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转化左旋乙基甾烯双酮的微生物筛选及转化产物研究

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天津科技大学学报 2015年第2期30卷 16-20页

作者：李宴清毛淑红于璐刘晓光路福平工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院天津300457

为了满足甾体药物日益增长的市场需求,从南方采集的新鲜树皮中筛选出具有转化新型甾体化合物左旋乙基甾烯双酮活力的微生物米根霉.利用该菌对左旋乙基甾烯双酮进行生物催化,转化产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为6,β–羟基–13... 详细信息

为了满足甾体药物日益增长的市场需求,从南方采集的新鲜树皮中筛选出具有转化新型甾体化合物左旋乙基甾烯双酮活力的微生物米根霉.利用该菌对左旋乙基甾烯双酮进行生物催化,转化产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为6,β–羟基–13,β–乙基–4–烯–3,17–二酮和10,β–羟基–13,β–乙基–4–烯–3,17–二酮.通过高效液相色谱对转化过程中的甾体化合物进行分析,发现转化24,h后,底物左旋乙基甾烯双酮、6,β–羟基化产物和10,β–羟基化产物的含量分别为28.4%、32.2%和35.7%.

关键词：左旋乙基甾烯双酮米根霉生物催化

雷斯青霉15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮工艺研究

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雷斯青霉15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮工艺研究

作者：段少军天津科技大学

学位级别：硕士

孕二烯酮(gestodene)(17a-Ethinyl-17β-hydroxy-18-methyl-4,5-estradien-3-one)是最新一代的孕激素之一。它以原形直接与孕激素受体结合,在临床上与炔雌醇组成复合片或三相片作为短效口服避孕药。目前合成孕二烯酮主要采用化学方法合... 详细信息

孕二烯酮(gestodene)(17a-Ethinyl-17β-hydroxy-18-methyl-4,5-estradien-3-one)是最新一代的孕激素之一。它以原形直接与孕激素受体结合,在临床上与炔雌醇组成复合片或三相片作为短效口服避孕药。目前合成孕二烯酮主要采用化学方法合成路线,这种方法需要昂贵的Pb(OAc)2和Bu3SnOMe,成本较高。与有机合成方法相比,生物催化反应具有很高的立体选择性、区域选择性和化学选择性,易于纯化,环境污染性小,且有利于提高转化率,降低成本。本文采用微生物转化技术,利用Penicillium raistrickii(ATCC 10490)催化甾体化合物左旋乙基甾烯双酮的15α位羟基化反应,得到合成孕二烯酮的重要中间体——15α-羟基左旋乙基甾烯双酮,具体内容如下。发酵液中主要成分的测定方法的建立。用薄层层析法,以石油醚：乙酸乙酯=1：2(v／v)作为展开剂,可以定性地分析底物和产物。同时建立了高效液相色谱分析法,采用外标法用于准确定量测定底物和产物,初步研究了该分析方法的实验条件、重复性及准确性等。正常细胞15a-羟基化左旋乙基甾烯双酮转化体系的建立,对其微生物转化工艺进行了优化。得出最佳培养基组分(g/L)为：葡萄糖30,玉米浆20,NaNO32, KH2PO41, K2 HPO42, MgSO40.5, FeSO40.02, KC10.5;最适转化条件为接种量10%,初始pH7.5,摇瓶装量50mL,转化温度28℃,投料浓度0.2%,投料时间30h,转化时间60h,底物添加方式为底物超声粉碎后加4%甲醇和1.5%tween80溶解。在此条件下,摇瓶转化率可达70%以上。雷斯青霉原生质体转化体系的建立。对雷斯青霉的原生质体制备及其对甾体的15α羟基化反应进行了初步的研究。用0.6%的溶壁酶和0.6%蜗牛酶、0.6mol/LNaCl为渗透稳定剂,温度30℃、pH6.5、菌龄18h,可以从所试的菌丝体得到浓度为2.0×105／mL的原生质体。青霉原生质体的甾体转化反应体系为：1)原生质体细胞浓度106／mL;2)反应液成分：0.2mol／L的磷酸缓冲液(pH6.5),内含渗稳剂0.6mol／L甘露醇溶液;3)装液量5mL／50mL;4)投料浓度0.05%;5)转化温度28℃,摇床转速150r／min;6)转化周期36h。与菌丝体转化相比转化率提高了1.15倍,转化速度增快了1.55倍。发酵罐放大试验及工艺优化。优化后得出：种龄2lh;接种量5%;pH值控制：0-27h为pH 7.5,27-66h为pH 6;溶氧控制：0-27h为溶氧40%,27-66h溶氧20%;细胞培养时间30h,转化42h,发酵罐转化率可达65%以上,为药物中间体15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的进一步扩大发酵转化以及工业化生产奠定了基础。

