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尼罗罗非鱼白细胞介素21基因(OnIL-21)及其受体基因(OnIL-21R)克隆及表达分析

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水产学报 2022年第11期46卷 2038-2052页

作者：李兰高阿龙陈建林雷阳吴丽婷叶剑敏华南师范大学生命科学学院现代水产养殖科学与工程研究院广东省水产健康安全养殖重点实验室

为研究白细胞介素21 (IL-21)及其受体IL-21R在鱼类抵御病原菌的免疫应答过程中的作用及在机体炎症中的分子机制，实验利用反转录PCR (RT-PCR)技术成功克隆了尼罗罗非鱼IL-21基因(OnIL-21)及其受体IL-21R基因(OnIL-21R)，对其进行生物信... 详细信息

为研究白细胞介素21 (IL-21)及其受体IL-21R在鱼类抵御病原菌的免疫应答过程中的作用及在机体炎症中的分子机制，实验利用反转录PCR (RT-PCR)技术成功克隆了尼罗罗非鱼IL-21基因(OnIL-21)及其受体IL-21R基因(OnIL-21R)，对其进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测其mRNA的表达水平。结果显示，OnIL-21及OnIL-21R的开放阅读框分别为420 bp和1 548 bp，分别编码139和515个氨基酸。经氨基酸序列预测分析，OnIL-21为分泌型蛋白，具有多个保守的磷酸化位点和一个Ig-like结构域；而OnIL-21R是跨膜蛋白，具有典型的γ-c链，氨基酸序列都具有多个保守的磷酸化位点和糖基化位点。系统进化树结果表明，IL-21与IL-21R的氨基酸序列在物种进化过程中具有一定的保守性，尼罗罗非鱼IL-21和IL-21R的氨基酸序列均与斑马拟丽鱼IL-21和IL-21R的亲缘关系最近。组织差异性表达分析发现，OnIL-21及OnIL-21R在健康尼罗罗非鱼的多种组织中均有表达，但具有明显的组织差异性。OnIL-21在皮肤和心脏组织中表达量较高，在肌肉中较低；而OnIL-21R在鳃和脾脏组织中表达量最高，在肌肉中最低。无乳链球菌和嗜水气单胞菌体内感染和体外刺激白细胞后，头肾和脾脏中OnIL-21和OnIL-21R表达量均呈现显著上调，并在72 h内维持较高的表达水平，说明OnIL-21和OnIL-21R可能参与尼罗罗非鱼病原菌感染的免疫应答过程。此外，重组蛋白(r)OnIL-21刺激脾脏白细胞后，OnIL-21R和炎症相关因子基因(IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10)的表达均发生显著上调，表明OnIL-21可调控其受体基因OnIL-21R的表达及参与调控机体的炎症反应。上述研究结果阐述了尼罗罗非鱼IL-21与IL-21R的分子生物学特征，并初步阐明了二者参与机体病原菌感染的免疫应答过程，为进一步探究IL-21通过其受体IL-21R调控机体免疫反应的作用机制和信号通路提供了重要参考。

关键词：尼罗罗非鱼 IL-21 IL-21R 基因克隆免疫应答

尼罗罗非鱼鼠李糖凝集素(RBL-1)在非特异性细胞防御病原菌感染中的功能

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水产学报 2022年第5期46卷 730-740页

作者：木亮亮白皓李嘉东邱丽尹晓雪叶剑敏华南师范大学生命科学学院广东省水产健康与安全养殖重点实验室广东省水产优质环保养殖工程技术研究中心

为了探究鼠李糖凝集素(RBL)在硬骨鱼非特异性细胞防御病原菌感染中的作用，实验以尼罗罗非鱼为研究模型，首先通过分离头肾单核/巨噬细胞进行体外菌应激实验，结果发现，尼罗罗非鱼在2种致病菌即无乳链球菌和嗜水气单胞菌应激后，尼罗... 详细信息

为了探究鼠李糖凝集素(RBL)在硬骨鱼非特异性细胞防御病原菌感染中的作用，实验以尼罗罗非鱼为研究模型，首先通过分离头肾单核/巨噬细胞进行体外菌应激实验，结果发现，尼罗罗非鱼在2种致病菌即无乳链球菌和嗜水气单胞菌应激后，尼罗罗非鱼L-鼠李糖凝集素1基因(Onrbl-1)的表达量显著上调。然后，通过荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现，OnRBL-1重组蛋白能够调节病原菌诱导细胞炎症因子的表达，包括显著抑制细菌诱导的il-6、il-8和tnf-α的表达，促进il-10和tgf-β的表达。此外，通过流式细胞术检测证实OnRBL-1重组蛋白具有促进单核/巨噬细胞的吞噬作用，同时增强呼吸爆发水平和上调活性氧的释放。以上研究表明，OnRBL-1在尼罗罗非鱼单核/巨噬细胞炎症因子表达、吞噬作用、呼吸爆发和活性氧释放等非特异性细胞免疫防御中发挥调节作用。本研究为探讨RBL-1在硬骨鱼宿主防御病原菌感染中的功能提供了参考，并有助于完善和丰富硬骨鱼类RBL的功能和在抗菌免疫应答中的基础理论体系，具有重要的科学意义。

