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希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体表型筛选及其特性分析

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华中农业大学学报 2019年第4期38卷 33-39页

作者：周鹏顾琼楠黄俊斌郑露湖北省烟草公司襄阳市公司襄阳441100 华中农业大学植物科学技术学院/湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室武汉430070 湖北省农业科学院植保土肥研究所/农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室武汉430064

以希金斯刺盘孢菌株Ch-1为供试野生型菌株,通过农杆菌介导转化方法获得含2000个转化子的T-DNA插入突变体库,筛选菌落生长异常或致病缺陷突变体,分析致病缺陷突变体的T-DNA插入拷贝数和位点。结果显示,筛选到14株菌落异常突变体,包括2株... 详细信息

以希金斯刺盘孢菌株Ch-1为供试野生型菌株,通过农杆菌介导转化方法获得含2000个转化子的T-DNA插入突变体库,筛选菌落生长异常或致病缺陷突变体,分析致病缺陷突变体的T-DNA插入拷贝数和位点。结果显示,筛选到14株菌落异常突变体,包括2株生长缓慢突变体Ch-1-E393和Ch-1-C135、12株菌落形态异常突变体(包括色素异常、菌落扇变或菌丝坍塌现象),另外筛选到1株致病缺陷突变体Ch-1-G090。致病性测定结果表明,致病缺陷突变体Ch-1-G090接种拟南芥后,叶片发病明显减弱,且未产生水渍状病斑。显微观察发现该突变体分生孢子在叶片上仅能产生少量初生菌丝,不能正常形成次生菌丝。Southern杂交显示,致病缺陷突变体Ch-1-G090为T-DNA双拷贝插入;通过Inverse-PCR法获得插入T-DNA的侧翼序列,明确该突变体T-DNA插入位点分别为假定蛋白(Ch063_10682)和RNA加工蛋白FCF1(CH063_10671)编码区。

关键词：希金斯刺盘孢农杆菌介导转化突变体致病性插入位点

希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的筛选及相关突变体基因的克隆

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希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的筛选及相关突变体基因的克隆

作者：赵典华中农业大学

学位级别：硕士

由希金斯刺盘孢{Colletotrichum higginsianum Sacc.)侵染引起的十字花科蔬菜炭疽病是一类重要的世界性植物真菌病害,该菌分类地位属于真菌门,半知菌亚门,炭疽菌属。本实验室以希金斯刺盘孢Ch-1菌株为出发菌株,已经成功建立农杆菌介导... 详细信息

由希金斯刺盘孢{Colletotrichum higginsianum Sacc.)侵染引起的十字花科蔬菜炭疽病是一类重要的世界性植物真菌病害,该菌分类地位属于真菌门,半知菌亚门,炭疽菌属。本实验室以希金斯刺盘孢Ch-1菌株为出发菌株,已经成功建立农杆菌介导转化体系并获得4500多个T-DNA随机插入突变体。通过培养性状和将突变体分生孢子液分别接种活体和离体拟南芥叶片,并以野生型为对照,比较其致病力差异;同时在塑料玻片上观察突变体分生孢子是否正常形成附着孢的筛选方法,筛选了638株突变体,得到1株致病力丧失转化子(Pch-1B30),2株致病力减弱转化子(Pch-1E240和Pch-1E590),1株生长缓慢转化子(Pch-1E409),1株产泡状菌丝转化子(Pch-1E808),1株产类似厚垣孢子转化子(Pch-1E43)和52株菌落白化转化子(Pch-1E101等)。Pch-1B30菌株不能使健康或针刺造成伤口的拟南芥离体或活体叶片发病,接种拟南芥叶片4d,只能观察到正常的附着胞及极少数出生菌丝,没有次生菌丝的形成。Southern杂交证实在Pch-1B30T-DNA标记为双拷贝插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1B30中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,经过序列分析,其中一个T-DNA插入破坏的基因包含一个4612bp的完整开放阅读框,包含三个内含子、四个外显子,编码991个氨基酸蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blastp),发现该序列与绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的DUF221(Domain of unknown function)具有高度同源相似性,相似度为98%,此蛋白功能未知。另一个T-DNA插入破坏的基因包含一个694bp的完整开放阅读框,包含一个内含子、两个外显子,编码208个氨基酸蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blastp),发现该序列与禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的外切体构件EXOSC1/CSL4(exosome component)具有高度同源相似性,相似度为86%,此蛋白是一种复杂的外切体亚基,其功能是正确处理去除错误RNA和基因正常水平的维护。基因表达试验表明DUF221基因在突变体Pch-1B30菌丝培养过程中不表达。Pch-1E240菌株株不能使健康拟南芥离体或活体叶片发病,但能使针刺的拟南芥叶片发病。显微观察发现该菌株接种健康拟南芥叶片4d,能正常形成附着胞、初生菌丝,但没有形成次生菌丝。Southern杂交证实在Pch-1E240T-DNA标记为单拷贝插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1E240中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因其中一份包含一个2646bp的完整开放阅读框,包含五个内含子、六个外显子,编码669个氨基酸蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blastp),发现该序列与禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的乙酸辅酶A连接酶(Acetate-Coa Ligase)具有高度同源相似性,相似度为98%,乙酰辅酶A是能源物质代谢的重要中间代谢产物,是一个枢纽性的物质。Pch-1E590菌株接种健康的拟南芥叶片4d仍无发病症状,但能使刺伤或幼嫩的叶片正常发病,显微观察,能正常产生附着胞、初生菌丝、次生菌丝。Southern杂交验证该菌株T-DNA插入拷贝数为双拷贝。采用反向PCR技术对突变体Pch-1E590中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,仅获得了一端基因序列,经过序列分析,表明该T-DNA未插入到含有完整开放阅读框的基因中。在筛选过程中还获得了1株生长缓慢转化子Pch-1E409。Southern杂交证实在T-DNA标记为单拷贝插入。采用反向PCR技术对Pch-1BE409中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因其中一份包含一个1947bp的完整开放阅读框,包含三个内含子、四个外显子,编码576个氨基酸蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blastp),发现该序列与禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的胞裂蛋白Septin基因家族具有高度同源相似性,相似度为100%,此蛋白参与了细胞分裂、细胞极化、泡囊运输及胞膜重构等多个过程。