关键词：雷斯青霉 15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮生物转化

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11α羟基左旋乙基甾烯双酮的高效生物催化

11α羟基左旋乙基甾烯双酮的高效生物催化

作者：王娜天津科技大学

学位级别：硕士

地索高诺酮作为新一代强效孕激素,对孕激素受体具有较强亲和力和可靠的抑制排卵作用,而对雄激素受体亲和力低,只有轻微的雄激素和蛋白同化代谢活性,且对脂代谢无不良影响,被国内外普遍认为是一种优于现在广泛使用的炔诺酮和18-甲基炔诺... 详细信息

地索高诺酮作为新一代强效孕激素,对孕激素受体具有较强亲和力和可靠的抑制排卵作用,而对雄激素受体亲和力低,只有轻微的雄激素和蛋白同化代谢活性,且对脂代谢无不良影响,被国内外普遍认为是一种优于现在广泛使用的炔诺酮和18-甲基炔诺酮的新型避孕药物。11α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成地索高诺酮关键中间体,工业上主要采用化学方法合成,步骤繁琐,成本较高。而采用微生物转化方法反应条件比较温和,产物比较单一,具有很高的立体选择性、区域选择性和化学选择性。本论文对左旋乙基甾烯双酮经生物转化11α-羟基化制备11α-羟基乙基甾烯双酮的工艺进行了系统的研究,主要包括高效生物催化系统的筛选、左旋乙基甾烯双酮的微生物转化11 α-羟基化及产物结构的表征、赭曲霉TCCC 41060转化左旋乙基甾烯双酮11α-羟基化工艺优化、11α-羟基左旋乙基甾烯双酮的分离纯化;并对赭曲霉TCCC 41060细胞转化左旋乙基甾烯双酮11α-羟基化产副产物情况进行了初步研究。在未优化条件下,通过研究发现赭曲霉TCCC 41060对左旋乙基甾烯双酮的转化率为50%,优于黑曲霉TCCC 41055、米根霉TCCC 40006和金龟子绿僵菌TCCC 33676;这三株菌的转化有一个共同产物,通过结构表征可确认转化产物为11α-羟基左旋乙基甾烯双酮。为进一步提高11α-羟基左旋乙基甾烯双酮产物的最终收率,通过单因素试验对赭曲霉摇瓶转化培养基进行优化,确定了转化培养基为(g/L)：葡萄糖20,蛋白胨20,酵母膏20,pH5.8。同时在摇瓶条件下对生物转化条件进行优化：以孢子接种时,发酵液孢子终浓度以5×106个/ml为最佳;摇瓶转速180r/min,250m1三角瓶装液量50ml;发酵温度28℃;左旋乙基甾烯双酮溶于乙醇后添加,投料量为0.2%,转化48h后,转化率可达57.42%。此外,研究了11α-羟基左旋乙基甾烯双酮的分离纯化方法。转化结束后,固液分离得到菌丝体,以乙酸乙酯对菌丝体中的11α-羟基左旋乙基甾烯双酮及副产物行了提取,优化的提取条件为：每0.2g的左旋乙基甾烯双酮添加量采用100mL的乙酸乙酯(分两次,每次50mL、60min)提取。将提取液减压浓缩得到产物粗品,对底物的提取收率为50%。最后,本文研究了赭曲霉TCCC 41060细胞转化左旋乙基甾烯双酮11α-羟基化产副产物情况。转化过程同时产生4个副产物,根据液相保留时间的长短分别命名为1-4号,经过制备液相的分离及核磁谱图的鉴定,确定2号副产物为10,11-双羟基左旋乙基甾烯双酮,4号副产物为6-羟基左旋乙基甾烯双酮。

