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基于纳米金星的层析试纸条用于检测HIV-DNA（英文）

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分析测试学报 2019年第5期38卷 517-524页

作者：吕思嘉操婷伟文为张修华王升富有机化工新材料湖北省协同创新中心有机功能分子合成与应用教育部重点实验室湖北大学化学化工学院湖北武汉430062

构建了基于纳米金星(AuNSs)的快速、简单且可视化的横向流层析试纸条(LFTS),并用于检测人类免疫缺陷病毒的DNA。采用一步法合成AuNSs,并对其进行生物功能化,目标物与DNA修饰的AuNSs结合。该复合物通过碱基互补配对原则被捕获在测试线上... 详细信息

构建了基于纳米金星(AuNSs)的快速、简单且可视化的横向流层析试纸条(LFTS),并用于检测人类免疫缺陷病毒的DNA。采用一步法合成AuNSs,并对其进行生物功能化,目标物与DNA修饰的AuNSs结合。该复合物通过碱基互补配对原则被捕获在测试线上,依据测试线上纳米金星颜色的变化进行定性和半定量分析,使用便携式读条器在最佳实验条件下进行定量分析。该方法的线性范围为0.2～50 nmol/L,检出限为0.14 nmol/L。相同条件下,该方法比传统纳米金试纸条的灵敏度约高5倍。该方法可用于人血清中HIV DNA的检测,结果良好。

关键词：纳米金星层析试纸条人类免疫缺陷病毒的DNA (HIV-DNA ) 可视化检测

基于量子点标记的层析试纸条与配套分析仪的研制

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基于量子点标记的层析试纸条与配套分析仪的研制

作者：郭勤上海交通大学

学位级别：硕士

20世纪90年代以来,免疫层析技术因其快速、简便、经济、单人份检测等特点得到迅速发展,已经广泛应用于医学检测、食品质量监测、毒品检测和环境监测。目前,免疫层析技术朝着高灵敏度、定量和多元检测的方向发展,并且有可能成为病原体、... 详细信息

20世纪90年代以来,免疫层析技术因其快速、简便、经济、单人份检测等特点得到迅速发展,已经广泛应用于医学检测、食品质量监测、毒品检测和环境监测。目前,免疫层析技术朝着高灵敏度、定量和多元检测的方向发展,并且有可能成为病原体、恶性肿瘤以及心血管疾病等的早期有效和灵敏的筛查诊断技术。但是传统的以胶体金为标记物的免疫层析试纸条灵敏度不够高,无法满足早期诊断中的超微量检测的需求。随着纳米技术的不断发展,许多新型的纳米材料被不断制备,而且被应用于免疫分析,给研发新一代诊断试剂盒带来了新的机遇。荧光量子点是一类非常重要的功能纳米材料,其直径约为1-10纳米。由于尺度量子效应,它们表现具有独特的光致发光性能。主要表现为:发射波长范围窄,Stocks位移大,量子产率高,荧光寿命长,化学和光学稳定性好。由于吸收光谱重叠范围宽,可采用单一波长的激光为激发光源,实现多色标记,特别适合于活体细胞成像和多组分同时检测。基于这些理由,我们研制以量子点为标记物的免疫层析试纸条与配套的定量检测分析仪。仪器设计方面:本文选用LED环形紫外冷光源作为激发光源,CCD模拟摄像机配合图像采集卡进行荧光信号采集,成功地大幅缩减了生物免疫层析分析仪的体积,为开发单片机控制的便携式精确检测仪奠定了基础。本文采用Borland Delphi来开发仪器配套的软件系统,成功实现了图像采集,图像处理,快速自动诊断,手动调整检测区域,打印检测报告等功能,并建立了完善的病人信息数据库,可以进行病人信息的录入,查询和统计。免疫层析实验方面:本文采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐（EDC）活化本实验室自制的CdTe量子点并偶联人葡萄球菌蛋白A（SPA）,成功制备出粒径为2.5nm且分散良好的免疫量子点。在此基础上,构建免疫层析试纸条检测抗HIV-1 gp41抗体,并与金标试纸条在层析速度、灵敏度和老化等指标上进行了比较。实验证明各项指标均优于金标试纸条,且由于在紫外激发下量子点发射荧光,而血红蛋白无荧光,所以该方法在血清样本的检测中不会像金标法那样受到血红蛋白颜色的影响。用本文开发的层析分析仪检测不同浓度试纸条上控制线和检测线的荧光信号,证明其检测下限可以达到1 ng/mL,批内稳定性良好,批间差在可控范围内。