关键词：希金斯刺盘孢拟南芥突变体筛选反向PCR 乙酰辅酶A连接酶 Septin

希金斯刺盘孢Ch-DES1和Ch-STE12基因的功能分析

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希金斯刺盘孢Ch-DES1和Ch-STE12基因的功能分析

作者：原田华中农业大学

学位级别：硕士

希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是一种重要的半活养型寄生真菌,能够侵染十字花科植物,在叶片上产生典型的侵染结构和水渍状病斑。为了探究该病原真菌与拟南芥的互作机理,本研究运用反向遗传学及生物信息学法,对参与... 详细信息

希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是一种重要的半活养型寄生真菌,能够侵染十字花科植物,在叶片上产生典型的侵染结构和水渍状病斑。为了探究该病原真菌与拟南芥的互作机理,本研究运用反向遗传学及生物信息学法,对参与调控希金斯刺盘孢致病过程的相关基因进行了初步的功能分析。筛选得到了与稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)DES1基因同源的Ch-DES1基因,与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)STE12基因同源的Ch-STE12基因,进而对Ch-DES1基因及Ch-STE12基因进行敲除,分析了其在生长发育及致病方面的作用。在希金斯刺盘孢中成功克隆了与稻瘟菌DES1基因同源的Ch-DES1基因,经比对分析表明该基因全长3690bp,编码1229-aa蛋白,无内含子,有一个完整的外显子,含FNIP保守结构域,该基因的功能尚未在希金斯刺盘胞中报道。通过基因敲除获得了Ch-DES1基因敲除转化子,研究发现基因敲除转化子的菌落形态与菌丝干重和野生型菌株相比没有显著差异,但生长速度与野生型菌株相比变慢,产孢量减少,能产生形态正常的分生孢子及黑化的附着胞,对拟南芥的致病力减弱。表明Ch-DES1基因参与调控希金斯刺盘孢的菌丝生长、产孢和致病过程。从希金斯刺盘孢中克隆得到与酿酒酵母STE12基因同源的Ch-STE12基因,比对分析后发现该基因全长2484bp,编码713-aa蛋白,有3个外显子,2个内含子,含有STE superfamily及两个C2H2锌脂蛋白保守结构域。Ch-STE12基因敲除转化子的菌落形态及生长速度与野生型菌株相比无明显差异,产孢量与野生型菌株相比减少,但能产生正常的分生孢子及黑化的附着胞,菌丝干重增加,用孢子悬浮液喷雾接种拟南芥后发现对拟南芥叶片无致病性。表明Ch-STE12基因参与调控产孢和致病过程。

