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山西农业科学 2017年第10期45卷 1691-1694页

作者：邰苗苗吴小叶杜海燕孟繁荣张春香任有蛇山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 朔州市平鲁区畜牧兽医局山西平鲁036800

通过对9月龄黑山羊附睾头细胞进行不同浓度、不同时间新霉素和嘌呤霉素的处理,收集各个时间的细胞并进行计数,旨在研究山羊附睾头细胞对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度。结果显示,山羊附睾头细胞在转染时对新霉素和嘌呤霉素适宜的质量浓度... 详细信息

通过对9月龄黑山羊附睾头细胞进行不同浓度、不同时间新霉素和嘌呤霉素的处理,收集各个时间的细胞并进行计数,旨在研究山羊附睾头细胞对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度。结果显示,山羊附睾头细胞在转染时对新霉素和嘌呤霉素适宜的质量浓度分别为400,2μg/m L;试验细胞计数结果与细胞生长状态相一致,山羊附睾细胞与其他哺乳动物不同组织器官对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度基本一致。研究结果可为后期基因敲除和过表达载体转染进山羊附睾头细胞时抗性基因浓度的确定提供了参考,也为后期基因功能的研究奠定了基础。

关键词：山羊附睾头细胞新霉素嘌呤霉素

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MEK通路抑制剂及AR敲除对山羊附睾头细胞gBD104a表达的影响

MEK通路抑制剂及AR敲除对山羊附睾头细胞gBD104a表达的影响

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作者：郭永娟山西农业大学

学位级别：硕士

山羊β-防御素104a(gBD104a)被定位于山羊附睾头上皮细胞、山羊精子头部前端顶体及精子中部的线粒体上,其可能在精子的成熟及获能等生理过程发挥重要作用。但是,目前关于gBD104a的表达调控机制尚不清楚,因此,本试验旨在研究MEK抑制剂及A... 详细信息

山羊β-防御素104a(gBD104a)被定位于山羊附睾头上皮细胞、山羊精子头部前端顶体及精子中部的线粒体上,其可能在精子的成熟及获能等生理过程发挥重要作用。但是,目前关于gBD104a的表达调控机制尚不清楚,因此,本试验旨在研究MEK抑制剂及AR基因敲除对山羊附睾头细胞中gBD104a表达的影响。取15日龄羔羊附睾头组织剪成小块,用胰蛋白酶消化后进行培养,建立附睾头细胞系。通过对体外培养的山羊附睾头细胞培养液中分别添加不同浓度的17β-雌二醇(E2,0.001 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)、二氢睾酮(DHT,10ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL、320 ng/mL)及 MEK 信号通路抑制剂 PD0325901(1.0μM、2.5 μM、5.0 μM、10.0 μμM),处理48 h后用流式细胞仪检测附睾头细胞的活细胞数和凋亡细胞数。同时,收集各处理组的细胞,用荧光定量PCR和Western blotting技术检测gBD104a的mRNA和蛋白表达情况。应用CRISPR/Cas9系统构建了 3个AR基因敲除载体。通过细胞转染,检测敲除AR基因后gBD104a的表达情况。研究结果如下:(1)在附睾头细胞培养液中添加0.1 ng/mL E2处理48 h后,山羊附睾头细胞中gBD104a mRNA的表达量显著高于空白对照组和添加100 ng/mL E2组(P附睾头细胞培养液中添加160ng/mLDHT处理48h后,山羊附睾头细胞中gBD104a mRNA的表达量显著高于空白对照组和添加10ng/mL、20ng/mL和40ng/mLDHT组(P附睾头细胞培养液中分别添加不同浓度的PD0325901后,山羊附睾头细胞中gBD104amRNA的表达量显著低于添加0.1 ng/mL E2组gBD104a的表达量;添加0.1 ng/mLE2和1.0 μM PD0325901时,gBD104amRNA和蛋白的表达量显著低于对照组(P附睾头细胞培养液中添加160 ng/mL DHT和5.0 μM PD0325901后,山羊附睾头细胞中gBD104a mRNA和蛋白的表达量均显著高于其它组(P附睾头细胞培养液中分别添加不同浓度的PD0325901后,山羊附睾头细胞中活细胞的百分率显著低于添加0.1 ng/mL E2组,凋亡率显著高于空白对照组和添加0.1 ng/mL E2组(P附睾头细胞培养液中分别添加不同浓度的PD0325901时,山羊附睾头细胞中活细胞的百分率显著低于空白对照组和添加160ng/mLDHT组,凋亡率显著高于只添加160ng/mLDHT组(P山羊附睾头细胞,通过荧光定量PCR和Western blotting检测细胞中AR的表达量,筛选出敲除效果最佳的载体—pCas9/gRNA1-AR-1452。用 pCas9/gRNA1-AR-1452 敲除山羊附睾头细胞AR基因后,gBD104a mRNA和蛋白的表达量显著低于对照组(P山羊附睾头细胞中gBD104a的表达。E2和DHT通过MEK信号通路调节gBD104a的表达,而且雄激素—雄激素受体途径参与调节gBD104a的表达。

