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α、β、γ-晶体蛋白在哺乳类动物角膜中的表达——小鼠角膜病变模型研究中实时荧光定量PCR最佳内参基因的筛选

α、β、γ-晶体蛋白在哺乳类动物角膜中的表达——小鼠角膜病变...

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作者：任胜卫山东省医学科学院

学位级别：硕士

目的:角膜是如何维持其透明性的机制仍不清楚。角膜晶体蛋白(酶类晶体蛋白)在脊椎或无脊椎动物角膜中表达并在角膜的透明性中起重要作用。本实验重点研究3种经典晶状体晶体蛋白(非酶类晶体蛋白),即α、β、γ-晶体蛋白,是否参与小鼠和... 详细信息

目的:角膜是如何维持其透明性的机制仍不清楚。角膜晶体蛋白(酶类晶体蛋白)在脊椎或无脊椎动物角膜中表达并在角膜的透明性中起重要作用。本实验重点研究3种经典晶状体晶体蛋白(非酶类晶体蛋白),即α、β、γ-晶体蛋白,是否参与小鼠和人类角膜的透明性。方法:利用Balb/c和C57BL/6小鼠,分别用缝线和化学烧伤诱导角膜新生血管模型,应用基因芯片和实时荧光定量PCR(RT-Q-PCR)技术检测相关基因的表达变化;在角膜或培养的角膜细胞中,应用RT-Q-PCR检测晶状体晶体蛋白和角膜晶体蛋白的m RNA表达水平,应用免疫组化(IHC)或蛋白质印迹法检测他们的蛋白表达水平。结果:通过基因芯片或RT-Q-PCR技术检测到晶体蛋白基因在角膜或培养的角膜细胞中丰富表达,也可以通过IHC或蛋白质印迹法检测到αA-,β-和γ-晶体蛋白在角膜或培养的角膜细胞中表达。在缝线和化学烧伤诱导的新生血管模型中,晶状体晶体蛋白基因表达表现出时间和种属的依赖性改变模式,且与角膜晶体蛋白的改变不同。外源性氧化或炎性刺激如H2O2和脂多糖能影响角膜细胞中晶状体晶体蛋白的表达。结论:α、β、γ-晶体蛋白在维持哺乳动物角膜透明性起重要作用。相关机制的进一步研究将有助于揭开角膜透明性的奥秘。目的:在几种常用的小鼠角膜病变模型中,为实时荧光定量PCR(RT-Q-PCR)筛选稳定表达的内参基因。方法:利用Balb/c和C57BL/6小鼠建立本实验室常用的角膜病变模型,1)、角膜新生血管模型(CorNV),分别采用缝线和化学烧伤诱导的角膜新生血管模型;2)、真菌角膜炎模型,分别采用白色念珠菌和烟曲霉菌诱导的真菌角膜炎模型;3)、角膜贯通伤诱导的角膜创伤模型。应用基因芯片和RT-Q-PCR检测8个常用内参基因(甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(ACTB)、乳酸脱氢酶(ALDHA)、核糖体蛋白L5(RPL5)、泛素C(UBC)、肽基异构酶A(PPIA)、TATA盒结合蛋白(TBP1)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT1))在每个模型不同时间点的表达变化情况,采用geNorm和NormFinder统计软件分析RT-Q-PCR的结果。结果:基因芯片结果分析显示,在角膜新生血管状态下,8个内参基因的稳定性依次:PPIA>RPL5>HPRT1>ACTB>UBC>TBP1>GAPDH>LDHA。RT-Q-PCR的结果分析显示:在8个内参基因中,没有一个基因在所有实验条件下是恒定表达的,在大部分实验条件下,GAPDH和ACTB表达最不稳定。NormFinder和geNorm在不同角膜模型中分别推荐最佳单个内参基因和成对内参基因。NormFinder推荐PPIA在CorNV和PCI模型中为最佳内参基因,UBC在真菌角膜炎模型中为最佳内参基因。GeNorm分析结果显示,在不同模型或在不同品系小鼠建立同一模型中,其最佳内参基因就不一样。在CorNV in Balb/c和C57BL/6模型中,GeNorm分别推荐PPIA&HRPT1和PPIA&RPL5作为最佳内参基因;白色念珠菌和烟曲霉菌诱导的真菌角膜炎模型中,GeNorm分别推荐UBC&HPRT1和UBC&LDHA作为最佳内参基因。结论:在进行角膜相关研究,为RT-Q-PCR选取最佳内参基因有利于角膜相关表达基因的研究;在没有最适内参基因的情况下,可选取PPIA,UBC或结合HPRT1、RPL5作为内参基因。

关键词：角膜的发育晶体蛋白角膜透明性屈光子哺乳动物内参基因实时荧光定量PCR 角膜新生血管真菌角膜炎

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