关键词：地索高诺酮 11α-羟基化左旋乙基甾烯双酮生物催化分离纯化

雷斯青霉转化左旋乙基甾烯双酮15α-羟基化反应工艺研究

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天津科技大学学报 2008年第2期23卷 34-38页

作者：段少军杜连祥别松涛毛淑红天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院天津300457

对雷斯青霉(Penicillium raistrickii)微生物转化左旋乙基甾烯双酮15α-羟基化反应的培养基组成和转化条件进行优化.结果表明:优化后最佳培养基组分为葡萄糖30,g/L,玉米浆20,g/L,NaNO3 2,g/L,KH2PO4 1,g/L,K2HPO42,g/L,MgSO4 0.5,g/L,FeSO4 0.02,g/L,KCl 0.5,g/L;最适转化条件为接种量10%,初始pH7.5,摇瓶装量50 mL,转化温度28,℃,投料量0.2%,投料时间30,h,转化时间60,h,底物添加方式为底物超声粉碎后加4%甲醇和1.5%吐温80溶解.在此条件下,摇瓶转化率可达70%以上.

关键词：雷斯青霉 15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮

雷斯青霉15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮的发酵工艺优化

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化学与生物工程 2008年第3期25卷 41-44页

作者：段少军杜连祥高艳玲路福平天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室天津300457

利用雷斯青霉（Penicillium raistrickii）的特异性转化酶对甾体化合物左旋乙基甾烯双酮进行15a-位羟基化，制备了重要的激素药物中间体15a羟基左旋乙基甾烯双酮。以种龄、接种量、投料量、pH值控制、溶氧控制、投料和转化时间等影响因... 详细信息

利用雷斯青霉（Penicillium raistrickii）的特异性转化酶对甾体化合物左旋乙基甾烯双酮进行15a-位羟基化，制备了重要的激素药物中间体15a羟基左旋乙基甾烯双酮。以种龄、接种量、投料量、pH值控制、溶氧控制、投料和转化时间等影响因子为对象对其发酵罐二级发酵工艺进行了优化。确定0．2％投料量条件下最优发酵工艺条件为：种龄21h；接种量5％；0～27h，pH值7．5、溶氧40％；27～66h，pH值6．0、溶氧20％；投料时间第30h；转化时间42h。在此条件下，转化率可达65％以上，比优化前提高了11．4％，为药物中间体15a-羟基左旋乙基甾烯双酮的进一步扩大发酵转化以及工业化生产奠定了基础。

关键词：雷斯青霉 15a-羟基化左旋乙基甾烯双酮

高效甾体15α-羟化毕赤酵母重组菌的构建及高密度发酵研究

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高效甾体15α-羟化毕赤酵母重组菌的构建及高密度发酵研究

作者：曾玉龙天津科技大学

学位级别：硕士

15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成高效避孕药孕二烯酮的关键中间体。工业上用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)生产15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的工艺存在底物投料量低(2‰)、转化效率不高、废水处理压力大等缺点。为提高左旋... 详细信息

15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成高效避孕药孕二烯酮的关键中间体。工业上用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)生产15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的工艺存在底物投料量低(2‰)、转化效率不高、废水处理压力大等缺点。为提高左旋乙基甾烯双酮的投料量,建立更高效、绿色环保的转化体系,本课题选择毕赤酵母(GS115)作为表达宿主,构建高效的双酮15α-羟化反应体系。研究内容如下:(1)在毕赤酵母中过表达雷斯青霉15α-羟化酶基因PRH,获得重组菌株15134;为进一步提高底物双酮转化率和投料量,在异源表达PRH的基础上共表达酿酒酵母葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1,获得重组菌株Z15134;通过摇瓶和5 L发酵罐转化比较重组毕赤酵母菌株Z15134和15134的转化效率。(2)选择高效重组菌在5 L发酵罐中进行高密度发酵,监控菌体生长情况和底物的投料量。(3)对高密度发酵的最终产物进行液相分析;以摇瓶发酵菌体作对照,对上罐发酵的菌体进行转录组测序分析。结果显示:(1)重组菌Z15134和15134摇瓶双酮转化显示,在投料量为1‰的情况下,菌株Z15134底物完全转化时间缩短了12 h。(2)重组毕赤酵母Z15134和15134在5 L发酵罐投料量1‰情况下,重组菌Z15134底物转化效率明显高于对照菌15134。(3)重组菌Z15134进一步在5 L发酵罐中进行双酮转化,发酵时间为196 h,底物投料量最终为10‰,产物浓度为5.79±0.18 g/L,OD为276.8±1.39。(4)对上罐发酵和摇瓶发酵菌株Z15134进行转录组测序,进行差异表达基因GO和KEGG pathway功能富集分析,通过q RT-PCR定量对转录组测序结果进行验证准确。本文通过在毕赤酵母中共过表达雷斯青霉15α-羟化酶和酿酒酵母葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,获得高效重组毕赤酵母菌株Z15134,并利用高密度发酵成功建立了底物投料量提高400%的15α-羟双酮生产工艺。

