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黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α重组表达及抗菌活性分析

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水产学报 2013年第4期37卷 593-598页

作者：龙建杰朱新平史燕赵建洪孝友中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部热带亚热带水产种质资源利用与养殖重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

巨噬细胞炎症蛋白-3α是一种可诱导的分泌蛋白,通过相应受体对多种免疫细胞产生趋化,在多种疾病的免疫反应和炎症损伤中发挥重要作用。实验采用RT-PCR技术克隆出黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α(MaCCL20)的成熟肽基因序列,通过双酶切将... 详细信息

巨噬细胞炎症蛋白-3α是一种可诱导的分泌蛋白,通过相应受体对多种免疫细胞产生趋化,在多种疾病的免疫反应和炎症损伤中发挥重要作用。实验采用RT-PCR技术克隆出黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α(MaCCL20)的成熟肽基因序列,通过双酶切将目的基因序列插入到表达载体pET-32a上,然后转化进大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后表达出了pET-32a-CCL20融合蛋白,以该融合蛋白为抗原制备多克隆抗体并进行Western-blotting鉴定及抑菌性检测。实验表明,融合蛋白在37℃、0.8 mmol/L IPTG,4 h条件下得到高效表达;经SDS-PAGE凝胶电泳和Western-blotting分析显示,所表达融合蛋白相对分子量为30 ku,与预测蛋白大小一致并与带His标签的多克隆抗体发生特异性反应。经His Bind镍柱纯化后SDS-PAGE电泳检测出现单一条带,说明获得了纯度较高的MaCCL20重组蛋白。抑菌实验表明,MaCCL20重组蛋白对金黄色葡萄球菌、粘质沙雷氏菌和嗜水气单胞菌都有较强的抑菌作用。

关键词：黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α 重组表达抗菌活性

应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研究及MIP-3α在人舌鳞状细胞癌组织中的表达及意义

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应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研...

作者：徐丹丹南方医科大学

学位级别：硕士

背景与目的：舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤,约占口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的25%-40%。其恶性程度高、生长快、浸润性强,具有较高的区域性淋巴结转移率和复发率... 详细信息

