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大肠杆菌转化巴豆甜菜碱合成L-卡尼汀

中国医药工业杂志 1998年第3期29卷 99-102页

作者：范立强袁勤生华东理工大学生化研究所

利用大肠杆菌的卡尼汀代谢途径，建立了以巴豆甜菜碱为底物、酶法制备Ｌ－卡尼汀的新方法。催化巴豆甜菜碱转化的酶是可诱导的胞内酶，既催化巴豆甜菜碱水合，又催化卡尼汀的脱水反应。厌氧培养、在培养基中加入Ｌ－卡尼汀或巴豆甜菜碱... 详细信息

利用大肠杆菌的卡尼汀代谢途径，建立了以巴豆甜菜碱为底物、酶法制备Ｌ－卡尼汀的新方法。催化巴豆甜菜碱转化的酶是可诱导的胞内酶，既催化巴豆甜菜碱水合，又催化卡尼汀的脱水反应。厌氧培养、在培养基中加入Ｌ－卡尼汀或巴豆甜菜碱都有利于酶的形成。破碎处理后，可同时提高转化速度和转化率。

关键词：卡尼汀巴豆甜菜碱大肠杆菌酶法合成肉毒碱

紫外分光光度法测定肉碱转化液中巴豆甜菜碱的含量

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生物技术 2001年第5期11卷 41-42页

作者：王蕾郑璞金梅史朝晖孙志浩江苏省微生物研究所江苏无锡214063

通过对巴豆甜菜碱和L -肉碱在紫外 188- 2 15nm的光吸收的比较 ,建立了紫外分光光度法测定肉碱转化液中巴豆甜菜碱含量的方法 ,测定波长 2 0 5nm ,线性范围 0 - 2 5 μg/ml,该方法快速方便、重复性好 ,可用于L

关键词：巴豆甜菜碱肉碱含量紫外分光光度法测定生物转化法

不相容双质粒共表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB及其辅因子合成酶基因caiE

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中国医药工业杂志 2002年第3期33卷 113-116页

作者：范立强袁勤生吴祥甫华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室生物化学研究所上海200237 中国科学院上海细胞与生物化学研究所上海200031

基因 cai B和基因 cai E分别编码肉碱脱水酶及其辅因子合成酶 ,携带这两个基因的重组菌可以共表达两个外源蛋白 ,得到高活性肉碱脱水酶。分别构建这两个基因的表达质粒 p ET2 8cai B和 p ET2 2 cai E,利用双抗生素筛选法 ,获得能稳定遗... 详细信息

基因 cai B和基因 cai E分别编码肉碱脱水酶及其辅因子合成酶 ,携带这两个基因的重组菌可以共表达两个外源蛋白 ,得到高活性肉碱脱水酶。分别构建这两个基因的表达质粒 p ET2 8cai B和 p ET2 2 cai E,利用双抗生素筛选法 ,获得能稳定遗传的双质粒转化子。经 IPTG诱导 ,两个基因共表达 ,表达量分别占菌体总蛋白的 39%和 2 0 % ,共转化菌的酶活力比 p ET2 8cai B单转化菌提高了 2 .3倍。

关键词：肉碱巴豆甜菜碱脱水酶不相容质粒共表达大肠杆菌

产L-肉碱的大肠杆菌基因工程改造及生物转化

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食品工业科技 2017年第10期38卷 163-166,172页

作者：杨月英黄娇芳史吉平王红英中国科学院上海高等研究院上海201210 大连工业大学辽宁大连116034 上海科技大学上海201210

L-肉碱在脂肪代谢中起重要的作用,本文构建了T7启动子控制下的过表达质粒p ET28a-cai BCD和p ACYCD-cai F-cai T,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)(简写DE3)中,得到基因工程菌BL21(DE3)/cai BCD+cai F+cai T(简写DE3/BCD+F+T)。将此菌株接... 详细信息

