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山羊支原体山羊肺炎亚种MCCG-0521乳酸脱氢酶基因的克隆表达及其编码氨基酸的生物学分析

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动物医学进展 2023年第2期44卷 35-40页

作者：刘威蒋鹏程杨克礼袁芳艳周丹娜刘泽文高婷郭锐孙裴田永祥湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/畜禽病原微生物学湖北省重点实验室湖北武汉430064 安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036

旨在获得山羊支原体山羊肺炎亚种MCCG-0521乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LDH)的蛋白表达产物,分析其编码氨基酸的生物学特性,为进一步研究LDH蛋白的功能奠定基础。试验完成了LDH基因的克隆和密码子改造,成功将LDH基因中473、761... 详细信息

旨在获得山羊支原体山羊肺炎亚种MCCG-0521乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LDH)的蛋白表达产物,分析其编码氨基酸的生物学特性,为进一步研究LDH蛋白的功能奠定基础。试验完成了LDH基因的克隆和密码子改造,成功将LDH基因中473、761、779 nt处的A突变为G,使改造后的LDH基因能在大肠埃希氏菌Rosetta中正确表达。SDS-PAGE电泳结果显示,IPTG诱导目的蛋白表达后获得一条大小约34 ku的蛋白条带,Western blot结果表明获得的原核表达产物可与抗6×His tag的单克隆抗体发生特异性反应,研究采用DNAStar Protean模块分析了LDH的二级结构、蛋白骨架柔性区域和可能的B细胞抗原优势表位,为进一步研究其功能奠定了基础。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种 MCCG-0521 乳酸脱氢酶密码子改造二级结构

山羊支原体山羊肺炎亚种重组酶聚合酶扩增技术的建立

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动物医学进展 2023年第9期44卷 38-43页

作者：豆玲周峰张莉王志宇康文彪甘肃省动物疫病预防控制中心甘肃兰州730046 英科新创(苏州)生物科技有限公司江苏苏州215000

为检测山羊传染性胸膜肺炎,选择Mccp-arcA假基因作为靶基因,用Primer 3 plus设计筛选生物素标记的特异引物和荧光素标记的探针,将双标记扩增产物结合到核酸检测试纸条,通过优化反应温度和时间,建立了一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的... 详细信息

为检测山羊传染性胸膜肺炎,选择Mccp-arcA假基因作为靶基因,用Primer 3 plus设计筛选生物素标记的特异引物和荧光素标记的探针,将双标记扩增产物结合到核酸检测试纸条,通过优化反应温度和时间,建立了一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的重组酶聚合酶扩增技术,对其灵敏度、重复性、准确性和特异性进行了试验,并初步用于临床样品的检测。结果显示,山羊传染性胸膜肺炎核酸阳性样品能够在核酸检测试纸条上显示阳性条带,阴性样品无条带。试验具有良好的重复性和敏感性(达到10 copies/μL)。用建立的重组酶聚合酶扩增技术与普通PCR方法同时检测疑似山羊传染性胸膜肺炎8份样品,结果均为3份阳性和5份阴性,符合率100%。该检测方法适用于山羊传染性胸膜肺炎的快速诊断,为Mccp的快速检测提供了新的技术。

关键词：重组酶聚合酶扩增方法试纸条山羊支原体山羊肺炎亚种山羊传染性胸膜肺炎

基于可见光测定的山羊支原体山羊肺炎亚种抗原定量

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生物工程学报 2023年第12期39卷 4874-4886页

作者：葛家振高鹏程田彤彤吴晓妮李倩倩田可昕宋国栋郑福英储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)是山羊传染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)的病原,可用灭活疫苗和荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)间接血凝试剂进行预防和血清学检测,但高昂的培养成本和复杂的抗原定量一直困扰着生产人员。为解决生产实际中出现的这些问题,本研究基于Mccp代谢组学的前期理论基础,通过改变初始pH值的方法,初步筛选出初始p H值为7.8的可以同时提高2种抗原产量的糖发酵培养基。利用紫外可吸收光谱可识别酚红,以及十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)可与阴离子荚膜多糖结合的理论依据,建立了利用紫外光谱分析Mccp达到的培养阶段,以及利用CTAB沉淀法相对定量发酵液荚膜多糖抗原产量的方法。通过紫外图谱观察的方法可对应Mccp生长曲线进行指导生产,大大节省传统颜色变化单位(color change unit,CCU)法的监测时间,提高了原肉眼观察方法的精确度。建立的CTAB沉淀法可在5 h内完成对CPS含量的监测,与传统的差值法相比大大缩短了时间,并且其准确度得到苯酚-硫酸法的验证。本研究优化的一种培养基和建立的两种相关性比较方法,可有效降低Mccp生产成本,提高生产效率,这些方法已在本实验室的研究阶段得到应用,为进一步改进CCPP灭活疫苗和荚膜多糖的生产工艺以及快速定量提供了实验数据。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种改良培养基荚膜多糖紫外图谱 CTAB沉淀法

