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中国兽医学报 2023年第5期43卷 1035-1043页

作者：王钰锟李碧筠张义语丁文飞王磊唐雪宋帅飞姚慧黄德利徐德军赵中权西南大学动物科学技术学院重庆400715 重庆市大足区农业技术服务中心重庆402360

为探究miRNA-148a-3p在山羊卵巢颗粒细胞中的作用,通过过表达或抑制miRNA-148a-3p、qRT-PCR、Western blot、流式细胞术、ELISA等方法,探究miR-148a-3p对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡、自噬及类固醇激素分泌的影响。结果发现,过表达miR-148a... 详细信息

为探究miRNA-148a-3p在山羊卵巢颗粒细胞中的作用,通过过表达或抑制miRNA-148a-3p、qRT-PCR、Western blot、流式细胞术、ELISA等方法,探究miR-148a-3p对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡、自噬及类固醇激素分泌的影响。结果发现,过表达miR-148a-3p显著促进卵巢颗粒细胞增殖和PCNA表达,抑制miR-148a-3p显著抑制卵巢颗粒细胞增殖和PCNA表达。过表达miR-148a-3p抑制卵巢颗粒细胞凋亡,极显著下调细胞凋亡率,显著上调Bcl-2/Bax的mRNA和蛋白比值,抑制miR-148a-3p促进卵巢颗粒细胞凋亡。过表达miR-148a-3p显著促进卵巢颗粒细胞自噬,上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,抑制miR-148a-3p上调p62表达。过表达miR-148a-3p显著促进卵巢颗粒细胞孕酮分泌,并上调3β-HSD、StAR、CYP11A1的mRNA和蛋白表达。虽然抑制miR-148a-3p下调孕酮水平,但对3β-HSD、StAR、CYP11A1及CYP19A1的mRNA和蛋白表达无显著性影响。结果表明,miR-148a-3p可促进卵巢颗粒细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导自噬并刺激孕酮的合成。

关键词： miR-148a-3p 山羊卵巢颗粒细胞增殖凋亡自噬孕酮

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miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响

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畜牧兽医学报 2022年第2期53卷 436-446页

作者：王磊何莉娜唐雪李碧筠黄思艺王钰锟徐德军赵中权西南大学动物科学技术学院重庆400715

旨在探究miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响及作用机制。本研究选取健康的3~4月龄大足黑山羊母羊,收集卵巢颗粒细胞,利用miR-495-3p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)构建过表达和抑制模型,通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期,EL... 详细信息

旨在探究miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响及作用机制。本研究选取健康的3~4月龄大足黑山羊母羊,收集卵巢颗粒细胞,利用miR-495-3p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)构建过表达和抑制模型,通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期,ELISA分析颗粒细胞的雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌,采用qRT-RCR、Western blot检测细胞凋亡、增殖、周期及类固醇激素合成相关基因的mRNA和蛋白的表达水平。结果显示,miR-495-3p显著促进卵巢颗粒细胞凋亡(P细胞增殖活力,显著降低PCNA的表达(P细胞百分比(P细胞周期相关基因CDK4(P颗粒细胞E2和P4分泌;过表达miR-495-3p显著提高3β-HSD(P颗粒细胞凋亡,抑制增殖,将细胞周期阻滞在G2/M期,刺激类固醇激素分泌,从而影响山羊卵泡的发育。

关键词： miR-495-3p 山羊卵巢颗粒细胞凋亡类固醇激素

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CAEV p28蛋白的原核表达及CAEV感染山羊卵巢颗粒细胞的研究

CAEV p28蛋白的原核表达及CAEV感染山羊卵巢颗粒细胞的研究

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作者：刘慧敏东北农业大学

学位级别：硕士

山羊关节炎-脑炎(Caprine Arthritis Encephalitis,CAE)是由反转录病霉科慢病毒属山羊关节炎-脑炎病毒(Caprine Arthritis Encephalitis Virus,CAEV)引起的山羊的慢性传染病。CAE的典型症状是山羊羔脑脊髓炎和成年山羊多发性关节炎、硬... 详细信息

