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巴氏醋杆菌核酸修复酶UvrA对大肠杆菌耐受性的影响

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天津科技大学学报 2016年第1期31卷 31-34,45页

作者：郑宇陈兴京王靖牟俊王敏工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院天津300457

巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)具有较高的醋酸耐受性,常用于醋酸的发酵生产.微生物中核酸修复酶Uvr A与菌体对酸、热等不良环境的耐受性相关,本论文克隆巴氏醋杆菌AC2005中的核酸修复酶基因uvr A,并在大肠杆菌(Escherichia coli... 详细信息

巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)具有较高的醋酸耐受性,常用于醋酸的发酵生产.微生物中核酸修复酶Uvr A与菌体对酸、热等不良环境的耐受性相关,本论文克隆巴氏醋杆菌AC2005中的核酸修复酶基因uvr A,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组表达,研究其对大肠杆菌醋酸、低p H、热和过氧化胁迫条件耐受性的影响.结果表明,分别在0.5%,醋酸、p H 3、53,℃、0.15%,H2O2这4种胁迫条件下处理40,min后,重组菌E.,coli JM109/p MV24-uvr A的存活率分别是对照菌E.,coli JM109/p MV24的11.2、4.7、19.2和7.5倍,说明来源于巴氏醋杆菌的核酸修复酶Uvr A能够提高大肠杆菌对醋酸、低p H、热与过氧化的耐受性,其原因可能是由于重组表达Uvr A提高了菌体在不同胁迫条件下对DNA的保护或修复能力.

关键词： UvrA 核酸修复巴氏醋杆菌大肠杆菌耐受性

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巴氏醋杆菌产乙醛脱氢酶的培养基优化

食品科技 2009年第5期34卷 6-9页

作者：王红波雷明科邓凡赵玉凤吴元欣王存文武汉工程大学绿色化工过程省部共建教育部重点实验室湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室武汉430074

通过单因素实验和正交实验,对巴氏醋杆菌产乙醛脱氢酶的发酵培养基进行了优化,确定了培养基最适初始pH。得到优化培养基组分为:硫酸铵2.5g/L,磷酸氢二钾0.75g/L,硫酸镁0.2g/L,磷酸二氢钠0.5g/L,氯化钙0.1g/L,乳酸钠1.25%。发酵最适初始p... 详细信息

通过单因素实验和正交实验,对巴氏醋杆菌产乙醛脱氢酶的发酵培养基进行了优化,确定了培养基最适初始pH。得到优化培养基组分为:硫酸铵2.5g/L,磷酸氢二钾0.75g/L,硫酸镁0.2g/L,磷酸二氢钠0.5g/L,氯化钙0.1g/L,乳酸钠1.25%。发酵最适初始pH6.0。使用优化了的培养基可使生物量达到3.5g/L,粗酶活达到26U/mL。

关键词：巴氏醋杆菌乙醛脱氢酶生物量优化

巴氏醋杆菌乙酰乳酸合成酶基因alsS功能研究

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巴氏醋杆菌乙酰乳酸合成酶基因alsS功能研究

作者：赵书梅中国石油大学(华东)

学位级别：硕士

3-羟基丁酮是我国传统固态发酵食醋中继乙酸和糠醛之外的第三高含量挥发性物质,3-羟基丁酮还是食醋标志性功能保健成分——川芎嗪的前体,川芎嗪是中药川芎中一种重要的药用活性生物碱。巴氏醋杆菌是一种食醋酿造典型微生物,可产生3-羟... 详细信息