关键词：层析试纸条量子点层析分析仪定量检测 Borland Delphi软件

基于磁性微粒的黄曲霉毒素样本净化及层析试纸条研究

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基于磁性微粒的黄曲霉毒素样本净化及层析试纸条研究

作者：王艳霞西北大学

学位级别：硕士

黄曲霉毒素是一类具有极强毒性和三致性(致癌、致畸、致突变)的真菌毒素,普遍存在于食品和饲料当中,世界各国对食品中黄曲霉毒素的残留量都有严格控制。但在检测之前,需对样品中的黄曲霉毒素进行富集提取。基于磁性复合微粒,本研究开展... 详细信息

黄曲霉毒素是一类具有极强毒性和三致性(致癌、致畸、致突变)的真菌毒素,普遍存在于食品和饲料当中,世界各国对食品中黄曲霉毒素的残留量都有严格控制。但在检测之前,需对样品中的黄曲霉毒素进行富集提取。基于磁性复合微粒,本研究开展了食品中黄曲霉毒素B1(AFB1)和总黄曲霉毒素(AFT)的净化研究,并以GoldMag金磁微粒为载体开展了黄曲霉毒素B1快速层析检测技术研究。具体内容和结果如下： 1、选择特异性抗体,制备了针对黄曲霉毒素B1和总黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)的免疫磁性微粒。表面偶联10μg抗黄曲霉毒素B1或总黄曲霉毒素单克隆抗体的1mg异硫氰酸根末端磁粒可以达到最佳的净化能力,可分别从花生样品中提取得到17.5ngAFB1和18ng AFT。 2、将两种免疫磁粒用于净化不同食品样本中的黄曲霉毒素。结果表明：对玉米和小麦样品黄曲霉毒素的净化能力优于花生和核桃样品。AFBl免疫磁粒对上述四种样品的回收率均达到98%以上,相对标准偏差小于8.5%。AFT免疫磁性微粒对AFB1和AFG1回收率大于98%,小麦和玉米回收率达到100%,相对标准偏差在3.99%～8.29%之间,而AFB2和AFG2回收率在84%～91%之间,相对标准偏差在6.02%～7.86%之间,表明对AFB1和AFG1的净化能力比AFB2和AFG2总体上更好。 3、制备了黄曲霉毒素B1金磁微粒标记抗体复合物。1mg GoldMag(?)金磁微粒偶联抗体的最大量为117.2μ g,最适偶联条件为25℃、180rpm震荡孵育1.5h。 4、金磁标记层析试纸条的评价。可目视化定性检测线为4ng/ml。磁信号定量检测限为0.1-0.3ng/ml,定量检测范围为0.3ng/ml-4ng/ml。通过试纸条可实现从小麦、玉米、花生和花生油等样本中黄曲霉毒素B1的检测。

关键词：黄曲霉毒素免疫磁性微粒净化层析试纸条食品检测

冻融法制备DNA功能化的金纳米颗粒及其在层析试纸条上的应用

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黄冈师范学院学报 2019年第3期39卷 37-43页

作者：吕思嘉文为张修华王升富湖北大学化学化工学院有机化工新材料湖北省协同创新中心有机功能分子合成与应用教育部重点实验室

简单、高效地制备DNA功能化的金纳米颗粒是构建“金标”层析试纸条生物传感器的关键。本文采用冻融法简单、快速地制备了DNA功能化的金纳米颗粒,并以此为“金标”构建了一种快速、低成本的能用于乙型肝炎病毒基因检测的层析试纸条生物... 详细信息