L-肉碱在脂肪代谢中起重要的作用,本文构建了T7启动子控制下的过表达质粒p ET28a-cai BCD和p ACYCD-cai F-cai T,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)(简写DE3)中,得到基因工程菌BL21(DE3)/cai BCD+cai F+cai T(简写DE3/BCD+F+T)。将此菌株接种到生长培养基中,并用终浓度为1 mmol/L的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导培养,然后收集菌体细胞加入到含有巴豆甜菜碱盐酸盐的转化液中进行转化。结果显示,IPTG诱导4 h比诱导10 h后转化得到的L-肉碱量要高,转入了过表达质粒的工程菌DE3/BCD+F+T(7.244 g/L)比野生型DE3(0.5 g/L)提高了15倍。该巴豆甜菜碱盐酸盐转化生成L-肉碱的反应在2 h后基本达到稳定。

关键词： L-肉碱巴豆甜菜碱大肠杆菌生物转化基因工程

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微生物生产左旋肉碱的构建及发酵

微生物生产左旋肉碱的构建及发酵

作者：杨月英大连工业大学

学位级别：硕士

左旋肉碱即L-肉碱(英文简称:L-car),又叫维生素BT,是一种广泛存在于动物、植物以及部分微生物体内的活性异构体,其主要功能是参与脂肪酸的代谢。近年来,L-肉碱越来越广泛地用于新型的功能食品和降血脂新药的开发,因此,其生产方法和检测... 详细信息

左旋肉碱即L-肉碱(英文简称:L-car),又叫维生素BT,是一种广泛存在于动物、植物以及部分微生物体内的活性异构体,其主要功能是参与脂肪酸的代谢。近年来,L-肉碱越来越广泛地用于新型的功能食品和降血脂新药的开发,因此,其生产方法和检测都面临更高的技术要求。许多微生物都有能将巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱和D-肉碱(英文简称分别:crot、γ-BB和D-car)等一些物质转化为L-肉碱的能力。本文根据分析大肠杆菌和假单胞菌体内产L-肉碱的代谢过程途径发现,大肠杆菌能转化巴豆甜菜碱和γ-丁基甜菜碱生成L-肉碱,假单胞菌能将γ-丁基甜菜碱发酵生成L-肉碱。为了进一步提高L-肉碱的产量,从大肠杆菌野生型和假单胞菌野生型出发,构建得到一些稳定过表达产L-肉碱过程中的酶的基因和消除体内不利于产L-肉碱的基因,将这些基因导入大肠杆菌野生性(或突变株)后得到稳定生产L-肉碱的基因工程菌株。本文实验方法:①构建T7启动子控制下的过表达质粒28a-caiBCD和PACYCD-caiT-caiF,转入大肠杆菌BW25113ΔaceK和BL21(DE3)中进行过表达,通过IPTG及厌氧诱导优化酶活和菌体量,然后利用全细胞酶促转化巴豆甜菜碱生产L-肉碱。②构建过表达质粒3087-bbd,将此质粒转入假单胞菌pf5Δcdh中进行过表达,得到工程菌pf5Δcdh/bbd,然后将此工程菌在含有γ-丁基甜菜碱的发酵液中进行发酵产L-肉碱。最后得出:①导入质粒28a-caiBCD和PACYCD-caiT-caiF后得到的大肠杆菌工程菌BW25113AaceK/28a-caiBCD+PACYCD-caiT-caiF(简称BW251 13ΔaceK/caiBCD+caiT-caiF),在生长2h后加IPTG后并在厌氧环境下诱导18h后得到的菌体在含有20g/L的巴豆甜菜碱盐酸盐的转化液中进行转化时,4h后产量达2.219g/L,摩尔转化率在 13%左右。而得到的工程菌BL21(DE3)/28a-caiBCD+PACYCD-caiT-caiF(简称 BL21(DE3)/caiBCD+caiT-caiF)在生长2h后加IPTG诱导4h后得到的菌体作为粗酶进行转化时,在同样的转化液中进行转化时,最后产量能达8.5g/L左右,摩尔转化率为47%,比野生型提高了 17倍左右;②导入质粒3087-Acdh构建得到的假单胞菌工程菌pf5Δcdh/bbh,在含有γ-丁基甜菜碱的发酵液中进行发酵时,最后产量为1.2 g/L左右,此产量很低,但与假单胞菌本身产量0.2g/L相比,提高6倍。

