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四川大学学报（医学版） 2005年第2期36卷 172-175页

作者：赵福军李虹程鸿鸣曾浩魏强李响四川大学华西医院泌尿外科成都610041

目的　构建前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的 U PRT基因真核表达重组质粒 (p PS-MAenhancer/ promoter- U PRT)。方法　采用 PCR技术从大肠杆菌 JM10 9基因组中扩增 U PRT基因 ,通过分子克隆技术将其克隆到包括前列腺特异性... 详细信息

目的　构建前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的 U PRT基因真核表达重组质粒 (p PS-MAenhancer/ promoter- U PRT)。方法　采用 PCR技术从大肠杆菌 JM10 9基因组中扩增 U PRT基因 ,通过分子克隆技术将其克隆到包括前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的 p EGFP- 1的质粒。利用重组质粒 p PS-MAenhancer/ promoter- U PRT)转染 L Ncap细胞 ,MTT法检测 5 -氯尿嘧啶 (5 - FU)对转染 L Ncap细胞存活率的影响。结果　质粒 p PSMAenhancer/ promoter- EGFP双酶切去除 EGFP,连接上 U PRT基因 ,成功构建 p PSMAenhancer/ promoter- UPRT,并转染 L Ncap细胞 ,使 L Ncap细胞对 5 - FU的杀伤敏感性大大提高。结论　 p PSMAenhancer/ promoter- U PRT的构建和表达 ,为进一步研究 UPRT基因对 5 - FU的靶向性杀伤前列腺癌细胞增强作用和对前列腺癌自杀基因系统 (CD/ 5 -FC系统 )的放大效应奠定了基础。

关键词：前列腺特异性膜抗原启动子增强子尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因质粒

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mdr1启动子调控双自杀基因对卵巢癌SKOV3耐药细胞的靶向杀伤作用

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中国实用妇科与产科杂志 2007年第10期23卷 763-765页

作者：卢实王晓翊肖蓝蔡俐琼王泽华华中科技大学附属协和医院妇产科湖北武汉430022

目的观察多药耐药基因1(mdr1)启动子调控腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶∷尿嘧啶磷酸核糖转移酶(CD∷UPP)融合基因系统对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞的靶向杀伤作用。方法2004年10月至2005年5月于华中科技大学附属协和医院,将重组腺病毒(Admdr1-C... 详细信息

目的观察多药耐药基因1(mdr1)启动子调控腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶∷尿嘧啶磷酸核糖转移酶(CD∷UPP)融合基因系统对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞的靶向杀伤作用。方法2004年10月至2005年5月于华中科技大学附属协和医院,将重组腺病毒(Admdr1-CD∷UPP)转染卵巢癌紫杉醇耐药细胞(SKOV3/Taxol)及非耐药细胞(SKOV3),荧光显微镜下观察转染效率,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因CD∷UPP的表达,并给予不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-FC),用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测二组的细胞存活率及旁观者效应。结果重组腺病毒对SKOV3/Taxol的转染率随腺病毒滴度的递增而增加,感染复数(MOI)为50时,感染率约100%;CD∷UPP基因仅在SKOV3/Taxol中稳定表达;5-FC对耐药细胞转基因组的杀伤作用显著高于非耐药细胞转基因组,前者表现出明显的旁观者效应。结论mdr1启动子调控的CD∷UPP融合自杀基因系统对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞有靶向杀伤作用。

关键词：多药耐药胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因基因治疗卵巢癌

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丙酮丁醇梭菌纤维二糖转运系统的鉴定及其调控研究

丙酮丁醇梭菌纤维二糖转运系统的鉴定及其调控研究

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作者：田雅丽山西大学

学位级别：硕士

能源是人类赖以生存和发展的物质基础,但是随着能源过度的开发利用,对全球环境造成的污染问题越发严重,所以开发绿色无污染的可再生能源成为全球发展的共同需要。有着绿色能源之称的生物燃料受到各国政府以及研究学者的高度重视,其最大... 详细信息

能源是人类赖以生存和发展的物质基础,但是随着能源过度的开发利用,对全球环境造成的污染问题越发严重,所以开发绿色无污染的可再生能源成为全球发展的共同需要。有着绿色能源之称的生物燃料受到各国政府以及研究学者的高度重视,其最大的特点是燃烧和使用不会造成环境的污染,有利于维持生态环境的平衡。生物丁醇被认为是能量高并且有较好的燃料经济性的液体燃料,其生产来源是ABE(Acetone-Butanol-Ethanol)发酵。ABE发酵的主要生产菌株有丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum),拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)。其中丙酮丁醇梭菌能够利用各种单糖、二糖和多糖进行ABE发酵产生丁醇以及丙酮和乙醇等副产物。本研究以*** ATCC824为研究对象,对其纤维二糖转运系统及其调控机制进行了研究,主要研究工作以及结果如下:首先,我们通过文献调研和qPCR分析发现两个编码PTS(phosphotransferase system)系统基因簇(CAC0383-0386和CAC1407-1408)在纤维二糖下特异性高表达。利用ClosTron敲除技术分别将CAC0383和CAC1407插入失活以及将CAC0383和CAC1407共敲除,发现单突变体菌株和双突变体菌株中对应敲除基因的下游基因转录水平都有所降低;同时两个单突变体均可以利用纤维二糖,而共敲除CAC0383和CAC1407的双突变体不能利用纤维二糖。因此,*** ATCC824基因簇CAC0383-0386和CAC1407-1408均编码转运纤维二糖的PTSs(分别命名为PTS1和PTS2)。其次,我们对PTS1和PTS2可能转运的糖进行筛选。选择除了葡萄糖和纤维二糖以外的丙酮丁醇梭菌可以利用的二糖(蔗糖、乳糖)、戊糖(阿拉伯糖、木糖)、已糖(半乳糖)和多糖(木聚糖)进行生长比较,最终发现CAC0383基因被敲除的菌株不能利用半乳糖,而CAC1407基因被敲除时对半乳糖的生长没有影响,因此PTS1还负责半乳糖转运。最后,我们在***中成功建立了基于upp(编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶)的反向筛选系统。***Δupp确实能够在含有5-氟尿嘧啶(5-Fu)的培养基中生长,而将upp基因回补则不能生长。因此,可通过加入5-Fu快速实现含upp基因的质粒或片段丢失。同时,基于ClosTron敲除技术,建立将外源基因定点插入到基因组的目标位置的基因敲入技术。总而言之,该研究不仅鉴定了丙酮丁醇梭菌纤维二糖的转运系统和分析了其表达调控机制,同时将ClosTron和upp/5-Fu反向筛选系统结合开发了一个新的基因快速插入策略。这些研究不仅为丙酮丁醇梭菌高效利用木质纤维素奠定了基础,也为其他梭菌的遗传改造提供了便利条件。

关键词：丙酮丁醇梭菌 PTS转运系统纤维二糖 ClosTron 反向筛选标记尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因

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