简单、高效地制备DNA功能化的金纳米颗粒是构建“金标”层析试纸条生物传感器的关键。本文采用冻融法简单、快速地制备了DNA功能化的金纳米颗粒,并以此为“金标”构建了一种快速、低成本的能用于乙型肝炎病毒基因检测的层析试纸条生物传感器。该层析试纸条的检测原理基于核酸杂交反应,将冻融法制备的DNA功能化的金纳米颗粒与目标物一起加入到该试纸条上,在溶液流经整个测试条带后,纳米金颗粒将逐渐在测试区积累,产生肉眼可见的色带,然后通过便携式试纸条读条器读取测试线给定区域上的信号强度进行定量检测。该层析试纸条有望用于生物标志物监测和临床即时检测,特别是在设备资源相对贫乏的条件下,具有较大的应用前景。

关键词：冻融法金纳米颗粒层析试纸条可视化检测

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真菌毒素快速检测适配体试纸条的研究

真菌毒素快速检测适配体试纸条的研究

作者：刘丽红江南大学

学位级别：硕士

近年来,食品安全问题频发,严重危害着人们的身体健康,引起了人们的广泛关注。其中真菌毒素污染广、种类多、毒性强,且具有分子量小、结构稳定、不易被分解等特点,受到真菌毒素污染的食物严重影响了大众的身体健康,是食品检测中的关注重... 详细信息

近年来,食品安全问题频发,严重危害着人们的身体健康,引起了人们的广泛关注。其中真菌毒素污染广、种类多、毒性强,且具有分子量小、结构稳定、不易被分解等特点,受到真菌毒素污染的食物严重影响了大众的身体健康,是食品检测中的关注重点。传统的真菌毒素检测方法一般是仪器法和酶联免疫法,其中大型检测仪器价格昂贵,且需要专业人员操作,无法进行现场检测工作。酶联免疫法显色结果受外界环境干扰较大,且所需抗体的制备周期较长,成本较高,存在批次间差异,且真菌毒素无免疫原性需要合成人工抗原,这也限制了免疫法在真菌毒素检测领域的发展应用。因此,现阶段急需研究和建立一种快速、灵敏、准确、价格低廉、适用于现场的检测方法。适配体作为近年来在检测领域被广泛使用的识别分子,具有可与抗体媲美的亲和力与特异性,且具有靶标范围广泛、制备过程简单、稳定易保存等优点,目前适配体在食品安全检测中的发展受到了研究者们的关注。侧流层析技术作为重要的快速检测手段,在农兽药残留、致病菌检测等食品危害因子检测中应用广泛。将适配体应用于层析试纸条作为识别物质,可以大大提高试纸条的稳定性,降低生产成本,扩大适用范围。此外,上转换发光纳米材料作为近年来新兴的荧光纳米材料,被广泛应用于光学传感器的研制工作中。上转换纳米材料具有斯托克斯位移大、光化学性质稳定、毒性低、没有背景干扰、信噪比较高、不易光漂白等光学特性。通过进一步研究将上转换纳米材料作为信号标记探针应用于适配体识别的层析试纸条中,可以在检测灵敏度、准确性等方面获得优异性能。首先,构建了一种基于适配体识别的新型玉米赤霉烯酮胶体金层析试纸条。将巯基化的玉米赤霉烯酮适配体与胶体金偶联,作为层析试纸条的信号探针;将适配体的识别序列与非识别序列的互补链借助链霉亲和素分别固定于硝酸纤维素膜的表面形成检测线与质控线。该方法采用竞争原理,通过检测线上的互补序列与靶标共同竞争探针上连接的适配体实现对目标物的检测。实验中优化了金标适配体探针制备过程中盐浓度及适配体浓度、检测线与质控线上链霉亲和素与生物素化适配体的比例、上样量等条件,提高了试纸条的灵敏度及稳定性。在最佳的实验条件下,玉米赤霉烯酮试纸条利用适配体高亲和力高特异性的优点,可视化检测线可达到20 ng/mL,且在5 ng/mL00 ng/mL内线性良好且具有良好的特异性。该方法应用于市售玉米样品的检测,具有较好的准确性,可用于实际样品的检测中。其次,构建了一种基于适配体识别的新型赭曲霉毒素A上转换纳米材料层析试纸条。为了进一步提高试纸条检测灵敏度及信号稳定性,本实验通过高温热分解法合成了在近红外光激发下在可见光区具有荧光信号的NaYF:Yb,Er上转换纳米材料,并将聚丙烯酸作为配体交换剂,通过配体交换法在上转换表面修饰羧基基团,使其具有更好的生物相容性。将赭曲霉毒素A的氨基化适配体与改性后的上转换材料偶联,作为层析试纸条的探针;将适配体的识别序列与非识别序列借助链霉亲和素分别固定于硝酸纤维素膜的表面形成检测线与质控线。该方法采用竞争原理,通过检测线上的互补序列与靶标共同竞争探针上连接的适配体,实现对目标物的检测。实验中优化了上转换材料的制备及表面改性方法、硝酸纤维素膜的孔径、上样量等条件,确保了信号探针在试纸条上的流动性,避免背景干扰。在适配体高亲和力高特异性的基础上将上转换材料作为标记物应用于试纸条上,利用其独特的光学性质,进一步提高了试纸条的灵敏度及稳定性,同时达到定量检测的目的。在最佳的试验条件下,赭曲霉毒素A检测限为1.86 ng/mL,且在5 ng/m L00 ng/mL内线性良好,且具有较好的准确性。该方法应用于市售啤酒样品的检测中,具有较好的准确性,可用于实际样品的检测中。

