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人尿激酶原工程细胞株 C L-11 G 细胞外源因子的检测

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军事医学科学院院刊 1999年第3期23卷 179-181,184页

作者：韩素文林建波俞炜源军事医学科学院生物工程研究所北京100071

目的：对工程细胞株的要求之一是不应被外源因子污染。因此有必要对表达人尿激酶原的工程细胞株ＣＬ１１Ｇ进行外源因子的检测。方法：用普通肉汤、改良马丁和硫乙醇酸盐三种培养基对ＣＬ１１Ｇ细胞进行培养，检查细菌和... 详细信息

目的：对工程细胞株的要求之一是不应被外源因子污染。因此有必要对表达人尿激酶原的工程细胞株ＣＬ１１Ｇ进行外源因子的检测。方法：用普通肉汤、改良马丁和硫乙醇酸盐三种培养基对ＣＬ１１Ｇ细胞进行培养，检查细菌和霉菌；用培养法、ＤＮＡ荧光染色法、单克隆抗体免疫荧光法及电镜检查支原体；用ＣＬ１１Ｇ细胞悬液分别接种乳小鼠、成年小鼠、豚鼠、家兔、鸡胚及５种细胞，检查有无内外源性病毒污染。结果：ＣＬ１１Ｇ细胞经上述几种方法检测均未发现有细菌、霉菌及支原体污染。接种的动物全部存活，无异常，５种细胞接种ＣＬ１１Ｇ细胞后细胞形态正常，无病变，红细胞吸附试验均为阴性。结论：人尿激酶原工程细胞株ＣＬ１１Ｇ细胞经多方检查，未发现细菌、霉菌、支原体及内外源性病毒污染，从细胞水平上讲是安全的，可以作为生产重组人尿激酶原溶栓药物的工程细胞株。

关键词： CL-11G细胞支原体尿激酶原工程细胞株

野生型组织型纤溶酶原激活剂工程细胞株生物学特性分析

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解放军医学杂志 1999年第4期24卷 293-295页

作者：徐秀英陈琳欧阳应斌刘士辉朱恒奇黄培堂黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所

组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）是体内丝氨酸类蛋白酶。它能激活纤维蛋白溶酶原生成纤溶酶，后者将不溶性的纤维蛋白降解为可溶性肽段，使血栓溶解，血管再通。而且由于它与纤维蛋白有高亲和力，只激活血栓表面纤溶酶原，溶解局部血... 详细信息

组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）是体内丝氨酸类蛋白酶。它能激活纤维蛋白溶酶原生成纤溶酶，后者将不溶性的纤维蛋白降解为可溶性肽段，使血栓溶解，血管再通。而且由于它与纤维蛋白有高亲和力，只激活血栓表面纤溶酶原，溶解局部血栓，因而引起全身出血倾向小。目前，...

关键词：野生型 t-PA 工程细胞株纤溶酶原激活剂

11G工程细胞株人尿激酶原(pro-UK)基因拷贝数的测定

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微生物学通报 1999年第3期26卷 162-165页

作者：韩素文张劲风俞伟源胡宝成军事医学科学院生物工程研究所蛋白质工程研究室北京100071 解放军大连医学高等专科学校大连116013

采用Southernblot和狭缝（Slotblot）杂交的方法，对高效表达人尿激酶原（pro-UK）的工程细胞──11G原代细胞及传134代后细胞含有的pro-UK基因拷贝数进行了测定。结果显示，11G工程细胞株内所含的pro-UK的拷贝数为100—200拷贝／细胞，... 详细信息

采用Southernblot和狭缝（Slotblot）杂交的方法，对高效表达人尿激酶原（pro-UK）的工程细胞──11G原代细胞及传134代后细胞含有的pro-UK基因拷贝数进行了测定。结果显示，11G工程细胞株内所含的pro-UK的拷贝数为100—200拷贝／细胞，传134代后其拷贝数基本不变，说明11G细胞株是稳定高表达pro-UK的工程细胞，符合WHO规定的关于重组DNA转化细胞用于生产的要求。

关键词：尿激酶原拷贝数工程细胞株杂交

单克隆接种/成像设备VIPS在CHO工程细胞株单克隆筛选中的应用

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中国生物制品学杂志 2023年第12期36卷 1497-1502页