关键词：希金斯刺盘孢 Ch-DES1基因 Ch-STE12基因拟南芥致病力

希金斯刺盘孢CHIMPB、CHSCH9和CHCOT1基因的功能研究

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希金斯刺盘孢CHIMPB、CHSCH9和CHCOT1基因的功能研究

作者： Muhammad Aamir Sohail 华中农业大学

学位级别：硕士

希金斯刺盘孢是一种半活体营养寄生真菌,可造成包括芸薹属、萝卜属等多种十字花科植物炭疽病。深入研究病原菌的致病分子机制有利于开发新的炭疽病防控靶标及策略。本研究以希金斯刺盘孢ChImpb、ChSch9和ChCot1基因为研究对象,研究其基... 详细信息

希金斯刺盘孢是一种半活体营养寄生真菌,可造成包括芸薹属、萝卜属等多种十字花科植物炭疽病。深入研究病原菌的致病分子机制有利于开发新的炭疽病防控靶标及策略。本研究以希金斯刺盘孢ChImpb、ChSch9和ChCot1基因为研究对象,研究其基因功能。主要研究结果如下:(1)通过同源比较分析发现,在希金斯刺盘孢基因组中存在两个Importin-β基因,分别命名为ChImpb1和ChImb2。ChImpb1蛋白编码841个氨基酸,包含IBN,HeatZ和ARM三个结构域。ChImpb1蛋白编码755个氨基酸,仅仅包含HeatZ结构域。对ChImpb1和ChImb2基因进行敲除和互补等功能研究,发现ChImpb1或ChImb2基因敲除体的菌丝生长减慢、产孢量降低,对渗透压、细胞壁完整性、氧化压力抗性降低,且希金斯刺盘孢致病力显著降低。酵母双杂交结果表明,ChImpb1和ChImb2均能与ChMig2蛋白互作。ChMig2蛋白包含两个C2H2锌指结构域。为明确ChImpb与ChMig2之间的关系,对ChMig2基因进一步敲除,ChMig2敲除转化子表型与ChImpb1、ChImpb2表型类似,在菌丝生长、产孢、渗透压、细胞壁完整性、氧化压力抗性以及毒力方面均有缺陷。因此,从现有结果可以看出,ChImpb1和ChImb2可以与ChMig2互作,可能通过介导ChMig2调控希金斯刺盘孢发育及致病功能。(2)蛋白激酶ChSch9编码897个氨基酸,包含C2、SKc和SK三个保守结构域;聚类分析结果表明,ChSch9属于AGC kinase family,在真菌中很保守。ChSch9基因敲除可导致菌丝形态、生长、产孢缺陷;可降低渗透压、细胞壁完整性和氧化压力抗性。有意思的是,ChSch9基因敲除体对高温的耐受力更强。另外发现,ChSch9可能与pyruvate–acetaldehyde通路有关。ChSch9基因敲除体接种拟南芥叶片,致病力下降;进一步显微观察发现,附着胞和侵染菌丝形成率显著下降。由此可见,ChSch9在真菌侵染及相关结构发育上起重要调控作用。(3)本实验室在前期筛选获得一个致病力减弱的ATMT突变体G323,T-DNA单拷贝插入到丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因ChCot1上。ChCot1蛋白包含SKc和SK两个结构域。为研究其功能,对该基因进行敲除和互补。表型分析发现,ChCot1敲除体在菌丝生长以及毒力上均有缺陷。

关键词：希金斯刺盘孢拟南芥 ChImpb ChSch9 ChCot1 生长选择压耐受性致病性

希金斯刺盘孢Ch-STE7和Ch-SEC1基因的功能分析

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希金斯刺盘孢Ch-STE7和Ch-SEC1基因的功能分析

作者：陈美娟华中农业大学

学位级别：硕士

希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)引起的十字花科蔬菜炭疽病是一种重要的世界性真菌病害。为了研究该病原菌的致病机理,本研究通过生物信息学的方法筛选到与酿酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)FUS3/KSS1MAPK途径中STE7... 详细信息