关键词：真菌毒素快速检测层析试纸条适配体胶体金上转换荧光纳米材料

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抗鹌鹑IgG单克隆抗体的制备与应用

抗鹌鹑IgG单克隆抗体的制备与应用

作者：罗燕扬州大学

学位级别：硕士

鹌鹑的肉和蛋中含有丰富的蛋白质,具有较高的营养价值和药用价值,在我国更是有“动物人参”的美誉。我国鹌鹑养殖业从20世纪80年代开始,经过几十年的发展,其规模已经仅次于鸡。随着养殖规模的发展鹌鹑的各种疾病也有越来越严重的趋势,... 详细信息

鹌鹑的肉和蛋中含有丰富的蛋白质,具有较高的营养价值和药用价值,在我国更是有“动物人参”的美誉。我国鹌鹑养殖业从20世纪80年代开始,经过几十年的发展,其规模已经仅次于鸡。随着养殖规模的发展鹌鹑的各种疾病也有越来越严重的趋势,给鹌鹑养殖业带来了巨大的经济损失,因而对常见疾病进行预防和监测控制日益引起养殖业者的关注,针对不同病原抗体水平的检测评估也成为了养殖环节的重要工作。IgG在抗体分子总量中占70%-80%,是组分中比例最高的,在抵抗不同病原的入侵中也起着主力军的作用。血清中针对不同病原特异性IgG水平的测定已经成为临床免疫检测和体液免疫研究的常用指标。现今市场上出售的抗体检测试剂盒主要是用于鸡源疾病的检测,而关于鹌鹑疾病检测的试剂盒几乎没有,而且国内外至今也没有关于抗鹌鹑IgG的单抗制备的报道。本研究制备了抗鹌鹑IgG的单克隆抗体,并以此单抗为介导建立了检测鹌鹑体内NDV抗体的三种方法：IFA、间接ELISA和胶体金免疫层析试纸条,结果显示建立的三种方法都具有较好的灵敏性和特异性,可用于临床检测。研究内容一：抗鹌鹑IgG单克隆抗体的制备以饱和硫酸铵法纯化得到的鹌鹑IgG为免疫原,按照常规方法免疫6-8周龄Balb/c小鼠,经过三次免疫后无菌取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合,采用间接酶联免疫吸附试验筛选阳性杂交瘤细胞,用有限稀释法进行了两次亚克隆,共获得4株稳定分泌抗鹌鹑IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为：QIgG-5F11、QIgG-5G2、QIgG-5G6和QIgG-3D4。亚类鉴定试剂盒结果显示QIgG-5F11和QIgG-5G2的亚类为IgG1,而另两株为IgM,四株单克隆抗体的轻链均为K链。用ELISA方法测定了单抗的效价,4株单抗的上清效价分别为：1：2048、1：4096、1：2048和1：1024,腹水的效价分别为：1：409600、1：204800、1：409600和1：102400。