作者：谢涛彭秀娥孙青张朝陈文烨张宽石药集团巨石生物制药有限公司石药集团新型药物制剂与辅料国家重点实验室河北石家庄050000

目的探讨应用单克隆接种/成像设备VIPS(Verified In-situ Plate Seeding)建立CHO工程细胞株单克隆筛选的方法。方法采用VIPS将稳定转染目的基因的细胞池Cell pool 1分别于含不同组合(共18种组合,编号1~18)及体积(100和200μL/孔)培养基... 详细信息

目的探讨应用单克隆接种/成像设备VIPS(Verified In-situ Plate Seeding)建立CHO工程细胞株单克隆筛选的方法。方法采用VIPS将稳定转染目的基因的细胞池Cell pool 1分别于含不同组合(共18种组合,编号1~18)及体积(100和200μL/孔)培养基的96孔板中进行单细胞接种,并进行单克隆源性追踪拍照,根据图像结果,计算单克隆接种率、克隆形成率、单克隆增殖速率,评价单克隆源性图像效果。通过稳定转染目的基因的细胞池Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4验证该方法的适用性。结果最适单克隆培养基为MediumⅡ,培养基体积为100μL/孔。最佳工艺条件下,Cell pool 1的单克隆接种率为80%,克隆形成率为83%,增殖速率较快,单克隆源性图像清晰。Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4在最佳工艺条件下,单克隆接种率均值为78%,克隆形成率均值为67%,增殖速率略有差异,细胞分裂过程图像均清晰。结论采用VIPS建立的CHO工程细胞株单克隆筛选方法可提高CHO工程细胞株的克隆形成率,且能够提供充分的单克隆源性证明。

关键词：单克隆接种/成像设备VIPS CHO细胞工程细胞株单克隆筛选单克隆源性

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反义RNA逆转耐药肝癌基因工程细胞株多药耐药性的实验研究

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中国现代医学杂志 2009年第19期19卷 2907-2910,2914页

作者：李波叶田李德华陈永兵张孟瑜贺凯冯春红陈星徐松波倪建彬罗亮夏先明泸州医学院附属第一医院肝胆外科四川泸州646000 泸州医学院附属第二医院中医外科四川泸州646000 成都地奥制药集团有限公司基因工程药物研究室四川成都610041 首都医科大学附属佑安医院肝胆外科北京100069

目的通过重组腺病毒表达出mdr1基因的反义RNA,观察反义RNA对人肝癌基因工程细胞株HepG2/R多药耐药性的逆转效应。方法利用真核表达载体构建可以稳定表达mdr1基因和P糖蛋白的肝癌基因工程细胞株HepG2/R,通过腺病毒载体AdEasy系统生成重... 详细信息

目的通过重组腺病毒表达出mdr1基因的反义RNA,观察反义RNA对人肝癌基因工程细胞株HepG2/R多药耐药性的逆转效应。方法利用真核表达载体构建可以稳定表达mdr1基因和P糖蛋白的肝癌基因工程细胞株HepG2/R,通过腺病毒载体AdEasy系统生成重组腺病毒pAd Easy-GFP-ASmdr1,将此病毒感染HepG2/R,用RT-PCR检测mdr1 mRNA的表达强度,流式细胞仪检测细胞膜P-糖蛋白的表达和柔红霉素的蓄积率,HepG2/R细胞对阿霉素的耐药性用MTT法检测。结果HepG2/R细胞感染重组腺病毒后,RT-PCR检测表明mdr1 mRNA表达下降,流式细胞仪检测证实P-gp表达下降和柔红霉素的蓄积率增加,MTT法表明HepG2/R细胞对阿霉素的IC50从25μg/mL下降到3μg/mL。结论反义RNA通过抑制mdr1mRNA和P-gp的表达。