3-羟基丁酮是我国传统固态发酵食醋中继乙酸和糠醛之外的第三高含量挥发性物质,3-羟基丁酮还是食醋标志性功能保健成分——川芎嗪的前体,川芎嗪是中药川芎中一种重要的药用活性生物碱。巴氏醋杆菌是一种食醋酿造典型微生物,可产生3-羟基丁酮。分析发现该菌细胞中的als操纵子上存在两种alsS基因,预示该菌中可能存在一种新颖的3-羟基丁酮合成途径。实验室从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购得一株Acetobacter pasteurianus CICC 22518。本论文对于该菌中乙酰乳酸合成酶基因alsS的功能进行分析研究。首先,对两种乙酰乳酸合成酶基因分别进行异源表达。对纯化后的乙酰乳酸合成酶蛋白进行酶学性质分析。结果显示,表达菌株Escherichia coli BL21(pET28a-alsS1)可高表达具有活性的乙酰乳酸合成酶,在37℃添加0.6 mM IPTG的LB培养基中诱导7 h,乙酰乳酸合成酶的比酶活可达129.5 U/mg;重组表达的乙酰乳酸合成酶AlsS1最适温度为55℃,最适pH为6.5。Na、K对AlsS1酶活无显著性影响,EDTA对其酶活有强烈的抑制作用。添加辅酶NADP、NADPH、NAD、NADH及支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸对AlsS1的酶活无显著性影响。AlsS2在进行温度和pH梯度摸索后未检测到酶活。其次,在***中对两种乙酰乳酸合成酶基因进行敲除,构建3株基因敲除菌株,分别命名为***-△alsS1、***-△alsS2、***-△(alsS1+alsS2),并对其生长情况、3-羟基丁酮生成情况、L-乳酸降解情况进行了研究。研究发现敲除菌株的生物量均低于野生菌株,说明基因的敲除会在一定程度上影响菌体自身的生长。乙酰乳酸合成酶基因alsS1被敲除后,3-羟基丁酮的合成受到显著影响,说明此基因对3-羟基丁酮的合成起主要作用,而alsS2基因也起到一定的作用,但并非主要作用。菌株***-△(alsS1+alsS2)在发酵过程中未检测到3-羟基丁酮的生成,说明基因alsS1和alsS2同时被敲除后,阻断了3-羟基丁酮的形成通路。野生菌株在发酵中对于L-乳酸的利用速率最高,敲除菌株对于L-乳酸的利用速率均低于野生菌株。此研究为后续提高发酵菌株的3-羟基丁酮产量奠定理论基础。

关键词：巴氏醋杆菌乙酰乳酸合成酶异源表达基因敲除

巴氏醋杆菌对环境胁迫的生理响应机制及提高冻干存活率的研究

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巴氏醋杆菌对环境胁迫的生理响应机制及提高冻干存活率的研究

作者：王娜河北科技师范学院

学位级别：硕士

醋酸菌是醋酸生产的主要工业菌,受到环境诸多因素如乙醇、醋酸、冷冻干燥等的胁迫,其在面临胁迫的过程中也会形成自身完整独特的调控体系,以适应复杂多变的环境。本研究以醋酸杆菌CICC?7015为试验对象,通过其对环境胁迫的生理响应,分析... 详细信息

醋酸菌是醋酸生产的主要工业菌,受到环境诸多因素如乙醇、醋酸、冷冻干燥等的胁迫,其在面临胁迫的过程中也会形成自身完整独特的调控体系,以适应复杂多变的环境。本研究以醋酸杆菌CICC?7015为试验对象,通过其对环境胁迫的生理响应,分析其在细胞膜水平及代谢水平上的调控机制,并研究有利于提高直投式醋酸菌发酵剂活力的策略。主要研究结果如下:（1）?从质膜及胞内代谢水平阐释菌株CICC?7015在乙醇、乙酸胁迫下的生理应答机制。乙醇胁迫下细胞多糖减少、膜流动性增大、膜透性降低,H+-ATPase活性在3%和5%时最高,7%1%时明显下降。乙醇浓度升高,胞内ATP浓度下降,7%1%时远低于对照。乙酸胁迫下细胞多糖减少、膜流动性增加、膜透性增大,H+-ATPase活性与乙酸浓度正相关,2.0%时是对照的2.28倍。胞内ATP浓度与乙酸浓度负相关,2.0%时ATP从对照的0.148降至0.008 mmol·mg-1（protein）。（2）?考察了碳源、外源能源辅助底物及脂肪酸对质膜生理特性、胞内ATP的影响,以探究菌株CICC 7015对培养基成分变化的生理响应。首先碳源中,乙醇减少了细胞多糖的合成,乙醇和甘油提高了膜流动性,而葡萄糖为单独碳源时膜通透性最低,且除单独葡萄糖的其他碳源均使膜H+-ATPase活性显著提高,甘油为单一碳源时胞内ATP含量最高。而外源能源辅助底物柠檬酸、苹果酸及琥珀酸对细胞多糖无显著影响,能一定程度增大膜流动性及通透性,且使H+-ATPase活性及胞内ATP含量提高。最后外源脂肪酸的影响,其与细胞多糖合成无显著相关性,油酸与亚油酸增大了膜流动性、棕榈酸和硬脂酸则使其减小,然而均降低了膜通透性,同时棕榈酸与油酸使膜H+-ATPase活性明显增大、硬脂酸导致其活性减小,还显示出不饱和脂肪酸更能促进胞内ATP的生成。（3）?研究保护剂及培养基组分对菌体冻干存活率的影响。10种保护剂中脱脂乳粉的菌体冻干存活率最高（72.92%）。乙醇胁迫培养导致菌体冻干存活率比对照显著降低;乙酸胁迫培养显著提高了菌体冻干存活率。碳源为葡萄糖和甘油的组合时,菌体冻干存活率最高（73.61%）,并且产能辅助底物柠檬酸、苹果酸、琥珀酸均明显提高了菌体冻干存活率,同时四种脂肪酸培养下的菌体冻干存活率显著高于对照（P<0.05）,且不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸的存活率更高。