用Western-blot检测单抗的反应性,结果显示QIgG-5F11和QIgG-5G2均特异性识别鹌鹑IgG的轻链,而QIgG-5G6和QIgG-3D4均特异性识别鹌鹑IgG的重链。本研究用间接ELISA和Western-blot对不同动物的血清免疫球蛋白进行了交叉反应性的测定,结果显示,两株单抗QIgG-5F11和QIgG-5G2的腹水均只与鹌鹑血清中的免疫球蛋白发生反应,与其他几种动物的血清之间不存在反应性,表明本研究制备的抗鹌鹑IgG单克隆抗体具有较好的特异性。本研究制备的抗鹌鹑IgG单克隆抗体与鹌鹑血清中抗体的良好反应性和特异性,使其有望成为鹌鹑血清中抗体检测的通用二抗,使得检测鹌鹑血清抗体通用试剂盒的研制成为可能,从而服务于临床检测。研究内容二：抗鹌鹁IgG单克隆抗体的应用本研究以研究内容一中制备的单抗QIgG-5F11为介导,以NDV抗体检测为例,尝试建立检测鹌鹑血清中抗体的IFA法、间接ELISA法和层析试纸条法。(1)以感染了LaSota的CEF为固定抗原,鹌鹑血清为一抗,单抗QIgG-5F11为抗抗体,再用FITC标记的羊抗鼠IgG为荧光二抗建立了检测鹌鹑血清中的NDV抗体的IFA法。(2)以超离纯化的NDV病毒为包被抗原,鹌鹑血清为一抗,以HRP标记的QIgG-5F11为二抗建立了检测鹌鹑血清中NDV抗体水平的间接ELISA法。(3)用胶体金标记QIgG-5F11包被金标垫,将纯化的NDV和兔抗鼠IgG分别喷于NC膜的T线和C线,建立了检测鹌鹑血清中的NDV抗体的层析试纸条。三种方法建立后分别对实验室和临床采集的鹌鹑血清进行了检测,将三种方法的结果与HI的结果进行对比分析,结果显示三种方法与HI的符合率分别为69.8%、91.4%和95.8%,表明建立的三种方法均达到了预期的效果,能对鹌鹑血清中的NDV抗体水平进行检测评估。通过三种方法的建立和应用,证明了本研究制备的抗鹌鹑IgG的单克隆抗体具有实用性。本研究中以检测NDV抗体为例证明制备的抗鹌鹑IgG的单克隆抗体可以用于检测鹌鹑血清中存在的抗体,以此类推,我们可以将本研究制备的单抗应用于针对其他病原抗体检测方法的建立,可以在临床进行推广应用。

关键词：鹌鹑IgG 单克隆抗体 IFA 间接ELISA 层析试纸条

基于纳米材料及核酸适配体的黄曲霉毒素B1检测方法的研究与应用

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基于纳米材料及核酸适配体的黄曲霉毒素B1检测方法的研究与应用