关键词：多药耐药性多药耐药基因肝癌细胞株工程细胞株

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体工程细胞株生物学特性分析

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实验生物学报 1998年第2期31卷 111-116页

作者：陈琳徐秀英刘士辉朱恒奇黄培堂黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所北京100071

t-PA突变体工程细胞株FSGGI48形态与其亲代细胞CHO-dhfr相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压至5×10^(-6)mol/L时,少数细胞形态略变瘦长,但仍呈多角形,因此该工程细胞株形态正常。抗体中和抑制试验及纤维蛋白板80℃加热试验显示,FSGG... 详细信息

t-PA突变体工程细胞株FSGGI48形态与其亲代细胞CHO-dhfr相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压至5×10^(-6)mol/L时,少数细胞形态略变瘦长,但仍呈多角形,因此该工程细胞株形态正常。抗体中和抑制试验及纤维蛋白板80℃加热试验显示,FSGGI48细胞表达产物与st-PA的活性均能被抗t-PA抗体所抑制,而胰酶的活性则不被抑制,且二者在80℃加热的纤维蛋白板上均不产生溶解圈,胰酶则产生溶解圈,由此可知,该细胞株表达产物为特异的rt-PA产品。细胞无血清培养上清经FA-PA检测,亚克隆株表达水平为4000IU/10~6细胞/24h。分别测定冻存3个月后复苏和体外传代3个月以上细胞的表达水平,结果显示部分亚克隆细胞株表达水平下降,多数仍为3000-4000IU/10~6细胞/24h,说明细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的细胞表达产物均无致瘤性。支原体检查结果为阴性。染色体分析显示,FSGGI48细胞与其亲代细胞(CHO-dhfr细胞)染色体数目相同均为20条,但均有不同程度不同类型的畸变。CHO-dhfr细胞畸变率为6%。该工程细胞的畸变率为15%-18%,在允许范围内。结果证明,t-PA突变体细胞株FSGGI48为性能优良的工程细胞株。

关键词： t-PA 突变体工程细胞株生物学特性

基因工程抗CD20单抗定点整合CHO工程细胞株的构建

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基因工程抗CD20单抗定点整合CHO工程细胞株的构建

作者：段佳西华大学

学位级别：硕士

目的：非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma, NHL)是免疫系统最常见的恶性肿瘤,并且其发病率和死亡率逐年上升。人淋巴细胞分化抗原CD20是特异性表达于NHL患者B细胞的跨膜蛋白,在正常组织中不表达。因此,CD20是B细胞淋巴瘤治疗的理... 详细信息

