的选择。第一部分TNF-α和IL-28A对肥大细胞TLRs表达的调节目的检测IL-28A和TNF-α对鼠肥大细胞(P815)表面TLRs表达的影响。方法不同浓度(0.1、1.0、10、100 ng/ml)TNF-α和IL-28A分别作用于P815,刺激2 h、6 h、16 h后,收集细胞。用逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、定量PCR、流式细胞术和免疫荧光染色方法,在m RNA水平和蛋白水平检测TNF-α和IL-28A对鼠肥大细胞系P815上TLRs的表达调节,以及检测加入不同浓度抗TNF-α(1.0、3.0μg/ml)抗体刺激前后对肥大细胞TLRs表达变化的调节。1、流式细胞仪结果显示,TNF-α可以上调TLR4的表达,且有剂量依赖性。定量PCR和免疫荧光进一步验证了流式细胞术的结果。流式细胞术结果显示不同浓度TNF-α作用2 h、6 h、16 h后检测TLRs的表达,只有TLR4的表达与未刺激的对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),即TNF-α可以上调TLR4的表达。TNF-α上调TLR4蛋白表达开始于2 h,在16 h呈剂量依赖关系。100ng/ml TNF-α作用肥大细胞16 h可以使TLR4与未刺激的对照组相比上调2.6倍。预先加入抗TNF-α抗体作用后,与未加入抑制抗体相比,能够抑制100 ng/ml的TNF-α所引起的TLR4的上调,并且其差异具有统计学意义(P<0.05)。定量PCR结果进一步验证了流式检测结果。TNF-α在0.1-100 ng/ml可以上调TLR4在m RNA水平的表达,有剂量依赖性。TNF-α作用肥大细胞16 h后,能够上调TLR4 m RNA水平的表达,TNF-α在1 ng/ml可以上调TLR4 m RNA表达7.9倍(与未予以刺激的对照组相比)。100 ng/ml的TNF-α作用2

关键词： Toll样受体肿瘤坏死因子-α 干扰素-λ IL-28A 肥大细胞过敏性疾病

IL-28B基因多态性对干扰素治疗丙型病毒性肝炎应答的影响

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首都医科大学学报 2012年第3期33卷 334-337页

作者：佟小非尤红首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心北京100050

目前针对丙型肝炎的标准治疗方案是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林。宿主IL-28B基因多态性对丙型病毒性肝炎干扰素治疗清除有影响,可以对治疗应答进行预测。本文将从IL-28B基因多态性与慢性丙型肝炎治疗应答的关系及其影响应答的可能机制... 详细信息

目前针对丙型肝炎的标准治疗方案是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林。宿主IL-28B基因多态性对丙型病毒性肝炎干扰素治疗清除有影响,可以对治疗应答进行预测。本文将从IL-28B基因多态性与慢性丙型肝炎治疗应答的关系及其影响应答的可能机制两个方面,对宿主IL-28B基因在慢性丙型肝炎治疗实践中的意义进行探讨。

关键词：丙型病毒性肝炎全基因组关联分析白细胞介素28B 干扰素-λ 干扰素-α