山羊关节炎-脑炎(Caprine Arthritis Encephalitis,CAE)是由反转录病霉科慢病毒属山羊关节炎-脑炎病毒(Caprine Arthritis Encephalitis Virus,CAEV)引起的山羊的慢性传染病。CAE的典型症状是山羊羔脑脊髓炎和成年山羊多发性关节炎、硬结性乳房炎以及间质性肺炎。该病呈全球分布,英国、美国等发达国家更为严重,我国于1982年进口种山羊时传入本病,该病对山羊种群造成的经济损失是惨重的。但是目前,对该病的预防与控制仍是世界各国所面临的难题。为了在我国更好地预防和控制本病的发生和流行,建立一种快速、简单、可靠的检测CAEV的诊断方法,本试验在大肠杆菌中诱导表达了CAEV p28特异性蛋白,并用该蛋白作抗原建立了间接ELISA检测方法,用该方法对100份本室保存血清进行了检测。首先使用山羊关节滑膜细胞成功繁殖了山羊关节炎-脑炎病毒后,参照GenBank发表的基因序列,设计合成一对带有酶切位点的引物,对CAEV甘肃株p28基因进行PCR扩增,并进行了分子克隆,利用pET表达载体成功实现了p28基因在大肠杆菌中的表达。重组蛋白氨基端带有6个组氨酸标签,利用固定化金属离子亲和层析法进行纯化,免疫印迹试验证明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原建立了间接ELISA诊断方法,确定其最佳工作条件为重组抗原每孔包被0.1μg,阳性血清以1:50倍稀释,辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG(HRP-兔抗山羊IgG)以1:1000倍稀释,HRP-兔抗山羊IgG最佳作用时间为2h,判定标准为P/N值人于2,且OD值在1.0左右的血清为阳性,否则判为阴性;同时用纯化的p28蛋白免疫小鼠,制备阳性血清。利用重组蛋白抗原检测3只CAEV攻毒后山羊血清抗体水平时发现,3只山羊均在接种2周后可产生p28蛋白的相应抗体,此抗体一直持续存在且滴度较高。在分别以p28蛋白做抗原的琼脂糖免疫扩散试验(AGID)结果和间接ELISA试验结果对比中发现,攻毒山羊在接种5周后用两种方法都可检测到血清抗体,但琼扩方法检测到抗体的最早时间比ELISA方法检测到抗体的最早时间要迟3周,而且琼扩方法在检测攻毒后第6个月山羊血清时为阴性,而ELISA方法检测结果为阳性,一方面说明表达的p28蛋白抗原性好,另一方面也说明用琼扩方法能够检测到的p28抗体水平要比ELISA方法能够检测到的p28抗体水平高,ELISA诊断方法比琼扩诊断方法有高的敏感性。重组抗原在实际应用中共检测100份血清样品,67份抗体检测呈阳性。我们知道CAEV能够在山羊关节滑膜、胎肺、眼角膜细胞上繁殖,但最近国外有报道称:CAEV在山羊卵巢颗粒细胞上也能够繁殖,而且山羊卵巢颗粒细胞经常被用于体外卵母细胞成熟,同时几乎所有的工业化国家山羊种群都高度感染CAEV,而且许多不明来源的卵母细胞被用作体外山羊胚胎生产,所以我们认为作为饲养层细胞的颗粒细胞可能是山羊胚胎感染CAEV的主要来源,因此,颗粒细胞能否被CAEV感染是我们确定山羊胚胎感染CAEV的途径提供一条新的线索。为此,本研究进行了CAEV在山羊卵巢颗粒细胞上的感染性试验。对山羊卵巢颗粒细胞进行原代培养,传代2-3代以后,接种CAEV,观察细胞病变,提取病变细胞核酸后,用设计好的的针对CAEV p28基因的引物进行PCR扩增,扩增出一条660bp的片段,经过序列分析后,确定为p28基因,证明CAEV基因组已整合到颗粒细胞基因组上;用上面试验中制备的p28蛋白免疫小鼠获得的阳性血清对病毒在颗粒细胞上的培养物进行CAEV特异性蛋白的免疫印迹试验,发现培养物中有CAEV特异性p28蛋白,证实整合到颗