山羊支原体山羊肺炎亚种黏附山羊气管上皮细胞间接免疫荧光检测方法的建立

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中国兽医科学 2021年第9期51卷 1090-1096页

作者：蔡亚婷郝华芳张晓亮袁婷陈胜利颜新敏马丽娜储岳峰孙延鸣石河子大学动物科技学院新疆石河子832001 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

以山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)M1801株和山羊气管上皮细胞(GTC)为研究对象,通过优化Mccp接种滴度、孵育时间及一抗、二抗工作浓度,建立Mccp黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法。确定Mccp的最适黏附滴度为1.5×10^(7)~7.0×10^(7)copi... 详细信息

以山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)M1801株和山羊气管上皮细胞(GTC)为研究对象,通过优化Mccp接种滴度、孵育时间及一抗、二抗工作浓度,建立Mccp黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法。确定Mccp的最适黏附滴度为1.5×10^(7)~7.0×10^(7)copies/μL,黏附时间为2 h,一抗最适稀释度为1∶100,二抗最适稀释度为1∶100。用本试验建立的间接免疫荧光方法证实Mccp人工感染山羊血清可阻断其黏附GTC的作用,为Mccp感染的检测、黏附因子的鉴定及黏附机制的研究提供了有效技术手段。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种黏附间接免疫荧光山羊气管上皮细胞

山羊支原体山羊肺炎亚种湖北株的鉴定及其外膜蛋白的免疫原性研究

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畜牧兽医学报 2011年第4期42卷 593-599页

作者：赵萍郭晗贺英高鹏程张念章逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

从湖北某地山羊肺脏中分离支原体,经多次克隆纯化后进行生化试验、显微镜观察、PCR及酶切分析、基因特征鉴定以及用动物致病性试验对该菌株进行了鉴定,命名为GH2,进一步通过免疫印迹对GH2株外膜蛋白及GH2株全菌蛋白免疫原性进行分析,并... 详细信息

从湖北某地山羊肺脏中分离支原体,经多次克隆纯化后进行生化试验、显微镜观察、PCR及酶切分析、基因特征鉴定以及用动物致病性试验对该菌株进行了鉴定,命名为GH2,进一步通过免疫印迹对GH2株外膜蛋白及GH2株全菌蛋白免疫原性进行分析,并用抗Y98血清和抗PG3血清进行比较,筛选GH2株特异性的外膜蛋白,结果表明GH2株为山羊支原体山羊肺炎亚种,存在于GH2外膜蛋白中的相对分子质量大约为60和49.7ku的蛋白可能是其主要的免疫原性蛋白,也是GH2株区别于丝状支原体山羊亚种标准株PG3和绵羊肺炎支原体标准株的主要特异性抗原。这一结果为山羊支原体山羊肺炎亚种的诊断和疫苗研制提供了良好的理论基础。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种鉴定外膜蛋白免疫原性

山羊支原体山羊肺炎亚种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

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中国兽医科学 2018年第4期48卷 403-411页

作者：朱建勋赵萍郝华芳陈胜利翟肖辉刘永生储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 甘肃煤田地质局一三三队甘肃白银730913

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp．capripneumoniae，Mccp）．选择MccparcD基因为靶序列，设计特异性引物和探针，建立并优化反应体系，以Mcep和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为... 详细信息

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp．capripneumoniae，Mccp）．选择MccparcD基因为靶序列，设计特异性引物和探针，建立并优化反应体系，以Mcep和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为模板，进行普通PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测．并对该方法的敏感性和重复性进行评估。同时利用该方法对68份山羊临床样本进行检测。结果显示，仅Mccp有扩增条带（185bp）和明显的荧光扩增信号（Ct值为21．93），其余供试菌株没有扩增条带，且表现出微弱的荧光扩增信号（Ct值均大于31）。普通PCR检测的灵敏度为5．96×10^4copies／pL，而TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的灵敏度为5．96copies／pL。Ct值在组内和组间重复的变异系数均小于1％。对68份山羊临床样本进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测，结果有2份为Mccp阳性样本．阳性率为2.94％。本研究建立了一种特异、敏感、稳定可靠的Mccp TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，可用于Mccp的快速诊断和定量检测,为山羊传染性胸膜肺炎的防控提供了有效的技术手段。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种 TaqMan探针实时荧光定量PCR 特异性敏感性