背景与目的：舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤,约占口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的25%-40%。其恶性程度高、生长快、浸润性强,具有较高的区域性淋巴结转移率和复发率。近几十年来,尽管临床上以手术为主,术前术后的放疗或化疗为辅助的综合治疗已经很普遍,但对舌鳞癌生存率的提高并不明显。手术创伤大,术后常造成患者语言、进食等功能障碍及颜面部的畸形,放化疗产生较多的毒副作用,严重影响患者的生存质量。5年总体生存率仍然徘徊在55%-60%左右,复发和转移仍是影响预后的重要因素。因此,面对如何提高舌癌疗效这一世界难题迫切需要人类不断研究并寻找到更加安全有效的治疗途径。然而肿瘤的复发和转移是个复杂的多因素过程,是由肿瘤细胞的特征,肿瘤微环境的因素以及肿瘤细胞和周围微环境相互影响共同作用的结果。正常的细胞和其周围组织环境之间存在着动态平衡,两者相互作用可以调控细胞活性,决定细胞增殖分化、凋亡以及细胞表面相关分子的分泌和表达。而肿瘤的突变的过程是不断打破这一平衡的恶性循环过程。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞共同组成的一个复杂的集合系统。间质细胞和癌细胞之间可以相互诱导、相互作用,并产生大量的炎症因子、生长因子、趋化因子以及基质降解酶,有利于肿瘤的增殖、转移、侵袭和抗凋亡。早在1979年,Lord就提出了肿瘤微环境的概念,即指肿瘤在其发生过程中的内环境。在肿瘤微环境中,免疫炎性反应、组织缺氧和酸中毒、间质高压形成、生成大量的生长因子和蛋白水解酶等构成了微环境的生物学特征。这些特征对于肿瘤的增殖、侵袭、迁移、黏附及新生血管、淋巴管的形成具有重要影响,是肿瘤不断恶化并发生转移的重要原因。不难发现,在对肿瘤微环境研究的很多方面都渗透着肿瘤与炎症的联系,肿瘤与炎症的关系已经成为肿瘤研究的新方向,肿瘤炎症微环境的研究已经成为当今肿瘤研究的热点。有学者已将肿瘤的炎症微环境列为继生长信号的自给自足、对生长抑制信号的不敏感、对凋亡的逃逸、无限的复制能力、持续的血管生成能力、组织的侵犯和转移之后癌症的第七大特征。所以针对肿瘤相关炎症的治疗可以转变肿瘤炎症微环境,或者阻止炎症细胞移行到肿瘤灶。它们也可以将促肿瘤微环境调整为抑制肿瘤的微环境,增强特异的获得性免疫反应,抑制转移扩散。然而肿瘤炎症微环境靶点众多,从中挑选出重要的分子靶点是第一步,而弄清微环境中各种炎症因子水平的变化将会是确定靶点的关键。与肿瘤相关的炎症因子在不同类型的肿瘤中表达存在差异,对于特定的组织和特定种类的肿瘤其特异性炎症因子的确定是非常重要的。传统的免疫及组织学技术存在着所需样本量较大,不能同时检测大量抗原抗体指标及反映出致病过程中多种因子的复杂变化的制约因素。本研究想通过一种高通量、高效、精确的方法直接筛选出人舌鳞癌细胞株和正常口腔黏膜上皮细胞之间差异性变化的炎症因子,为进一步探讨差异性炎症因子对肿瘤生物学行为的影响及机制的研究提供前提,为寻找理想的肿瘤炎症微环境的治疗靶点奠定基础。随着人类基因组计划(HGP)顺利实施,以生命活动的执行者——蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越显得重要,并构想和发展了快捷、高效、并行、高通量的蛋白质组检测新技术——蛋白质芯片技术。蛋白质芯片能够同时分析上千种蛋白质的变化情况,使得在全基因组水平研究蛋白质的功能成为可能。抗炎症因子芯片是一种功能性的蛋白芯片,其将与炎症相关的细胞因子集成到一张芯片上,其能同时检测生物样品中与某些疾病或环境因素可能相关的炎症因子含量的变化情况。本研究通过应用蛋白质芯片技术(抗炎症因子芯片)筛选、分析不同侵袭能力的人舌鳞状细胞癌细胞株之间以及其和正常口腔黏膜上皮之间差异性炎症因子的表达及意义。同时结合文献用免疫组化方法检测差异性炎症因子在舌鳞癌组织中的表达情况,并进一步探讨其临床意义。研究内容共分两章：第一章应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研究;第二章MIP-3α在人舌鳞状细胞癌组织中的表达及其相关临床意义。第一章应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研究1.研究目的：差异性炎症因子的筛选为进一步探讨差异性炎症因子对肿瘤生物学行为的影响及机制的研究提供前提,为寻找理想的肿瘤炎症微环境的治疗靶点奠定基础。2.研究方法：体外培养人舌鳞癌细胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113和人正常口腔黏膜上皮细胞,消化后分别提取胞内、胞外蛋白,上芯片孵育,封闭,清洗。采用激光扫描仪Genpix4000B扫描芯片,用Axon GenePi

关键词：舌鳞状细胞癌蛋白质芯片舌鳞癌细胞株炎症因子免疫组织化学巨噬细胞炎症蛋白-3α

趋化因子MIP-3α及其受体CCR6在溃疡性结肠炎中的表达及其意义

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第二军医大学学报 2008年第10期29卷 1180-1183页

作者：钟万锷周国雄丁晓凌黄华南通大学附属医院消化内科南通226001 南通大学附属医院病理科南通226001

目的:研究趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)及其受体CCR6在溃疡性结肠炎(UC)中的表达情况以及与UC病变程度和范围的关系,探讨其在UC发病机制中的作用。方法:用免疫组织化学法检测35例活动期UC及20例正常对照石蜡包埋组织中MIP-3α... 详细信息

目的:研究趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)及其受体CCR6在溃疡性结肠炎(UC)中的表达情况以及与UC病变程度和范围的关系,探讨其在UC发病机制中的作用。方法:用免疫组织化学法检测35例活动期UC及20例正常对照石蜡包埋组织中MIP-3α及CCR6的表达情况。结果:UC组MIP-3α及CCR6均为阳性表达,对照组为阴性或弱阳性表达。MIP-3α及CCR6在UC组的表达与对照组相比,差异有统计学意义(P3α及CCR6表达阳性率越高;且MIP-3α和CCR6表达有明显相关性(r=0.765,P3α与CCR6均参与了UC的发生和发展,两者的相互作用可能在UC局部结肠组织破坏和病理变化中起着重要作用。