希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)引起的十字花科蔬菜炭疽病是一种重要的世界性真菌病害。为了研究该病原菌的致病机理,本研究通过生物信息学的方法筛选到与酿酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)FUS3/KSS1MAPK途径中STE7基因的同源基因Ch-STE7,并通过基因敲除和互补方法验证了其在希金斯刺盘孢生长发育和致病过程中的作用;同时对希金斯刺盘孢T-DNA插入破坏基因Ch-SEC1,进行了初步研究。本研究所取得主要研究结果如下：从希金斯刺盘孢中克隆得到了与酿酒酵母FUS3/KSS1MAPK途径中STE7同源基因的Ch-STE7,该基因全长1729bp,含4个外显子,3个内含子,编码522aa的蛋白,具有SKc保守结构域。Ch-STE7基因敲除转化子菌落呈白色,边缘不规则,生长速度减慢,生物产量降低,气生菌丝增多,菌丝顶端分叉增多,分生孢子产量不变,但孢子萌发仅产生细长的芽管,不能形成黑化的附着胞,丧失对拟南芥的致病性。Ch-STE7基因互补转化子能够恢复Ch-STE7基因敲除转化子的缺陷表型。表明Ch-STE7参与调控希金斯刺盘孢的生长、色素形成、附着胞的产生及致病过程。从T-DNA插入突变体库中筛选得到的致病力降低突变体G668, T-DNA破坏的基因全长645bp,仅含有1个外显子,编码214个氨基酸,T-DNA单拷贝插在外显子上。将推定的氨基酸序列进行同源性比对显示该基因为假定蛋白,将其命名为Ch-SECl。该突变体在PDA上培养,菌落形态和野生型菌株相似,产孢正常,孢子液喷雾接种拟南芥叶片发现,在离体拟南芥叶片上可以产生少量病斑,活体拟南芥叶片上基本不产生肉眼可见的病斑,分生孢子在叶片表面正常萌发产生黑化的附着胞,但初生菌丝产生量明显降低,不能产生次生菌丝,推测该基因影响了初生菌丝和次生菌丝的产生。根据同源重组构建Ch-SEC1敲除载体并获得了敲除转化子,关于敲除转化子的验证还在进行中。

关键词：希金斯刺盘孢 ATMT 拟南芥致病相关基因附着胞 Ch-STE7基因 Ch-SEC1基因

希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的构建及致病特性的初步研究

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希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的构建及致病特性的初步研究

作者：王子月华中农业大学

学位级别：硕士

希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是十字花科蔬菜炭疽病的病原菌,是一类世界性分布的植物病原真菌。本论文建立了农杆菌介导转化(ATMT)希金斯刺盘孢Ch-1菌株的体系,即以Ch-1菌株培养17天所产生的分生孢子为受体,孢子浓... 详细信息

希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是十字花科蔬菜炭疽病的病原菌,是一类世界性分布的植物病原真菌。本论文建立了农杆菌介导转化(ATMT)希金斯刺盘孢Ch-1菌株的体系,即以Ch-1菌株培养17天所产生的分生孢子为受体,孢子浓度106/ml、与农杆菌在23℃共培养3天,转化效率可达30个/皿。利用该技术构建了含2000多个转化子的T-DNA插入体库。选取8个转化子,PCR方法扩增T-DNA上的hyg基因及转化子点杂交分析,证明转化子是T-DNA标记插入突变体。转化子在含20 ug/ml潮霉素的PDA上接种培养4代均能生长,但出发菌株不能生长,说明转化子遗传稳定。生长及产孢能力比较,说明T-DNA插入对菌株的正常生长没有影响但产孢能力增强。根据突变体生长特点,选取三个突变体(No.157、No.329和No.506)与出发菌株Ch-1分别从生长速度、产孢能力和致病性三方面比较分析。接种不同种拟南芥, No.329因不产孢不侵染所有种类拟南芥,No.157在拟南芥突变体jarl上、No.506在拟南芥突变体pad4上能成功侵染。Southern杂交分析,结果表明No.329和No.157为单拷贝,No.506为双拷贝。

关键词：希金斯刺盘孢农杆菌介导转化(ATMT) T-DNA插入体库拟南芥致病性

希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的构建、筛选及相关突变体基因的克隆

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希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的构建、筛选及相关突变体基因的克隆

作者：周鹏华中农业大学

学位级别：硕士

希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsianum Sacc.）是十字花科蔬菜炭疽病的病原菌,它属于子囊菌亚门,是一种半活体营养型的病害真菌。本研究以希金斯刺盘孢Ch-1菌株为出发菌株,利用农杆菌介导转化法获得2000多个T-DNA随机插入突变体,... 详细信息