关键词： L-肉碱 γ-丁基甜菜碱巴豆甜菜碱微生物摩尔转化率基因工程

大肠杆菌中L-肉碱脱水酶的生成及其催化条件研究

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大肠杆菌中L-肉碱脱水酶的生成及其催化条件研究

作者：朱容容南昌大学

学位级别：硕士

L-肉碱(β-羟基-γ-三甲基氨基丁酸),又称左旋肉碱、肉毒素、维生素BT,临床又称左卡尼丁,是一种营养安全、医药型精细化工品。近年来,人们研究发现L-肉碱及其衍生物具有强大的生理功能,使其广泛应用于食品、药品、饲料、保健品等各大领... 详细信息

L-肉碱(β-羟基-γ-三甲基氨基丁酸),又称左旋肉碱、肉毒素、维生素BT,临床又称左卡尼丁,是一种营养安全、医药型精细化工品。近年来,人们研究发现L-肉碱及其衍生物具有强大的生理功能,使其广泛应用于食品、药品、饲料、保健品等各大领域,甚至有学者提出L-肉碱的地位可与维生素媲美,纳入日常营养膳食中。由此可见,L-肉碱有着光明的前景和不可估量的市场价值。L-肉碱的制备途径有直接提取、化学合成、生物转化以及基因重组等。其中依赖自然界中多种微生物体内所含有的酶类对相应底物进行转化制备L-肉碱,是目前国内外公认的高效环保且成本低廉的制备方法,我国对此研究还不够深入,主要来源还是依靠从国外进口。基于以上背景,本文对实验室保藏的大肠杆菌Ecoli.F171622菌株产L-肉碱脱水酶的发酵条件以及L-肉碱脱水酶的催化反应条件进行了优化探究,为后期放大生产提供一定的理论依据。建立了底物巴豆甜菜碱的高效液相色谱检测方法和L-肉碱脱水酶的DTNB显色法,通过菌体生物量和L-肉碱的产量来反应酶活力大小,方法简便快捷、重复性高、专一性强。通过对菌种生长发酵所需的碳源、氮源、起始PH值、氧气、温度、培养时间的单因素考察,确定菌种在培养基组分(质量分数,%)为蛋白胨1.0,酵母膏0.5,延胡索酸2.0,KHPO0.2,(NH)SO 0.5,Mg SO·7HO 0.12,Mn SO·4HO0.001,Fe SO·7HO 0.001,NaHPO 0.28,PH 7.5±0.2(25℃),装液60 m L,120 r/min,35℃振荡培养24 h,菌种生物量及产酶活力最佳,分别为2.62 g/L和4.6 U。通过对酶催化反应过程温度、PH值、反应时间以及休止细胞浓度的单因素考察,确定最佳催化条件为休止细胞浓度在50～60 g/L,磷酸盐PH值为8.0,40℃反应10 h,L-肉碱产量最高可达13.6 g/L。

关键词： L-肉碱巴豆甜菜碱 L-肉碱脱水酶生物合成

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营养

中国妇幼卫生杂志 2002年第1期 31-37页

肉碱脱水酶突变株的获得及其休止细胞反应条件的优化

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生物技术通讯 2000年第4期11卷 261-263页

作者：王玉萍谭训刚陈师勇王勇王静李翔太山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100 中国科学院青岛海洋研究所

对一株产肉碱脱水酶的菌株用溴化乙锭进行诱变 ,并经肉碱选择性培养基进行筛选 ,获得了一株高活性酶活的菌株 ,并进行了休止细胞转化巴豆甜菜碱为L 肉碱的反应条件的研究。实验确定休止细胞的最适反应温度为 30℃～ 32℃ ,pH8.1、0 .0 1... 详细信息

对一株产肉碱脱水酶的菌株用溴化乙锭进行诱变 ,并经肉碱选择性培养基进行筛选 ,获得了一株高活性酶活的菌株 ,并进行了休止细胞转化巴豆甜菜碱为L 肉碱的反应条件的研究。实验确定休止细胞的最适反应温度为 30℃～ 32℃ ,pH8.1、0 .0 1mol L磷酸缓冲液 ,时间 8.5～ 10h。最适底物浓度为 6 0mg ml,最适休止细胞浓度为 6 0mg ml(湿重 ) ,产率 4 0 % (摩尔比 )。建立了休止细胞酶反应的表观米氏方程 ,其中Vm =0 .0 0 12 2 5mol (min·15mg菌体 ) ,Km =0 .0 4 0 114mol L。

关键词： L-肉碱巴豆甜菜碱肉碱脱水酶休止细胞反应