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生物工程学报 2015年第9期31卷 1387-1392页

作者：秦伟伟高友鹤中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005 北京师范大学生命科学学院生物化学系北京100875

用膜保存尿蛋白质对于生物标志物的研发意义重大,从保存尿蛋白质的硝酸纤维膜上洗脱蛋白质的有效性,决定着保存方法被接受的程度和应用的范围。加热洗脱蛋白质的方法,通过提高硝酸纤维膜溶解时的温度等方式;并运用SDS-PAGE和LC-MS/MS分... 详细信息

用膜保存尿蛋白质对于生物标志物的研发意义重大,从保存尿蛋白质的硝酸纤维膜上洗脱蛋白质的有效性,决定着保存方法被接受的程度和应用的范围。加热洗脱蛋白质的方法,通过提高硝酸纤维膜溶解时的温度等方式;并运用SDS-PAGE和LC-MS/MS分析加热洗脱方法所制备的尿蛋白质样品,将其与强烈涡旋洗脱方法和直接丙酮沉淀方法所制备的尿蛋白质样品比较。结果显示,加热洗脱方法比强烈涡旋洗脱方法获得更多的蛋白质(P蛋白质无降解;加热洗脱方法和直接丙酮沉淀方法制备的蛋白质样品,质谱所鉴定到蛋白质重叠率无明显差异(分别是92.6%、96.8%),蛋白质丰度CV值蛋白质占总蛋白质的比例均很高(分别是85.2%、94.4%)。加热洗脱法具有很好的技术重复性,操作更加高效、简单,有利于用膜保存尿蛋白质方法的推广应用。

关键词：尿蛋白质保存硝酸纤维膜蛋白质组学生物样本保存

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加热洗脱硝酸纤维膜上保存的尿蛋白质及尿蛋白质翻译后修饰的研究

加热洗脱硝酸纤维膜上保存的尿蛋白质及尿蛋白质翻译后修饰的研究

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作者：秦伟伟北京协和医学院

学位级别：硕士

生物标志物指的是与生理或病理生理过程相关的可监测的变化,其本质是变化。血浆作为机体内环境的重要组成部分,受稳态机制调节各种理化成分保持相对恒定：而尿液作为机体的代谢废物,包含更多反映机体变化的信息,即尿液可能是比血液更好... 详细信息

生物标志物指的是与生理或病理生理过程相关的可监测的变化,其本质是变化。血浆作为机体内环境的重要组成部分,受稳态机制调节各种理化成分保持相对恒定：而尿液作为机体的代谢废物,包含更多反映机体变化的信息,即尿液可能是比血液更好的挖掘生物标志物的来源。尿液作为重要的生物样本,将其与临床病历在疾病的每个阶段一起保存下来,那么在寻找生物标志物的前瞻性研究中,特别是在大规模临床验证试验中,将起到非常重要的作用。随着用硝酸纤维膜保存尿蛋白质方法的建立,将尿蛋白质吸附在硝酸纤维膜上、干燥后真空保存,这使低成本、大规模、长时间保存尿液样本成为可能。用硝酸纤维膜保存尿蛋白质对于生物标志物的研究意义重大,但是如何有效地从保存尿蛋白质的膜上将蛋白质洗脱下来,直接决定着该保存方法的被接受程度和应用范围。然而现有的强烈涡旋洗脱方法需要将每一个样品强烈涡旋至少10 min才能使硝酸纤维膜完全溶解、而且干燥蛋白质沉淀时硝酸纤维膜易再次形成,这使洗脱过程费时费力、效率低,从而束缚了用硝酸纤维膜保存尿蛋白的应用。针对以上问题本论文提出了加热洗脱蛋白质的方法：通过提高硝酸纤维膜溶解时的温度,缩短了强烈涡旋时间、简化了蛋白质洗脱步骤、有效防止了硝酸纤维膜的再形成,并且比强烈涡旋洗脱方法获得更多的蛋白质(P蛋白质发生降解。LC-MS/MS分析加热洗脱方法和直接丙酮沉淀方法制备的蛋白质样品,质谱所鉴定到蛋白质重叠率无明显差异(分别是92.6%,96.8%),蛋白质丰度CV值蛋白质占总蛋白质的比例均很高(分别是85.2%,94.4%)。加热洗脱法具有很好的技术重复性,操作更加高效、简单,有利于用膜保存尿蛋白质方法的推广应用。蛋白质翻译后修饰能改变蛋白质的性质和功能,从而在发育、代谢、疾病等众多生物学过程中起到关键的调控作用。因此,在翻译后修饰层面寻找标志物可能比单纯在蛋白质层面获得更多信息。相对于已知的400多种翻译后修饰,目前对尿蛋白质翻译后修饰的大规模研究依旧局限在磷酸化和糖基化的领域,我们对尿蛋白质翻译后修饰的认识仅仅是冰山一角。本论文对尿蛋白质翻译后修饰进行了探索性研究,乙酰化、丙酰化、丁酰化、三甲基化、琥珀酰化、巴豆酰化这几个近几年发现在机体生命活动中起到重要调控作用的修饰,经过Western Blot分析,结果显示在正常人尿蛋白质上均存在。为了进一步探索在不同的肾脏疾病状态下,这几种翻译后修饰上是否存在差异,我们对比了恶性高血压肾脏损伤、膜性肾病、IgA肾病、狼疮性肾炎、紫癜性肾病和正常人尿蛋白质翻译后修饰的差异。结果显示,肾脏疾病状态下,尿蛋白质赖氨酸上的丙酰化明显增多、琥珀酰化几乎消失。鉴于尿蛋白质带有某种修饰的蛋白仅是全尿蛋白质组的一部分,通过富集手段来对其进行研究,能够减少样品的复杂度。因此,从尿蛋白质翻译后修饰作为切入点来寻找疾病标志物,可能会为我们带来更多的惊喜。

关键词：尿蛋白质保存硝酸纤维膜蛋白质组学生物样本保存疾病标志物翻译后修饰乙酰化丙酰化丁酰化三甲基化琥珀酰化巴豆酰化

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