作者：王亚芳河南工业大学

学位级别：硕士

真菌毒素由于存在污染广、危害大、防控难、含量低、污染基质复杂等特点,已成为制约我国粮油食品产业发展的重要瓶颈。目前一线粮库入库大多采用的真菌毒素快速检测方法是层析试纸条检测技术,所用的检测设备和试纸条主要靠进口,而且进... 详细信息

真菌毒素由于存在污染广、危害大、防控难、含量低、污染基质复杂等特点,已成为制约我国粮油食品产业发展的重要瓶颈。目前一线粮库入库大多采用的真菌毒素快速检测方法是层析试纸条检测技术,所用的检测设备和试纸条主要靠进口,而且进口的层析试纸条价格昂贵,检测误差较大,样品前期处理时间过长,已经不能满足我国粮食进仓检测需求。因此加快粮食中真菌毒素快速检测关键技术研究已成为保障我国粮食安全的迫切需求。本研究以粮食安全中具有代表性的黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)为研究对象,通过合成颜色信号稳定且强的纳米复合材料作为信号放大元件,同时将适配体作为识别分子代替抗体应进行靶标识别,制备了实验操作简单,信号响应快,结果可视化等特点的适配体比色传感器以及横向流动试纸条检测系统,实现对真菌毒素高灵敏的快速检测,同时扩大了检测范围,降低实验成本。具体研究结果如下:1胶体金适配体比色法检测玉米中的黄曲霉毒素B以不同尺寸和形貌的金纳米颗粒会呈现出不同的颜色,并且在外界环境因素的作用下,金纳米颗粒之间发生相互作用,从而造成其尺寸和溶液颜色发生变化以及共振峰发生移动为依据,本章将胶体金与核酸适配体通过静电结合作为信号探针,建立了胶体金适配体比色法检测玉米中的AFB。当溶液中含有AFB,根据AFB核酸适配体可以与靶标分子高特异性结合,导致适配体从胶体金表面脱落,从而使裸露在氯化钠中的胶体金溶液聚集,从而产生颜色和吸光度的变化,以此达到对AFB的可视化快速检测。通过对实验条件的优化,得出该方法的检出限(Limits of Detection,LOD)为0.5ng/m L,且在0.5～50 ng/m L范围内呈现良好的线性关系。通过对加标样品进行检测,得出该方法的加标回收率为90.3%～94.8%,相对标准偏差为7.3%～12.2%。2基于胶体金的适配体层析试纸条检测玉米中的AFB根据前一章所得到的实验结果,我们可以证明该实验所选用的适配体序列对AFB有较高的亲和力。为了提高AFB的检测准确度和灵敏度,基于传统抗原抗体的胶体金免疫层析试纸条的基础上,通过对已有的核酸适配体进行生物素修饰并代替抗体作为试纸条的识别分子,巯基修饰的互补链共价结合金纳米颗粒作为识别探针,同时将链霉亲和素作为试纸条的检测线,利用链霉亲和素与生物素的高亲和力捕获偶联物。最后肉眼观察条带颜色并使用胶体金免疫层析仪扫描以实现对AFB的定量检测。对影响实验结果的条件进行优化后,得出适配体试纸条法LOD为0.5 ng/m L,检测范围(IC～IC)为0.5～200 ng/m L。使用该方法对玉米样品中的AFB加标回收率为97.3%～120%,相对标准偏差为2.3%～8.3%。3基于花状MoS@Au复合纳米材料的适配体试纸条检测玉米中的AFB为了进一步提高检测的灵敏度,使试纸条显色效果更加明显。在前一章胶体金适配体试纸条的基础上,本章通过合成颜色信号稳定且强的纳米复合材料Mo S@Au代替单独的胶体金颗粒与巯基修饰的互补链共价结合作为试纸条的信号探针。根据花状的二硫化钼具有较大的比表面积,将胶体金附着在其表面的可以提高Au NPs的利用率,同时将生物素修饰的适配体代替传统试纸条中选用的抗体作为靶标识别分子,将链霉亲和素作为试纸条的检测线捕获生物素复合物。通过肉眼观察条带颜色并使用胶体金免疫层析仪扫描以达到快速、准确、定量检测AFB的目的。通过对关键因素的优化,得出基于花状Mo S@Au复合纳米材料的适配体试纸条LOD为0.3 ng/m L,检测范围为0.2～200 ng/m L,且该方法在1～50 ng/m L范围内具有良好的线性关系。试纸条对玉米样品的加标回收率为99.4～109.4%,相对标准偏差为3.2%～10.1%。