目的：非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma, NHL)是免疫系统最常见的恶性肿瘤,并且其发病率和死亡率逐年上升。人淋巴细胞分化抗原CD20是特异性表达于NHL患者B细胞的跨膜蛋白,在正常组织中不表达。因此,CD20是B细胞淋巴瘤治疗的理想靶抗原。本课题的目的是构建抗CD20嵌合抗体真核表达载体,采用定点整合技术,使其在定点整合细胞株FRTCHO中表达,通过检测抗CD20单抗的表达及其生物学活性,筛选稳定、高表达抗CD20单抗CHO细胞株,为大规模工业化生产奠定基础。方法：(1)嵌合抗CD20单抗真核表达载体的构建：分别以32#-2, BF27-L, BF27-H质粒为模板,PCR扩增出目的片段sp163-Lv, κC-κT-CMV, sp163-Hv, Hc-Fc;通过overlapPCR将目的片段连接形成sp163-Lv-KC-KT-CMV和sp163-Hv-Hc-Fc。经HindⅢ、EcoRV双酶切sp163-Lv-κC-κT-CMV,将其定向克隆到真核表达载体pcDNA5/FRT中,构建出pcDNA5/FRT-sp163-Lv-κC-κT-CMV。sp163-Hv-Hc-Fc经EcoR V、Xho I双酶切,然后定向克隆到验证为阳性的pcDNA5/FRT-sp 163-Lv-κC-κT-CMV载体中,经过鉴定得到阳性重组子pcDNA5/FRT-sp 163-Lv-κC-κT-CMV-sp 163-Hv-Hc-Fc.(2)定点整合FRTCHO细胞株的构建：线性化pFRT/lacZeo-dhfr质粒在阳离子脂质体介导下,转染CHO/dhfr细胞,然后用Zeocin抗生素筛选抗性细胞株,通过β-Gal检测试剂盒筛选β-半乳糖苷酶表达量较高的细胞克隆。MTX梯度加压,β-Gal检测筛选β-半乳糖苷酶表达水平最高的定点整合单克隆细胞株FRTCHO。(3)稳定、高表达抗CD20单抗CHO细胞株的构建：将阳性重组表达载体pcDNA5/FRT-sp163-Lv-KC-KT-CMV-sp163-Hv-Hc-Fc与pOG44载体(按照1：9的比例混合后),在阳离子脂质体介导下共转染FRTCHO工程细胞,用潮霉素B筛选抗性细胞株,通过Elisa初步筛选目的蛋白表达量较高的抗性克隆,然后进行Zeocin致敏试验,MT X梯度加压,Elisa检测筛选目的蛋白表达量最高的定点整合表达抗CD20单抗的细胞克隆CHO-CD20,再经无血清驯化培养得到悬浮工程细胞株,放大培养,采用ProteinA亲和层析柱纯化上清,紫外吸收法检测蛋白表达量。(4)目的蛋白的质量研究：采用SDS-PAGE和SEC-HPLC鉴定目的蛋白的分子量和纯度,最后采用活细胞间接免疫荧光法(FACS)口CDC法分析检测表达产物的生物学功能。结果：(1)本课题采用PCR和overlapPCR技术成功获得目的基因片段,并借助定向克隆技术,成功构建pcDNA5/FRT-sp163-Lv-KC-KT-CMV-sp163-Hv-Hc-Fc定点整合真核表达载体。(2)线性化pFRT/lacZeo-dhfr质粒转染CHO/dhfr细胞后,经Zeocin抗生素筛选,β-Gal检测试剂盒检测各孔β-半乳糖苷酶表达量,其中编号为12的细胞孔β-半乳糖苷酶表达量最高,对该孔细胞经过有限稀释法得到20个单克隆细胞株,然后进行MTX梯度加压,通过检测β-半乳糖苷酶表达水平,发现经过500nM加压后,12-A15的β-半乳糖昔酶的表达水平最高,因此,选用12-A15细胞株进行工程细胞构建实验。(3)载体pcDNA5/FRT-sp163-Lv-κC-κT-CMV-sp163-Hv-Hc-Fc与pOG44共转染FRTCHO工程细胞后,经潮霉素B筛选,Elisa检测各孔目的蛋白表达量,其中编号为CD9的细胞孔目的蛋白表达量最高,然后经过有限稀释法培养得到31个单克隆细胞株,Elisa检测目的蛋白表达量,得到5株蛋白表达量较高的定点整合表达抗CD20单抗的细胞株CHO-CD20,分别为CD9-6, CD9-11, CD9-17, CD9-20, CD9-27。经过Zeocin致敏试验,然后进行MTX梯度加压,Elisa筛选,最终得到编号为CD9-17的目的蛋白表达量最高,达到155mg/ml。经过无血清驯化放大培养,ProteinA亲和层析柱纯化上清,洗脱后紫外分光光度法检测得到蛋白表达量为113mg/ml。(4)经过SDS-PAGE电泳得到目的蛋白分子量非还原条件下约为150kDa,还原条件下重链和轻链分别约为50kDa和27kDa;SEC-HPLC检测目的蛋白纯度达到96%;FACS检测表达抗体的抗原结合能力与对照品基本一致;CDC法检测得到目的抗体的半数有效浓度EC50值为2388ng/m

关键词：恶性淋巴瘤抗CD20单抗定点整合工程细胞株

GPCRs-Gi1α融合基因及CHO-pcDNA3.1（+）-GPR91工程细胞株的构建

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GPCRs-Gi1α融合基因及CHO-pcDNA3.1（+）-GPR91工程细胞株的构建

作者：陈曦安徽医科大学

学位级别：硕士

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）是一大类通过G蛋白介导其生物效应的膜受体总称，也是最大的膜受体家族，其成员均参与了广泛的病理生理过程，GPCRs因介导细胞间通讯和细胞内信息传递而具有重要的生理功能和病理... 详细信息