关键词：左旋乙基甾烯双酮毕赤酵母高密度发酵转录组测序 15α-羟化酶

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雷斯青霉甾体15α-羟化酶基因的克隆鉴定

雷斯青霉甾体15α-羟化酶基因的克隆鉴定

作者：贾龙刚天津科技大学

学位级别：硕士

甾体激素类药物是临床上一类重要的药物,常用于治疗类风湿性关节炎、哮喘、心血管、抗肿瘤等疾病。甾体类药物孕二烯酮是新一代强效避孕药的主要成分之一,而15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成孕二烯酮的关键中间体。目前工业上主要采用... 详细信息

甾体激素类药物是临床上一类重要的药物,常用于治疗类风湿性关节炎、哮喘、心血管、抗肿瘤等疾病。甾体类药物孕二烯酮是新一代强效避孕药的主要成分之一,而15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成孕二烯酮的关键中间体。目前工业上主要采用丝状真菌雷斯青霉（Penicillium raistrickii）在左旋乙基甾烯双酮的C15位上特异引入羟基,但现有的工业生产工艺投料量偏低,从而限制了 C15α的转化效率。已有的研究表明参与雷斯青霉C15α甾体羟化反应的酶属于P450酶系,但编码该C15α羟化酶的基因尚不清楚,因此无法利用基因工程手段对生产菌种进行定向遗传改造。为了克隆和鉴定雷斯青霉的C15α羟化酶基因,本文开展了以下研究工作:（1）考察了雷斯青霉生产菌种C15α羟化活性在转录水平上受左旋乙基甾烯双酮的诱导;（2）根据该菌种转录组测序的基因表达信息,从预测的61个P450基因中选出15个候选C15α羟化酶CYP基因,利用qRT-PCR定量扩增考察了在甾体底物诱导与非诱导条件下候选基因的表达差异情况,最终确定了 12820和6138两个基因受甾体底物的高度诱导;（3）利用本课题组已建立的甾体羟化酶基因酵母功能筛选平台,构建了12820和6138基因的酿酒酵母表达载体和12820基因的毕赤酵母表达载体,获得了相应基因的酿酒酵母和毕赤酵母重组菌株;（4）甾体转化试验表明6138基因重组酵母菌对左旋乙基甾烯双酮没有转化活性,而12820基因的重组酿酒酵母菌株和重组毕赤酵母都能够转化底物左旋乙基甾烯双酮,生成15α-羟基左旋乙基甾烯双酮,这一结果表明12820为15α羟化酶基因,命名为PRH,该基因全长1865bp,包括5个内含子和6个外显子,开放阅读框长度为1563bp,预测编码520个氨基酸;（5）为了确定雷斯青霉菌种中是否存在其它C15α羟化酶基因,构建了 12820基因的定向敲除载体并探索建立雷斯青霉原生质体转化方法。雷斯青霉左旋乙基甾烯双酮C15α羟化酶基因的克隆和初步鉴定为阐述该酶的羟化反应分子机制奠定了良好基础,同时也为构建下一代高效甾体C15α羟化工程菌株提供了关键的基因资源。