关键词：巴氏醋杆菌环境胁迫生理响应冻干存活率

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巴氏醋杆菌表达载体的构建与应用

巴氏醋杆菌表达载体的构建与应用

作者：束妍浙江工商大学

学位级别：硕士

醋酸发酵生产用醋酸菌菌种及其耐酸特性是制约高酸度醋生产的重要因素。而有效的分子克隆工具则是研究醋酸菌耐酸的关键。本文以巴氏醋杆菌Ab3为研究对象,主要从启动子的选择、预测、及荧光蛋白报告基因的成功运用等方面着重介绍了适合... 详细信息

醋酸发酵生产用醋酸菌菌种及其耐酸特性是制约高酸度醋生产的重要因素。而有效的分子克隆工具则是研究醋酸菌耐酸的关键。本文以巴氏醋杆菌Ab3为研究对象,主要从启动子的选择、预测、及荧光蛋白报告基因的成功运用等方面着重介绍了适合巴氏醋杆菌的表达载体的构建过程。本文选择巴氏醋杆菌5个重要耐酸蛋白分别为乙醇脱氢酶(AdhA)、分子伴侣蛋白(DnaK,DnaJ,GrpE)、PqqA 以及 16srDNA为出发点,借助BPROM软件预测其基因上游启动子区。最后根据预测分值,选择PadhA,PgrpE以及PdnaK为对象进行后续研究。三种启动子大小皆为200 bp左右,以pBBR1MCS5抗性替换后得到的pBBRA为基础,成功构建了连有三种不同启动子的表达质粒pBBRAP1,pBBRAP2 以及 pBBRAP3。本文在巴氏醋杆菌中首次并成功运用荧光蛋白报告基因验证了所选启动子的活性。结果表明分别含有重组质粒pBBRAPIGFP,pBBRAP2GFP以及pBBRAP3GFP的重组菌荧光强度远高于对照菌株,证实所选启动子有效且可用于外源蛋白的表达。另外研究还表明启动子的活性与生长周期以及环境压力密切相关,如启动子PadhA的活性在整个生长周期均较高,而分子伴侣蛋白编码基因启动子在生长中后期活性较高。这与巴氏醋杆菌在生长时面对醋酸压力的情况下,蛋白表达情况变化类似,因此本文所开发的基于GFP报告基因的表达体系,可用于目标基因的特定阶段表达研究。在该表达体系的应用方面,本文成功构建了环丙烷脂肪酸合成酶编码基因cfa回补表达质粒 pBBRAPlcfa、pBBRAP2cfa 以及 pBBRAP3cfa,为进一步研究环丙烷脂肪酸在醋酸菌耐酸过程中的作用奠定基础。巴氏醋杆菌表达体系的构建与优化为后续研究特定功能基因提供了坚实的基础,为醋酸菌耐酸机制的进一步揭示,特别是为耐酸蛋白表达时间图谱的探索提供了有力保障。另外本研究的开展有助于进一步揭示菌株Ab3高耐酸调控机制,同时也为其它醋酸菌的类似研究工作的开展提供了思路,继而对于高耐酸醋酸菌种的选育及醋酸发酵工艺的优化具有一定指导意义。