关键词：溃疡性结肠炎巨噬细胞炎症蛋白-3α CCR6受体

小鼠MIP-3α基因在Lewis肺癌中的放射诱导表达

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第三军医大学学报 2004年第24期26卷 2188-2190页

作者：邹岚朱波陈敬杜剑平陈正堂第三军医大学西南医院肿瘤科重庆400038 第三军医大学新桥医院全军肿瘤诊治中心重庆市肿瘤生物技术研究所重庆400037

目的　构建pEgr 1 MIP 3α(pEM)质粒 ,探讨辐射对被转染的Lewis肺癌细胞中MIP 3α表达的影响。方法　用定向克隆方法 ,构建pEM重组表达质粒 ,脂质体介导转染Lewis肺癌细胞 ,用RT PCR和ELISA方法检测不同剂量电子线照射后的MIP 3α表达... 详细信息

目的　构建pEgr 1 MIP 3α(pEM)质粒 ,探讨辐射对被转染的Lewis肺癌细胞中MIP 3α表达的影响。方法　用定向克隆方法 ,构建pEM重组表达质粒 ,脂质体介导转染Lewis肺癌细胞 ,用RT PCR和ELISA方法检测不同剂量电子线照射后的MIP 3α表达水平。结果　本实验构建的重组质粒pEM中MIP 3αcDNA正确插入表达载体 ;各照射组在不同剂量电子线照射后 ,MIP 3α表达均高于未转染组和假照射组。结论　Egr 1启动子具有辐射启动和诱导下游MIP 3α基因在Lewis肺癌中增强表达的功能 ,为pEM用于放射 -基因治疗的体内研究 ,提供了实验基础。

关键词：巨噬细胞炎症蛋白-3α 早期生长反应-1启动子树突状细胞放射基因治疗

瘤内注射MIP-3α对小鼠肝癌生长抑制作用的研究

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中国免疫学杂志 2012年第5期28卷 407-411页

作者：王甲南向邦德刘星赵荫农广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科南宁530021

目的:探讨瘤内注射巨噬细胞炎症蛋白-3α(macrophage inflammatory protein-3α,MIP-3α)能否趋化外周树突状细胞(Dendritic cells,DCs)至肿瘤组织内,诱导特异性免疫应答。方法:成功建立小鼠皮下肝癌模型后随机分为3组,第10天起分别向MI... 详细信息

目的:探讨瘤内注射巨噬细胞炎症蛋白-3α(macrophage inflammatory protein-3α,MIP-3α)能否趋化外周树突状细胞(Dendritic cells,DCs)至肿瘤组织内,诱导特异性免疫应答。方法:成功建立小鼠皮下肝癌模型后随机分为3组,第10天起分别向MIP-3α治疗组、PBS对照组的小鼠皮下肿瘤内注射MIP-3α溶液及PBS,空白对照组小鼠不予任何处理。20天后取肿瘤组织,免疫组化法检测肿瘤内DCs、CD4+、CD8+细胞浸润情况,流式细胞术检测肿瘤内DCs浸润数量及其表型。另外,每组各10只小鼠持续观察,用于绘制肿瘤生长曲线并观察生存时间。结果:①MIP-3α治疗组的小鼠肿瘤内浸润的CD4+、CD8+细胞及DCs数量均显著高于其他两组。②MIP-3α治疗组小鼠肿瘤内浸润性DCs的CD80、CD86表达率显著高于其他两组(P3α治疗组小鼠肿瘤生长速率显著低于对照组(P3α可在小鼠肝癌病灶内趋化、募集外周的树突状细胞,使其摄取并提呈肿瘤抗原,有效诱导针对肝癌细胞的特异性免疫应答。②MIP-3α在小鼠皮下肝癌模型的局部微环境下可能具有促进树突状细胞成熟的作用。

关键词：巨噬细胞炎症蛋白-3α 树突状细胞肝癌肿瘤免疫

瘤内注射MIP-3α对小鼠肝癌生长抑制作用的研究

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瘤内注射MIP-3α对小鼠肝癌生长抑制作用的研究

作者：王甲南广西医科大学

学位级别：硕士

目的：探讨巨噬细胞炎症蛋白-3α (MIP-3α)能否在小鼠皮下肝癌灶内趋化、募集外周的树突状细胞(DCs),使之在原位有效地摄取并提呈肿瘤抗原,诱导针对肝癌细胞的特异性免疫应答,以达到控制肿瘤进展的目的。方法：成功建立小鼠皮下肝癌模... 详细信息