关键词：山羊附睾头细胞 gBD104a E2 DHT PD0325901 R敲除

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山羊gDB124沉默慢病毒载体的构建和稳转系的建立

山羊gDB124沉默慢病毒载体的构建和稳转系的建立

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作者：邰苗苗山西农业大学

学位级别：硕士

依据课题组对山羊附睾头和睾丸组织进行高通量转录组测序后差异基因分析后发现,山羊β-防御素124（Goatbeta-defensin 124,gDB124）在太行山羊附睾头组织大量表达,且在附睾头上皮细胞游离缘的纤毛层和管腔液有强阳性信号,推测其可能与... 详细信息

依据课题组对山羊附睾头和睾丸组织进行高通量转录组测序后差异基因分析后发现,山羊β-防御素124（Goatbeta-defensin 124,gDB124）在太行山羊附睾头组织大量表达,且在附睾头上皮细胞游离缘的纤毛层和管腔液有强阳性信号,推测其可能与精子的成熟及获能等有关。但是,目前关于gDB124与精子成熟间的作用机制尚不清楚。因此,本试验将通过建立gDB124稳定沉默细胞系,为gDB124沉默山羊附睾头细胞与未成熟精子共孵育的功能研究及gDB124沉默后下游信号通路的研究奠定基础。本试验通过胰蛋白酶消化法对剪碎的太行山羊附睾头组织进行培养,建立太行山羊附睾头细胞系;构建三个沉默gDB124慢病毒载体,分别为LV10-gDBB12-51、LV10-gDBB12-104、LV10-gDB124-161:用LV10-NC慢病毒阴性对照载体对太行山羊附睾头细胞最佳MOI值进行筛选;将三个慢病毒载体以最佳MOI值分别转染太行山羊附睾头细胞,通过荧光观察和荧光定量检测gDB124的mRNA表达情况,筛选出效率高的慢病毒载体;通过终浓度为0,1,2.5,5,7.5,10μg/mL嘌呤霉素对太行山羊附睾头细胞进行处理,72h后依据活细胞数确认嘌呤霉素最低致死终浓度;用嘌呤霉素对已使用慢病毒沉默gDB124的阳性细胞进行筛选,并进行多次传代培养,冻存和复苏,建立稳定沉默gDB124细胞系。研究结果如下:（1）成功建立了太行山羊附睾头细胞系,培养的山羊附睾头细胞生长趋势整体呈“S”型,符合细胞生长规律,能够稳定传代,且生长状态良好;（2）构建的三个沉默gDB124慢病毒载体分别为:LV10-gDB124-51、LV10-gDB124-104、LV10-gDB124-161,测序验证shRNA序列无误,经过慢病毒包装后滴度分别为 1×108TU/mL、3×108TU/mL、1×108TU/mL;（3）LV10-NC慢病毒载体对太行山羊附睾头细胞感染的最适MOI值为1。通过QRT-PCR筛选出干扰效果最好为LV10-gDB124-51和LV10-gDB124-161两种载体等量共转染（P＜0.0005）,沉默效率达到50%;（4）太行山羊附睾头细胞对嘌呤霉素处理后细胞耐受浓度为终浓度1 μg/mL;（5）LV10-gDB124-51和LV10-gDB124-161慢病毒侵染太行山羊附睾头细胞后,获得了能够稳定传代且表达荧光的阳性细胞。综上所述,本研究成功建立了太行山羊附睾头细胞系,构建了三个沉默gDB124的慢病毒载体,并且筛选出沉默效率最高的载体,成功建立了稳定沉默gDB124细胞系。

关键词： gDB124 基因沉默慢病毒稳转系山羊附睾头细胞

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