关键词：巴氏醋杆菌启动子 GFP 表达载体环丙烷脂肪酸

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巴氏醋杆菌Ab3响应醋酸压力的脂质组研究

巴氏醋杆菌Ab3响应醋酸压力的脂质组研究

作者：杨洁琼浙江工商大学

学位级别：硕士

醋酸菌耐酸性的高低一直是制约我国食醋酿造产业发展的关键性因素。本文以巴氏醋杆菌Ab3为对象,以不同酸度条件下的菌体为实验材料,研究在不同酸度条件下醋酸菌细胞膜特性(流动性和通透性)的变化;基于此,通过不同酸度条件下醋酸菌细胞... 详细信息

醋酸菌耐酸性的高低一直是制约我国食醋酿造产业发展的关键性因素。本文以巴氏醋杆菌Ab3为对象,以不同酸度条件下的菌体为实验材料,研究在不同酸度条件下醋酸菌细胞膜特性(流动性和通透性)的变化;基于此,通过不同酸度条件下醋酸菌细胞膜脂质组成的测定与分析,探索脂质组成中关键组分的变化与醋酸菌高耐酸之间的关联性。对处于不同酸度环境条件下的巴氏醋杆菌细胞膜进行流动性和通透性分析,结果显示在醋酸发酵过程中随着酸度的增加,细胞膜的相变温度(Tm)升高,荧光偏振度(P)升高,细胞膜的流动性随着酸度的增高而降低。另外,随着酸度的增加,细胞膜的通透性先减弱后增强,总体呈现增强趋势。脂质组数据显示,不同酸度条件下菌体细胞膜脂质组成存在差别。在不同的样品中各类脂质中的分子种在组成上具有一致性,但在数量上存在差异性,菌体可能通过改变脂质组成和数量以适应外界环境的压力。其中,磷脂中的主要组成成分磷脂酰胆碱(PC)的含量随着酸度的增高而增加;甘油酯中甘油二酯(DG)的含量随着酸度的增高而增加,甘油三酯(TG)的含量随着酸度的增高而减少。另外,在样品中检测到了神经酰胺(Cer),其含量随着酸度的增高而增加,可能在醋酸菌的抗逆性中扮演着重要角色。通过分析差异性代谢物发现,环丙烷脂肪酸以及十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸和十八碳二烯酸等脂肪酸是重要的种子,可能在醋酸菌耐酸性方面在发挥着重要的作用。此外,脂质合成抑制剂的研究发现细胞膜脂质组成的变化对于醋酸菌的抗逆性生存及耐酸性具有重要作用,在不同的乙酸浓度刺激下,菌体的生长及数量发生明显变化,这一现象印证了脂质组分析所得出的结论。巴氏醋杆菌Ab3脂质组学分析研究工作的开展是对其基因组学及蛋白组学研究工作的进一步延伸,研究结果将有助于更全面的理解和认识醋酸菌的高耐酸机理,揭示巴氏醋杆菌基于细胞膜脂质组成变化的特殊耐酸机制。这将有利于高耐酸醋酸菌的选育和构建,对醋酸菌的实际工业化生产具有重要的参考价值。

关键词：巴氏醋杆菌膜流动性膜通透性脂质组神经酰胺环丙烷脂肪酸

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巴氏醋杆菌细胞膜蛋白组学研究

巴氏醋杆菌细胞膜蛋白组学研究

作者：王哲浙江工商大学

学位级别：硕士

醋酸菌是一类能氧化乙醇产生乙酸同时兼具高耐酸能力的革兰氏阴性细菌。一般细菌在3-4g/L的乙酸浓度下生长受到抑制,而醋酸杆菌属的成员在乙酸浓度大于40 g/L时依然具有将乙醇转化为乙酸的代谢活力。本文以本实验室分离保存的巴氏醋杆菌... 详细信息