关键词：核酸适配体纳米材料比色法层析试纸条黄曲霉素B1

基于核酸适配体的食品中OTA和Hg（Ⅱ）的生物传感器检测方法研究

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基于核酸适配体的食品中OTA和Hg（Ⅱ）的生物传感器检测方法研究

作者：马文蔚江南大学

学位级别：硕士

特异性强、灵敏度高的重金属、毒素的快速检测方法,对于食品安全有着重大的意义。通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的核酸适体,在毒素、重金属的检测等很多领域有重要作用。本论文选取了代表性的生物毒素(赭曲霉毒素)和重... 详细信息

特异性强、灵敏度高的重金属、毒素的快速检测方法,对于食品安全有着重大的意义。通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的核酸适体,在毒素、重金属的检测等很多领域有重要作用。本论文选取了代表性的生物毒素(赭曲霉毒素)和重金属离子(Hg)作为检测对象,以核酸适配体为基础,构建了检测Hg的核磁共振方法,以及胶体金和量子点试纸条检测赭曲霉毒素(OTA)的方法。本文以这几个方面为主要内容: 1、制备了核酸适配体功能化的胶体金试纸条,采用竞争法检测OTA,主要优化了金标核酸适配体的偶联比、重悬液体系、硝酸纤维素膜和结合垫上点样量等条件。在金:核酸=1:10,0.01M pH7.4 PB(含0.5%PEG,1%蔗糖,0.1%Tween20,0.02% MgSO4,0.05% (NH4)2SO4)的溶液体系下,采用CN140硝酸纤维素膜,试纸条能够在15min内实现对OTA的定性及半定量测。肉眼检测限2.5ng/mL,标准曲线得到的线性范围0.2-2.5ng/mL,检测限0.18ng/mL。 2、构建了核酸适配体的量子点荧光试纸条,采用竞争法,量子点与适配体偶联后,优化重悬液体系、硝酸纤维素膜和结合垫上点样量等条件。发现在0.01M pH7.4 PB(含1.5%PVP,1%蔗糖,0.1%Tween20、0.02% MgSO4,0.05% (NH4)2SO4)体系中,采用M135硝酸纤维素膜,试纸条能够在15min内实现对OTA的定性及半定量测,在最优条件下,肉眼检测限5ng/mL,标准曲线得到的线性范围2.2-10ng/mL,检测限1.9ng/mL。 3、优化磁粒子标记适配体的偶联比以后,探针与Hg反应,形成T-Hg-T错配结构,磁粒子发生聚集,水中质子状态变化。利用核磁共振成像仪器,得到T2加权图像,T2造影图像。实验结果中,随着Hg浓度的提高,水中的质子环境改变越多,MRI图像强度减弱,即T2加权图像强度变暗,T2弛豫时间逐渐减小,线性范围0.25pg/mL-10pg/mL,检测限0.15pg/mL。

关键词：核酸适配体 Hg2+ 赭曲霉毒素A 核磁共振层析试纸条

基于适配体技术的抗生素残留快速检测方法研究

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基于适配体技术的抗生素残留快速检测方法研究

作者：闫娇海南大学

学位级别：硕士

适配体作为一种新型的生物识别分子,为开发高效快速便捷的检测方法提供了新思路,适配体技术应用于生物传感器可以直接进行信号的转换或放大,例如比色、光学、电化学等模式。适配体传感器还可以与其他技术(例如纳米技术)相结合以达到信... 详细信息