关键词：山羊关节炎-脑炎病毒山羊关节滑膜细胞 p28蛋白表达间接ELISA 山羊卵巢颗粒细胞感染性

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miR-495-3p调节山羊卵巢颗粒细胞功能的机制研究

miR-495-3p调节山羊卵巢颗粒细胞功能的机制研究

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作者：何莉娜西南大学

学位级别：硕士

山羊的繁殖性能影响山羊产业发展,大足黑山羊具有性成熟早、繁殖力高的特性,是提升养羊经济效益的优良种质资源,但其高繁殖调控机理尚不明确。卵巢颗粒细胞对卵泡发育和类固醇激素合成起着非常重要的调节作用,进而影响山羊的繁殖性能。m... 详细信息

山羊的繁殖性能影响山羊产业发展,大足黑山羊具有性成熟早、繁殖力高的特性,是提升养羊经济效益的优良种质资源,但其高繁殖调控机理尚不明确。卵巢颗粒细胞对卵泡发育和类固醇激素合成起着非常重要的调节作用,进而影响山羊的繁殖性能。miRNAs具有非常广泛的基因调节功能,它们在卵泡生长发育、卵母细胞成熟、排卵和黄体形成等生理过程中都发挥着重要的作用。尽管有研究表明miR-495-3p通过靶向调节基因表达决定细胞命运,但其在山羊卵巢颗粒细胞中的功能尚不清楚。因此,揭示miR-495-3p调节山羊卵巢颗粒细胞功能的作用机制,将为提高山羊繁殖性能提供理论基础。本研究以大足黑山羊卵巢颗粒细胞为研究对象,通过免疫组化、miRNA过表达或干扰、q RT-PCR、Western Blot、流式细胞术、转录组测序和双荧光素酶报告等技术,探究miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素分泌的影响机制,得到了如下结果:1.miR-495-3p促进卵巢颗粒细胞凋亡,抑制其增殖本研究通过将mimics和inhibitor转染到卵巢颗粒细胞中,构建miR-495-3p的过表达和抑制模型。结果发现,过表达miR-495-3p显著促进颗粒细胞凋亡,抑制miR-495-3p阻碍其凋亡(p卵巢颗粒细胞凋亡。利用CCK-8分别检测24 h、36 h和48 h细胞增殖活力发现,miR-495-3p呈现时间依赖性的抑制细胞增殖活力。运用流式细胞术发现,过表达miR-495-3p将细胞周期阻滞在G2/M期(p细胞周期相关基因检测发现,过表达miR-495-3p显著抑制了CDK4和CCND1的mRNA水平(p颗粒细胞的增殖。2.miR-495-3p调节卵巢颗粒细胞类固醇激素分泌过表达或抑制miR-495-3p均促进雌二醇(E2)和孕酮(P4)的分泌。进一步分析发现,过表达miR-495-3p尽管对St AR表达无显著影响,但显著促进了3β-HSD、CYP11A1、CYP19A1的mRNA和蛋白表达(p颗粒细胞中过表达miR-495-3p,运用转录组测序技术筛选miR-495-3p候选靶基因。GO和KEGG富集分析发现,差异表达的mRNA主要富集在与细胞增殖、分化、凋亡和炎症相关的通路。通过对mimics组和mimics NC组的差异表达分析,筛选得到12个差异表达的基因,其中8个下调,4个上调。对8个下调基因进行q RT-PCR验证,发现除HBEGF没有显著差异外,其余7个基因均显著下调(p细胞增殖、凋亡相关的信号通路,如生物过程调节(regulation of biological process)、细胞过程(cellular process)、催化(catalytic activity)、运输(transporter activity)、分子转化(molecular transducer activity)、细胞组成(cell part)、细胞(cell)等。对上述7个差异表达的基因(HMOX1、STC1、PLAU、STRA6、F2RL1、GDPD5、C4BPA)3’UTR区与miR-495-3p结合位点分析,发现F2RL1、HOMX1、STC1与miR-495-3p有结合位点。进一步通过双荧光素酶报告验证可知,miR-495-3p与STC1存在靶向关系。综上,本研究证明了:(1)miR-495-3p促进山羊卵巢颗粒细胞凋亡,并抑制其增殖;(2)miR-495-3p可能通过调节类固醇激素合成相关基因的表达,促进E2和P4的分泌;(3)miR-495-3p靶向抑制STC1的表达。研究结果为进一步揭示miR-495-3p靶向调控山羊卵泡发育与闭锁的机制提供理论支撑。

关键词： miR-495-3p 山羊卵巢颗粒细胞凋亡细胞周期类固醇激素

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