醋酸菌是一类能氧化乙醇产生乙酸同时兼具高耐酸能力的革兰氏阴性细菌。一般细菌在3-4g/L的乙酸浓度下生长受到抑制,而醋酸杆菌属的成员在乙酸浓度大于40 g/L时依然具有将乙醇转化为乙酸的代谢活力。本文以本实验室分离保存的巴氏醋杆菌Ab3为研究对象,收集不同酸度条件下的样品S1(酸度10 g/L,种子液),S3(～30 g/L,发酵液),S7(～70 g/L)以及S9(～90 g/L)用于差异膜蛋白组学研究。探索醋酸压力下细胞膜蛋白的变化。本文优化了膜蛋白提取方案。使用βDDM作为去垢剂,并建立了2D BN-/SDS-PAGE双向电泳体系用来研究高耐酸性巴氏醋杆菌的差异膜蛋白组学。采用的2DBN-/SDS-PAGE双向电泳技术,对S1,S3膜蛋白样品进行分离鉴定。而2DBN-/SDS-PAGE对S7,S9膜蛋白的分离效果不理想,可能与高酸度醋酸菌膜蛋白发生聚集有关。在S1和S3的二维图谱上检测到的蛋白点数分别为161±21和143 ± 26个,从中选取了 62个蛋白点进行MALDI TOF/TOF串联质谱鉴定、搜库,并进行了生物信息学的分析。62个蛋白中有25个蛋白是膜蛋白。通过醋酸菌Ab3全基因组对其膜蛋白进行预测,一共有591个膜蛋白。检测到的蛋白占4.2%。有37个蛋白没有直接定位在膜蛋白上,可能是因为BN-PAGE是一种能够完整分离膜蛋白复合物的方法,能够促进亲脂膜复合物的溶解而不打断蛋白之间的相互作用的过程,部分细胞质蛋白在与细胞膜发生作用的时候被一起提取了出来。这些细胞质蛋白与膜蛋白之间存在紧密联系,对解释醋酸菌耐酸性也有一定意义。本文中检测到的膜蛋白主要分为ATP酶类,膜上转运蛋白类,氧化还原类,膜脂代谢类和其它。这些膜蛋白在醋酸菌中报道的较少。其中包括MscS离子通道,参与调节细胞内的渗透压变化。琥珀脱氢酶的两个亚基DB344170和SdhB可以根据环境中的氧水平来协调呼吸作用,除了参与细胞膜上电子转移外,还具有跨膜质子泵活性。在本文中MscS,DB344170,SdhB等膜蛋白的下调可能是由于AB3为了应对环境压力,从而以降低能量消耗,减少有毒物质的产生来维持细胞的生长。磷酸盐转运蛋白PtsB能增强醋酸菌的抗逆性生存。D,D-羧肽酶APA012790是一种脂蛋白,主要参与细胞壁上肽聚糖的合成过程中,对维持细胞形态的稳定有重要作用。FtsK与维持酸性条件下细胞分裂的正常进行,醋酸菌的产酸耐酸密切相关。本研究中PtsB,APA012790,FtsK等少数膜蛋白上调,这些蛋白对醋酸菌在高酸度条件下的产酸和耐酸能力的提升有重要意义。文中的数据还需要采用RT-PCR实验来进一步验证。

关键词：膜蛋白蓝色非变性温和电泳 2DBN-/SDS-PAGE 巴氏醋杆菌双向电泳蛋白组学高酸度醋

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巴氏醋杆菌中乙偶姻及乳酸代谢相关研究

巴氏醋杆菌中乙偶姻及乳酸代谢相关研究

作者：马小龙中国石油大学(华东)

学位级别：硕士

乙偶姻,又叫3-羟基丁酮(acetoin),是食醋中一种重要的风味物质,是食醋中继乙酸和糠醛之外的高含量挥发性物质,也是标志性功能保健成分川芎嗪的前体。川芎嗪具有扩张血管、增加动脉血流、抑制血小板聚集和降低血小板活性等作用,因此提高... 详细信息