目的：探讨巨噬细胞炎症蛋白-3α (MIP-3α)能否在小鼠皮下肝癌灶内趋化、募集外周的树突状细胞(DCs),使之在原位有效地摄取并提呈肿瘤抗原,诱导针对肝癌细胞的特异性免疫应答,以达到控制肿瘤进展的目的。方法：成功建立小鼠皮下肝癌模型后随机分为3组,第10天起分别向MIP-3α治疗组、PBS对照组小鼠皮下肿瘤内注射MIP-3α溶液(含MIP-3α0.2μg)或PBS100μl,空白对照组小鼠不予任何处理。20天后取肿瘤组织,免疫组化法检测肿瘤内DCs、CD4+、CD8+细胞浸润情况,流式细胞术检测肿瘤内DCs浸润数量及其表型。另取部分小鼠建立模型,分组、治疗方法同前,治疗实验结束后持续观察,绘制肿瘤生长曲线并观察生存时间。结果：①MIP-3α治疗组小鼠肿瘤内浸润的CD4+、CD8+细胞及DCs数量均显著高于其他两组。②MIP-3α治疗组小鼠肿瘤内浸润性DCs的CD80、CD86表达率显著高于其他两组(P3α治疗组小鼠肿瘤生长速率显著低于对照组(p3α可在小鼠肝癌病灶内趋化、募集外周的树突状细胞,使其摄取并提呈肿瘤抗原,有效诱导针对肝癌细胞的特异性免疫应答。②MIP-3α在小鼠皮下肝癌模型的局部微环境下可能具有促进树突状细胞成熟的作用。

关键词：巨噬细胞炎症蛋白-3α 树突状细胞肝癌肿瘤免疫

黄喉拟水龟CCL20基因序列特征及表达分析

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黄喉拟水龟CCL20基因序列特征及表达分析

作者：龙建杰上海海洋大学

学位级别：硕士

利用本实验室构建的黄喉拟水龟SMART全长cDNA文库，筛选得到巨噬细胞炎症蛋白-3α（MaMIP-3α或MaCCL20）全长cDNA序列，Maccl20基因cDNA全长2318bp，5’非编码区（Untranslated region, UTR）长1525bp，3’UTR长532bp，开放阅读框（Open reading frame, ORF）为261bp，编码86个氨基酸组成的多肽链，分子量为9.739kDa，理论等电点为9.004。综合亲水性表面可及性以及抗原指数三项指标，预测可形成抗原表位的氨基酸区域数为7。同源性分析表明，黄喉拟水龟与变色蜥（Anolis carolinensis）、原鸡（Gallus gallus）的巨噬细胞炎症蛋白-3α亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示：MaMIP-3α在肝脏、肾脏、心脏、脾脏中均有表达，脾脏中表达量最高。根据黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α（Mauremys mutica Cantor Macrophageinflammatory protein3α，MaMIP-3α或MaCCL20）的cDNA全长设计特异性引物，然后采用PCR克隆技术从黄喉拟水龟的肝脏组织中克隆出MaMIP-3α的成熟肽的基因序列。将得到的成熟肽序列插入到PMD18-T克隆载体上，转化进大肠杆菌*** DH5α中，得到的质粒经PCR以及测序鉴定正确后，将双酶切目的片段插入到表达载体pET-32a上，构建成原核表达重组质粒pET-32a-CCL20并将表达质粒转化入大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导后成功表达出了pET-32a-CCL20融合蛋白。以该融合蛋白为抗原制备了多克隆抗体。经过测序分析表明，MaCCL20的成熟太基因序列成功的插入到表达载体Pet-32a中。经过IPTG诱导表达、SDS-PAGE凝胶电泳和Western bolt分析显示，所表达的融合蛋白的相对分子质量约为30KD，与目的蛋白大小一致并且与带His标签的单克隆抗体发生特异性反应。经His Bind镍柱纯化后SDS-PAGE凝胶电泳检测出现单一条带。实验结果表明成功的获得了黄喉拟水龟MaCCL20的多克隆抗体。为建立检测黄喉拟水龟内源性MaCCL20的免疫检测法、酶联免疫吸附法、放射性免疫法等奠定了基础，为后续探索巨噬细胞炎症蛋白-3α在黄喉拟水龟的非特异性免疫反应中作用提供了一些重要的信息。