山羊支原体山羊肺炎亚种SYBR GreenⅠqRT-PCR检测方法的建立

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农业生物技术学报 2018年第2期26卷 339-345页

作者：林裕胜江锦秀张靖鹏游伟胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所

山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp）是山羊传染性胸膜肺炎（contagious capri pleuropneumonia,CCPP）的病原。本研究根据GenBank公布的Mccp F38株（No.LN515398.1）arcD（MCCPF38;0114）基因序列设计1对特异性引物,建立了针对Mccp的SYBR GreenⅠ qRT-PCR方法。结果显示,该方法能特异性检测Mccp,与丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp.capri,Mmc）、副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS）、绵羊肺炎支原体（Myplasma ovipenumoniae,Mo）、羊传染性脓疱毒（Orf virus,ORFV）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）、大肠杆菌（Escherichia coli,Ec）等羊常见病原均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性;该方法的最低检测限为279 copies/μL,组内和组间变异系数均小于1%,说明该方法灵敏度高、重复性好。本研究建立的检测Mccp arcD基因的SYBR GreenⅠ qRT-PCR方法为CCPP的临床早期诊断及定量分析Mccp感染水平提供了更准确的方法。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种 SYBR GreenⅠ qRT-PCR

山羊支原体山羊肺炎亚种特异性分子检测靶标的鉴定和应用

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中国兽医科学 2020年第10期50卷 1257-1262页

作者：吴娅琴刘保红袁婷陈芙蔡亚婷郝华芳陈胜利马丽娜刘永生颜新敏储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 石河子大学新疆石河子832003

本文旨在筛选出新的山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)特异性分子诊断靶标。首先通过全基因组本地BLASTp方法筛选得到Mccp理论上特异的蛋白基因序列,经BLASTn验证、优选特异性基因92.1作为候... 详细信息

本文旨在筛选出新的山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)特异性分子诊断靶标。首先通过全基因组本地BLASTp方法筛选得到Mccp理论上特异的蛋白基因序列,经BLASTn验证、优选特异性基因92.1作为候选靶标,设计引物92.1F/R,采用普通PCR体系检测4株Mccp(1801、1601、1309F、Zly-14)和7种其他支原体基因组DNA,包括无乳支原体(Ma)PG2、丝状支原体山羊亚种(Mmc)PG3、Mmc YG(前称丝状支原体丝状亚种大菌落型,MmmLC)、绵羊肺炎支原体(Mo)Y98、山羊支原体山羊亚种(Mcc)Ckid、牛支原体(Mb)08M、李奇氏支原体(Ml)PG50,并检测Mccp、Mo、Mmc人工感染羊试验样本DNA,评估该体系的特异性。结果表明92.1F/R引物只能从Mccp菌株及其感染试验样本中扩增出509 bp目的条带,证实该引物可用于检测Mccp,92.1序列可作为CCPP新的核酸诊断靶标,为CCPP诊断和实验室研究提供了一种新的分子标记。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种分子诊断靶标引物诊断

基于0507蛋白的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体间接ELISA检测方法的建立

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动物医学进展 2023年第9期44卷 1-5页

作者：李梦磊张锐铮于皓同张琪许信刚西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

为建立山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)抗体检测方法,对Mccp的0507基因进行克隆与载体构建,通过原核表达技术制备重组0507蛋白,建立Mccp抗体间接ELISA检测方法,验证该方法的特异性、灵敏性... 详细信息

为建立山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)抗体检测方法,对Mccp的0507基因进行克隆与载体构建,通过原核表达技术制备重组0507蛋白,建立Mccp抗体间接ELISA检测方法,验证该方法的特异性、灵敏性与重复性,并对临床收集的血清样品进行检测。结果显示,重组0507蛋白大小为39 ku,Western blot证明重组0507蛋白具有良好的反应原性;建立的ELISA检测方法抗原包被量为3μg/mL,血清稀释倍数为1∶200,酶标二抗稀释倍数为1∶2500,阴阳临界值为0.221。用该方法对山羊流产衣原体、立克次氏体与牛支原体的阳性血清进行检测,结果均为阴性;Mccp阳性血清最大稀释倍数为1024倍;批内、批间变异系数均小于10%。对陕西省部分羊场收集到的282份血清进行检测,Mccp阳性率为13.1%。该研究建立了一种检测Mccp抗体间接ELISA检测方法,为Mccp的实验室诊断和流行病学调查提供了技术支持。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种 0507蛋白酶联免疫吸附试验抗体检测