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）是一大类通过G蛋白介导其生物效应的膜受体总称，也是最大的膜受体家族，其成员均参与了广泛的病理生理过程，GPCRs因介导细胞间通讯和细胞内信息传递而具有重要的生理功能和病理意义，因此GPCRs也一直是新药发现及研究的最重要靶点。迄今为止，以GPCRs为靶点的药物数量约占了市售药物的40%-50%。在总数为900个左右的GPCRs中，约有100个配基与功能均属未知的GPCR，被称为孤儿GPCRs（orphan GPCRs, oGPCRs）。由于GPCRs在病理生理以及药物研究方面的重要作用，确认oGPCRs的内源性配基及其作用机制已经成为了研究GPCRs的重要课题。对oGPCRs的特异性配基的发现和研究，被形象地称作称作“去孤儿化”。 oGPCRs的一旦成功实现了“去孤儿化”，对于相关疾病发病机制的阐明以及新药的研究发现有着重要的意义。为了能更快捷有效地对GPCRs的内源性配基及其作用机制进行探讨，我们设计了相应的研究课题。本研究主要包括两部分：第一部分是利用GPCR与G蛋白α亚基偶联的特性，将几个GPCR分子与G蛋白α亚基进行基因融合，为实现GPCR的配基筛选做准备;第二部分则是是构建了CHO-pcDNA3.1(+)-GPR91工程细胞株，为深入研究GPR91的作用机制奠定了基础。在本实验第一部分中，我们分别将GPR91，GPR119，GPR84与Gi1进行基因融合。首先通过分子克隆得到了其全长序列，之后与pMD18-T载体相连接构建重组质粒，再以重组质粒为模板，通过重叠延伸PCR技术将GPCRs与Gi1序列进行融合。将融合基因克隆到供体质粒pFASTBac1中得到重组质粒pFASTBac1-GPCRs-Gi1，而后转化大肠杆菌*** DH10Bac感受态，使含有融合基因的重组供体质粒实现位点的特异性转座，得到重组杆状病毒穿梭质粒pBacmid-GPCRs-Gi1。在本实验第二部分中，我们通过将GPR91全长表达序列与载体pcDNA3.1(+)相连接，再将其转入CHO细胞中，经筛选得到了阳性克隆，成功构建了CHO-pcDNA3.1(+)-GPR91工程细胞株。通过RT-PCR及Western-blot的鉴定表明，我们所构建的工程细胞株CHO-pcDNA3.1(+)-GPR91能够表达GPR91的mRNA及相应蛋白质。除此之外，我们还使用了GPR91内源性配体琥珀酸盐来刺激工程细胞株，利用荧光探针，通过激光共聚焦成像系统观察到其细胞内Ca2+浓度发生了明显改变，表明工程细胞株能够被受体激动剂所刺激，可以用于对GPR91特异性激动剂以及拮抗剂的筛选研究。

关键词： G蛋白偶联受体 G蛋白亚基融合基因 GPR91 工程细胞株

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人红细胞生成素工程细胞株的特性鉴定

生物技术 2004年第2期14卷 22-24页

作者：胡云龙陈松徐梅高坤林世康刁振宇张双全南京师范大学生命科学院江苏南京210097 南京华欣药业生物工程有限公司江苏南京210002

目的 :为了对人红细胞生成素工程细胞株 (F10 - 6 )进行特性鉴定。方法 :将人红细胞生成素基因构建的重组表达质粒pCDB与标志质粒pSV -dhfr共转染CHO -dhfr- 细胞中 ,经氨甲喋呤加压筛选和亚克隆挑选 ,获得高效稳定表达EPO的工程细胞株... 详细信息

目的 :为了对人红细胞生成素工程细胞株 (F10 - 6 )进行特性鉴定。方法 :将人红细胞生成素基因构建的重组表达质粒pCDB与标志质粒pSV -dhfr共转染CHO -dhfr- 细胞中 ,经氨甲喋呤加压筛选和亚克隆挑选 ,获得高效稳定表达EPO的工程细胞株并对其进行鉴定。结果 :实验结果表明 ,工程细胞株无细菌、支原体、真菌和病毒污染 ;并无致瘤性 ;染色体数目不变 ;连续传代5 0次和三次冻存复苏后 ,细胞表达稳定。结论 :该工程细胞株可用于工业化生产。

关键词：人红细胞生成素工程细胞株基因重组表达质粒