希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsianum Sacc.）是十字花科蔬菜炭疽病的病原菌,它属于子囊菌亚门,是一种半活体营养型的病害真菌。本研究以希金斯刺盘孢Ch-1菌株为出发菌株,利用农杆菌介导转化法获得2000多个T-DNA随机插入突变体,为进一步研究病原菌的致病机理提供了必要的材料。通过对突变体进行生物学特性分析,并以拟南芥为寄主植物做致病性测定,对突变体进行了初步筛选并将其分类,其中,2株生长缓慢,菌落不能均匀扩展;4株致病性减弱;3株产孢缺陷,在PDA平皿上不能产生分生孢子;4株产孢量增多;2株可以诱导寄主产生过敏性坏死;13株色素异常;2株菌落扇变;3株附着孢萌发异常。对突变体Pch-1E393和Pch-1C36进行了深入详细的研究。突变体Pch-1E393生长速度明显减慢,菌丝粗壮稀疏,与Ch-1相比差异显著,但对拟南芥的致病力与菌株Ch-1无显著差异,此突变体在侵染过程中能产生正常的黑色附着孢并能产生初生菌丝和次生菌丝。Southern杂交证实在Pch-1E393中T-DNA标记为双拷贝插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1E393中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因包含一个1432bp的完整开放阅读框,包含三个内含子、四个外显子,编码一个352个氨基酸的蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比（blsatp）,发现该序列与禾生炭疽菌（Glomerella graminicola）的减数分裂重组蛋白DMC1 （meiotic recombination protein DMC1）具有高度同源相似性,相似度为86%,此蛋白在减数分裂过程中参与同源重组。突变体Pch-1C36菌落灰白色,菌落中间呈黑色并塌陷,与Ch-1的菌落形态差异明显,但致病性、生长速度、孢子产量等其他生物特性与Ch-1无明显差异。Southern杂交证实T-DNA标记在Pch-1C36中为双位点插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1C36中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组DNA进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因包含一个690bp的完整开放阅读框,包含两个内含子、三个外显子,编码一个174个氨基酸的蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比（blsatp）,发现该序列与endoribonuclease L-PSP （liver perchloric acid-soluble protein）同源性最高,L-PSP是在老鼠中,第一个被鉴定为单链RNA的特异性核酸内切酶。

关键词：希金斯刺盘孢农杆菌介导转化（ATMT）反向PCR 拟南芥减数分裂重组蛋白（DMC1） L-PSP

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希金斯刺盘孢ODC基因的研究

希金斯刺盘孢ODC基因的研究

菜心醛酮还原酶BclAKR4C10基因的克隆、亚细胞定位和VIGS载体构建

中国植物病理学会2016年学术年会

作者：严亚琴袁勤峰郑露刘浩黄俊斌华中农业大学植物科学技术学院

由希金斯刺盘孢（Coletotrichum higginsianum）侵染引起的十字花科蔬菜炭疽病是一类重要的世界性植物真菌病害,主要分布于中国、日本、印度、美国以及东南亚等地区,可引起多种十字花科蔬菜上的炭疽病。国内外研究和生产实践证明,抗病... 详细信息

由希金斯刺盘孢（Coletotrichum higginsianum）侵染引起的十字花科蔬菜炭疽病是一类重要的世界性植物真菌病害,主要分布于中国、日本、印度、美国以及东南亚等地区,可引起多种十字花科蔬菜上的炭疽病。国内外研究和生产实践证明,抗病品种种植和药剂防治是控制十字花科蔬菜炭疽病的主要措施;但近年来,已陆续出现抗病品种退化及化学药剂失效的实例,致使该病防治面临严峻挑战。希金斯刺盘孢是一种半活养寄生真菌,其侵染过程复杂,如果破坏或终止病原菌侵染的任何一个阶段,可以减轻病害的发生。为了研究该病原菌的致病机理,本研究通过生物信息学的方法,选择鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,ODC）基因作为研究对象。鸟氨酸脱羧酶是鸟氨酸循环中的第一个限速酶,鸟氨酸循环与蛋白代谢密切相关。现已报道在人体中鸟氨酸脱羧酶是多胺合成代谢途径中的第一个限速酶,ODC活性的异常会引起包括肿瘤在内的一系列疾病的发生,近年来被作为抗肿瘤分子靶点进行抗肿瘤药物研究。而在真菌中鲜有报道ODC基因,并且其鸟氨酸循环代谢途径并未完全清楚。希金斯刺盘孢中ODC基因全长1 421bp,具有2个外显子,1个内含子,编码455aa的蛋白,含有2个Pyridoxal-dependent decarboxylase保守结构域。目前正通过基因敲除和互补方法研究ODC在希金斯刺盘孢生长发育和致病过程中的作用。