关键词：雷斯青霉甾体C15α羟化酶基因 RNA转录组测序甾体微生物转化左旋乙基甾烯双酮

基于DES的高效甾体药物生物催化羟基化体系构建研究

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基于DES的高效甾体药物生物催化羟基化体系构建研究

作者：李康天津科技大学

学位级别：硕士

甾体化合物的微生物转化因其反应条件比较温和,立体选择性和区域选择性高,环境友好等特点在甾体药物的生产中起着举足轻重的作用,但甾体底物的水溶性差是限制微生物转化效率的关键问题。本文首次将低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents,D... 详细信息

甾体化合物的微生物转化因其反应条件比较温和,立体选择性和区域选择性高,环境友好等特点在甾体药物的生产中起着举足轻重的作用,但甾体底物的水溶性差是限制微生物转化效率的关键问题。本文首次将低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents,DESs）用于雷斯青霉对左旋乙基甾烯双酮的15α羟基化的过程,系统研究了 DES对雷斯青霉毒性及全细胞生物催化效率的影响。本论文选用以氯化胆碱（ChCl）为氢键受体,有机酸、醇和糖为氢键供体的13种的天然低共熔溶剂（NADES）,研究不同类型氢供体的DES对底物转化的影响,发现其对底物转化效率的影响顺序由小到大依次为有机酸＜糖＜醇。其中,在ChCl:Gly（1:2）中具有最好的底物转化率,可以达到82%,与对照相比,提高了 49%。进一步比较分析ChCl:Gly（1:2）,组成DES的相应组分及其混合物对于雷斯青霉催化羟基化效率的影响,发现转化率的提高与ChCl完全无关,与Gly混合后有所增加;但是在DES体系中,转化率明显的提高。通过糖代谢实验、胞外OD260和OD280检测以及底物在细胞内积累量系统考察DES对于雷斯青霉的细胞毒性。结果表明:ChCl:Gly、ChCl:Eg的浓度低于8%时毒性较低,对菌体代谢活性几乎没有影响;而含2%的ChCl:MA、ChCl:OA和ChCl:IM毒性较大,严重影响菌体的代谢活性;且DES的毒性随着其浓度的增加逐渐增大。通过测定底物在雷斯青霉细胞内的积累量,发现在ChCl:Gly-缓冲液体系中细胞内底物积累量是水相体系的2倍以上;同时,细胞外溶液OD 260和OD 280检测结果表明,在含ChCl:Gly的体系中,OD 280和OD 260的值明显高于对照组及其他的DES,说明ChCl:Gly的添加增加了细胞膜的通透性。此外,在转化末期,水相体系中的雷斯青霉的菌球形态基本消失,而DES体系中的雷斯青霉其菌球形态保持完整,该结果与含ChCl:Gly的体系表现出较高的生物转化率和较好的生物相容性结果一致。

关键词：雷斯青霉左旋乙基甾烯双酮全细胞生物转化低共熔溶剂甾体化合物生物相容

增加雷斯青霉15α–羟化酶基因拷贝数提高甾体转化效率

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天津科技大学学报 2019年第4期34卷 16-21,29页

作者：李雪龙李改谢东奇金鹏毛淑红王正祥刘晓光天津科技大学生物工程学院天津300457 天津科技大学化工与材料学院天津300457

孕二烯酮是第三代高效避孕药的主要成分.雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC10490催化甾体左旋乙基甾烯双酮的C15α–羟基化反应合成孕二烯酮的重要中间体C15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.为了提高现有生产菌种的转化效率,本文研究了... 详细信息

孕二烯酮是第三代高效避孕药的主要成分.雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC10490催化甾体左旋乙基甾烯双酮的C15α–羟基化反应合成孕二烯酮的重要中间体C15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.为了提高现有生产菌种的转化效率,本文研究了在雷斯青霉ATCC10490中增加甾体C15α–羟化酶基因(PRH)拷贝数对转化效率的影响.分别构建了PRH基因的诱导型和组成型过表达载体pPZP-p800-PRH和pPZP-TrpC-PRH,并通过同源重组的方法定点整合到雷斯青霉基因组.转化实验表明,在出发菌株中增加一个PRH基因拷贝显著提高了甾体左旋乙基甾烯双酮转化效率,重组菌PRH-P800和PRH-TrpC的摩尔转化率分别提高了13%和20%,同时转化时间均缩短了12h.

关键词：雷斯青霉孕二烯酮 15α–羟化酶左旋乙基甾烯双酮