乙偶姻,又叫3-羟基丁酮(acetoin),是食醋中一种重要的风味物质,是食醋中继乙酸和糠醛之外的高含量挥发性物质,也是标志性功能保健成分川芎嗪的前体。川芎嗪具有扩张血管、增加动脉血流、抑制血小板聚集和降低血小板活性等作用,因此提高食醋中乙偶姻及其杂环衍生物川芎嗪的含量对提升食醋品质具有重要意义。但是目前在食醋酿造菌中,乙偶姻的合成代谢调控机理还未见相关报道。本论文以巴氏醋杆菌为研究对象,一方面对巴氏醋杆菌中乙偶姻合成调控基因alsR的功能进行研究,另一方面对乳酸的分解代谢进行研究。首先,本课题组从中国工业微生物菌种保藏管理中心购得一株Acetobacter pasteurianus CICC 22518。通过生物信息学分析,确定了乙偶姻合成调控基因alsR,构建了alsR基因敲除菌株,命名为*** 22518-alsR△,并对其乙偶姻生成情况、菌株生长情况、乳酸利用情况进行研究。研究发现敲除菌株的生长速度低于野生菌株,乙偶姻的合成量减少,说明alsR基因在巴氏醋杆菌乙偶姻的合成中起正向调控作用。其次,为了进一步研究alsR的调控机理,通过荧光定量PCR的方法,研究乙偶姻合成过程中als S1、als S2、als D的表达情况。结果显示,敲除菌株als S1、als D的表达量明显减少,als S2的表达量与原始菌株相同。说明调控基因alsR通过对als S1、als D正向调控,调节控制乙偶姻生成。再次,通过前期实验以及基因信息学比对,发现两个基因orfA和orfB可能跟巴氏醋杆菌中乳酸的利用有关,于是通过敲除orfA基因、orfB基因,构建了2株基因敲除突变菌株,分别命名为*** 22518-orfA△、*** 22518-orfB△并对其生长情况、乳酸利用情况、乙偶姻生成情况进行了研究。通过发酵实验,结果显示,敲除orfA基因的突变菌株生长情况和乳酸利用情况和野生菌株完全相同,敲除orfB基因的突变菌株生长远慢于原始菌株且乳酸仅仅利用了20%。最后,本文研究发现alsR基因在乙偶姻的生成过程中起到正向调控作用,为正向调控als S1基因和alsR基因,orfB基因的缺失也会影响L-乳酸的利用,是巴氏醋杆菌利用乳酸的必不可少的基因。此结果为以后更好的研究乳酸利用相关蛋白和基因做了很好的铺垫,为以后提高食醋质量和风味提供理论基础。

关键词：巴氏醋杆菌乙偶姻乳酸基因敲除

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巴氏醋杆菌合成细菌纤维素的研究

巴氏醋杆菌合成细菌纤维素的研究

作者：王国强华中农业大学

学位级别：硕士

细菌纤维素是一种由微生物合成的超微纯纤维素，与自然界中存在的植物纤维素相比，具有纯度高、结晶度高、吸水性强、抗张强度好、生物适应性强，可在自然界直接降解等独特的性质。利用微生物发酵生产细菌纤维素，并将其应用用食品、医... 详细信息

细菌纤维素是一种由微生物合成的超微纯纤维素，与自然界中存在的植物纤维素相比，具有纯度高、结晶度高、吸水性强、抗张强度好、生物适应性强，可在自然界直接降解等独特的性质。利用微生物发酵生产细菌纤维素，并将其应用用食品、医药、造纸和生物医学工程等领域，具有广泛的应用前景，是当今生物材料研究的热点之一。本课题利用巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)为生产菌株对其合成细菌纤维素的培养基、合成条件、及生长曲线进行了探索。通过研究不同碳源培养基对细菌纤维素合成的影响，结果表明巴氏醋杆菌对甘油利用率最高，对乙醇、乙酸、葡萄糖利用率依次降低，培养液的pH值变化趋势都表现为先降低再升高。以甘油为唯一碳源合成纤维素的最佳合成条件为接种量7％，培养基甘油含量3％，培养温度31℃。巴氏醋杆菌的生长曲线表明在培养8天时菌落数最大，细菌纤维素在10天时产量最大。

关键词：巴氏醋杆菌细菌纤维素甘油合成条件