适配体作为一种新型的生物识别分子,为开发高效快速便捷的检测方法提供了新思路,适配体技术应用于生物传感器可以直接进行信号的转换或放大,例如比色、光学、电化学等模式。适配体传感器还可以与其他技术(例如纳米技术)相结合以达到信号放大,提高检测灵敏度和无标记检测的目的。这些适配体传感器已经被成功应用于在生物传感、分子影像、靶向治疗、食品安全等领域。适配体技术还被《Nature Methods》评为2014年最值得关注的技术之一。尤其为分析检测方法的开发提供了更好的平台。而食品快速检测分析方法的这个领域的未来发展的趋势就是这些基于适配体技术的检测方法。本研究进行了适配体反应条件的优化,建立了 3种基于适配体技术的快速检测食品中抗生素残留的方法。一是基于利用适配体对纳米金的过氧化物酶样活性的抑制与恢复特性建立了磺胺二甲氧嘧啶的比色检测方法;二是使用PicoGreen荧光染料作为适配体构象变化的荧光探针建立了四环素的超灵敏测定方法;三是开发了一种基于适配体技术的快速检测氯霉素的荧光试纸条的方法。内容如下:1.已知纳米金颗粒(AuNPs)具有过氧化物酶样活性,它们可以通过H202催化3,3,5,5-四甲基联苯胺的氧化,这导致纳米金溶液的颜色从红色到紫色再到蓝色的颜色。本实验表明,AuNPs的过氧化物酶样活性可以通过用磺胺二甲氧嘧啶的ssDNA适配体钝化其表面来抑制其酶活性。然而,如果存在目标分子(磺胺二甲氧嘧啶),则适配体从AuNPs表面解离,这导致AuNPs的催化性能的恢复。溶液的颜色变化(从紫色到蓝色)与分析物浓度相关,并且这可以通过目测或通过在650nm的紫外光光度法来判断。在最佳优化条件下,该测定磺胺二甲氧嘧啶的检测限为10ng·mL-1,并且在相当宽的浓度范围(0.01-1000μ g·L-1)上是成线性关系的。该测定可以在15分钟内完成,因此非常适合于食品中磺胺二甲氧嘧啶残留的快速筛查。2.基于PicoGreen(PG)作为适配体特异性荧光探针测定四环素(TET)的方法。在不存在TET的情况下,适配体与其互补序列形成双链结构,导致PG荧光的增强。在适配体与靶标TET结合时,减少了形成的DNA双链体的数目,并且在480/520nm的激发/发射波长处测量时导致PG的荧光强度的降低。在最佳优化的条件下,动态校准曲线覆盖5 nM至1000 nM的浓度范围,检测限为5 nM。这符合欧盟委员会关于食品中TET残留限量的安全监管规定。该方法显示出比其他抗生素的高特异性。该方法代表了用于现场检测食品中TET的一种简单,快速和灵敏的有前景的工具。3.开发了一种基于适配体及其互补链竞争的荧光侧向层析试纸条(Lateral Flow Strip Assay,LFSA)。在这种荧光LFSA测定中,氯霉素(CAP)与固定在硝酸纤维素(NC)膜上方的检测线(T线)上的适配体互补链竞争有限的荧光标记的CAP适配体,荧光强度为检测线的荧光信号。在控制线(C线),一段与CAP适配体无关的序列(本文设计的是18个adenine)与体系中的被荧光标记的linker-Cytosine固定互补,只用起到质控作用,其荧光信号强度是稳定的。该LFSA在1至1000 nM的范围内的呈线性关系,检测限可以达到1nM。该方法简单快速,无需特殊和复杂的仪器,为开发基于适配体技术的抗生素及其他污染物快速现场检测方法提供了一种新的思路。

关键词：抗生素残留适配体比色荧光层析试纸条