关键词：黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α 序列特征组织表达重组表达 Western blot

血清COL10A1、TK1、MIP-3α水平与胃癌患者病理特征的关系及其对腹膜转移的诊断价值研究

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检验医学与临床 2024年第12期21卷 1727-1730,1738页

作者：王佩显单彪张倩倩吴殿超雷秋香河北省邢台市人民医院输血科河北邢台054000 河北省邢台市人民医院检验科河北邢台054000 河北省邢台市人民医院胃肠肿瘤科河北邢台054000

目的研究血清X型胶原α1链(COL10A1)、胸苷激酶1(TK1)、巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)水平与胃癌患者病理特征的关系及其对胃癌腹膜转移的诊断价值。方法以2021年1月至2022年12月邢台市人民医院收治的96例胃癌患者作为恶性组,其中有腹... 详细信息

目的研究血清X型胶原α1链(COL10A1)、胸苷激酶1(TK1)、巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)水平与胃癌患者病理特征的关系及其对胃癌腹膜转移的诊断价值。方法以2021年1月至2022年12月邢台市人民医院收治的96例胃癌患者作为恶性组,其中有腹膜转移27例,无腹膜转移69例;选取同期收治的104例胃良性病变患者作为良性病变组,选取112例健康体检者作为健康对照组。比较各组血清COL10A1、TK1、MIP-3α水平及不同病理特征、有无腹膜转移胃癌患者血清COL10A1、TK1、MIP-3α水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清COL10A1、TK1、MIP-3α对胃癌患者腹膜转移的诊断价值。结果恶性组血清COL10A1、MIP-3α、TK1水平高于健康对照组、良性病变组,良性病变组血清COL10A1、MIP-3α水平高于健康对照组,差异均有统计学意义(P3α水平高于高/中分化、无脉管浸润、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者(P3α水平高于无腹膜转移患者(P3α单项及3项联合检测诊断胃癌腹膜转移的曲线下面积(AUC)分别为0.722(95%CI:0.621~0.809)、0.749(95%CI:0.651~0.832)、0.736(95%CI:0.637~0.821)、0.853(95%CI:0.766~0.917),3项联合检测诊断的AUC大于3项单独检测(Z=1.990、3.617、2.986,P3α水平升高,同时随着胃癌患者病情的进展,血清COL10A1、TK1、MIP-3α水平升高,且3项指标联合检测对胃癌患者腹膜转移具有较好的诊断价值。

关键词：胃癌 X型胶原α1链胸苷激酶1 巨噬细胞炎症蛋白-3α 病理特征腹膜转移诊断

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壹期煤工尘肺患者血清趋化因子水平及意义

中国工业医学杂志 2015年第5期28卷 329-331,338页

作者：袁宝军李超王冬梅邹吉敏高利常佟艳艳开滦总医院检验科河北唐山063000

目的探讨壹期煤工尘肺(CWP)患者血清趋化因子γ-干扰素诱导蛋白10(IP-10)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)和巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)水平变化及意义。方法用Luminex流式荧光技术检测85例壹期CWP... 详细信息

目的探讨壹期煤工尘肺(CWP)患者血清趋化因子γ-干扰素诱导蛋白10(IP-10)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)和巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)水平变化及意义。方法用Luminex流式荧光技术检测85例壹期CWP患者(CWP组)、44例井下健康工人(接尘对照组)及42例井上健康工人(正常对照组)血清IP-10、MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α水平。结果与正常对照组比较,CWP组IP-10升高、MIP-1α降低,接尘组IP-10、MIP-1α和MIP-1β均降低,差异均有统计学意义(P3α水平均明显高于接尘对照组,差异具有统计学意义(P3α水平下降,差异具有统计学意义(P3α以及MIP-1α和MIP-1β呈轻度正相关(rs=0.452、0.363、0.255、0.501,P3α水平异常,与尘肺发生发展有关;检测MIP-3α水平可能反映CWP病情程度。

关键词：煤工尘肺 γ-干扰素诱导蛋白10 巨噬细胞炎症蛋白-1α 巨噬细胞炎症蛋白-1β 巨噬细胞炎症蛋白-3α