关键词：希金斯刺盘孢 ODC,基因敲除

来源： cnki会议评论

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菜心醛酮还原酶BclAKR4C10基因的克隆、亚细胞定位和VIGS载体构建

作者：林咏诗华南农业大学

学位级别：硕士

炭疽病是菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)生产上重要的病害之一,病原菌的侵染会造成叶片出现“麻点”,影响菜心外观品质,降低其经济价值。经过多年的调查与检测,导致菜心炭疽病发生的主要病原菌为希... 详细信息

炭疽病是菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)生产上重要的病害之一,病原菌的侵染会造成叶片出现“麻点”,影响菜心外观品质,降低其经济价值。经过多年的调查与检测,导致菜心炭疽病发生的主要病原菌为希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsiamum)。植物醛酮还原酶超家族(Aldo-keto reductase super family,AKRs)基因是植物抗逆途径的一类重要基因。本研究采用RT-PCR方法,从菜心叶片中克隆得到一个菜心醛酮还原酶基因BclAKR4C10,分析了BclAKR4C10基因序列和生物学特性,开展了BclAKR4C10基因的亚细胞定位研究和炭疽病菌侵染菜心0 h、6 h、12 h、24 h、48 h时的荧光定量表达分析,进行了菜心VIGS载体体系的构建,初步阐明了BclAKR4C10基因与菜心抗炭疽病的分子基础,为十字花科蔬菜炭疽病的科学防治提供新的生物学途径。主要研究结果如下:(1)菜心BclAKR4C10基因:开放阅读框948 bp,共编码315个氨基酸,具有(α/β)桶状结构,并且还含有三个可变的Loop环结构。(2)BclAKR4C10基因编码蛋白:相对分子量为35.280 k Da,理论等电点为5.77;信号肽预测结果表明,该蛋白没有信号肽切割位点,为非分泌蛋白;亲疏水性分析表明:BclAKR4C10蛋白平均亲/疏水性指数为-0.248,预测该基因为亲水性蛋白;跨膜区分析预测该蛋白无跨膜区存在;磷酸化位点预测结果表明,该蛋白有8个Ser磷酸化位点、3个Thr磷酸化位点、2个Tyr磷酸化位点。二级结构预测表明,该蛋白α螺旋占40.63%,延伸链占14.60%,β转角占6.67%,无规则卷曲占38.10%。(3)BclAKR4C10基因亚细胞定位:将BclAKR4C10基因构建到p BI121-e GFP-HA载体中,经PCR检测及测序验证后,证实p BI121-BclAKR4C10-e GFP-HA载体构建成功。亚细胞定位结果表明,BclAKR4C10蛋白产生后分布于细胞核和细胞膜中,说明BclAKR4C10基因在细胞膜和细胞核中表达。通过对BclAKR4C10基因的亚细胞定位研究,初步明确了BclAKR4C10基因在菜心抗炭疽病过程中的可能作用位置,为进一步研究菜心抗炭疽病分子机制和控制炭疽病的发生提供了理论依据。(4)BclAKR4C10基因荧光定量表达分析:通过接种与不接种炭疽病菌的菜心叶片0 h、6 h、12 h、24 h、48 h时的荧光定量表达分析,菜心BclAKR4C10基因在炭疽病不同侵染时期的相对表达量存在明显差异。BclAKR4C10在对照组(不接种)始终低水平表达,而炭疽菌侵染24 h后BclAKR4C10表达量显著高于其他时期,是对照组的3倍左右,侵染后48h BclAKR4C10的表达水平有所回落,但仍高于0 h～12 h的表达量。通过分析BclAKR4C10基因在炭疽菌侵染不同时期的表达量差异,说明了BclAKR4C10基因与菜心抗炭疽病存在着密切关系。(5)BclAKR4C10基因VIGS载体构建:将BclAKR4C10基因构建到p TRV2载体中,经PCR检测及测序验证后,证实p TRV2-BclAKR4C10载体构建成功,后将该载体转入菜心植株中,经q PCR验证证实该载体成功使目标基因的表达降为对照组的10%,成功建立起菜心VIGS体系,这对于验证菜心BclAKR4C10基因在菜心抗炭疽病中的功能提供了稳定的试验材料。

关键词：菜心炭疽病希金斯刺盘孢醛酮还原酶亚细胞定位 VIGS载体构建