关键词：尼罗罗非鱼 L-鼠李糖凝集素病原菌单核/巨噬细胞吞噬

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尼罗罗非鱼traf6基因表达谱及信号转导

水生生物学报 2022年第1期46卷 116-125页

作者：韩雪晴高风英刘志刚曹建萌可小丽王淼衣萌萌高艳侠卢迈新中国水产科学研究院珠江水产研究所广州510380 热带与亚热带鱼类选育与养殖重点实验室广州510380 上海海洋大学上海国家海洋科学教育示范中心上海201306

肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是一种重要的接头蛋白,在Toll样受体/白细胞介素-1受体(TLR/IL-1R)超家族所触发的信号通路中起重要作用,与先天性免疫密切相关。文章研究了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)traf6的表达模式和初步的... 详细信息

肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是一种重要的接头蛋白,在Toll样受体/白细胞介素-1受体(TLR/IL-1R)超家族所触发的信号通路中起重要作用,与先天性免疫密切相关。文章研究了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)traf6的表达模式和初步的功能。在健康鱼中,traf6转录本广泛表达于所有受检组织中,在血液中表达水平最高,在肝脏中最低。在不同的胚胎发育阶段也检测到traf6的表达。在无乳链球菌体内感染后,大多数受检组织中traf6 mRNA的表达量上调。此外,LPS、Poly I:C和S.agalactiae可显著诱导尼罗罗非鱼巨噬细胞traf6的表达。此外,在HEK293T细胞中过表达表明,TRAF6分布于细胞质中,可显著提高NF-κB的活性。免疫共沉淀(Co-IP)实验表明,TRAF6可与IRAK1(白细胞介素-1受体相关激酶1)相互作用,IRAK1在TLR/IL-1R信号通路中也起重要作用。在体内,TLR2、TLR21和TLR13b的过表达可上调traf6 mRNA的表达水平,表明TRAF6参与了TLR2、TLR21和TLR13b介导的信号转导,提示TRAF6在病原体入侵的免疫应答中起重要作用。

关键词：尼罗罗非鱼肿瘤坏死因子受体相关因子6 表达谱免疫反应 NF-κB活性信号转导

尼罗罗非鱼跨膜Bax抑制剂母体6基因Tmbim 6的克隆、表达及功能鉴定

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大连海洋大学学报 2023年第2期38卷 275-283页

作者：巫祎琴陈福暖张志强江栢坚简纪常黄瑜广东海洋大学水产学院广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室广东湛江524088

为了解跨膜Bax抑制剂母体6(transmembrane Bax inhibitor motif containing 6,TMBIM 6)在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)病原体感染中的作用,利用聚合酶链式反应(PCR)对Tmbim 6基因进行克隆与鉴定,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析Tmbim 6在健康尼罗罗非鱼(体质量为80~100 g)的组织分布模式及无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、Poly I:C模拟病毒刺激后的表达变化。结果表明:尼罗罗非鱼Tmbim 6开放阅读框为714 bp,可编码237个氨基酸,包含6个跨膜结构域和1个C-末端基序;亚细胞定位显示,尼罗罗非鱼TMBIM 6定位于细胞质,双荧光素酶报告基因系统检测发现,Tmbim 6在HEK-293T细胞中过表达后极显著抑制NF-κB通路(P尼罗罗非鱼TMBIM 6参与了无乳链球菌感染和Poly I:C刺激后的细胞应激过程及免疫反应。

关键词：尼罗罗非鱼 Tmbim 6 亚细胞定位 NF-κB 基因表达

尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白的基因克隆及组织表达分析

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水产科学 2022年第3期41卷 370-378页

作者：杨惠源陈泓霖李瑞雪杨志会吴颖瑞吴信忠蔡小辉北部湾大学海洋学院广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室广西钦州536011 广西大学生命科学与技术学院广西南宁530004 邢台市农业农村局河北邢台054000

克隆尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白(On-ECdh)基因,分析On-ECdh基因生物信息学特征及其在正常和无乳链球菌刺激后的尼罗罗非鱼组织中的表达情况。设计基因特异引物扩增On-ECdh基因片段,采用生物信息学对其序列进行分析,利用荧光定量PCR技术检测... 详细信息

克隆尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白(On-ECdh)基因,分析On-ECdh基因生物信息学特征及其在正常和无乳链球菌刺激后的尼罗罗非鱼组织中的表达情况。设计基因特异引物扩增On-ECdh基因片段,采用生物信息学对其序列进行分析,利用荧光定量PCR技术检测On-ECdh基因的表达模式。On-ECdh基因开放阅读框为2442 bp,编码813个氨基酸。On-ECdh理论分子质量为89.9 ku,等电点为4.81。On-ECdh基因推导氨基酸含有1个钙黏着蛋白前结构域、4个钙黏着蛋白重复样结构域、1个钙黏着蛋白细胞质结构域和1个跨膜结构域。On-ECdh与伯氏朴丽鱼E-钙黏着蛋白的氨基酸序列相似性最高,达79.04%,与其他鱼类、哺乳动物的相似性分别为42.44%~52.59%和37.12%~44.62%。荧光定量PCR分析表明,On-ECdh基因在健康的尼罗罗非鱼各组织中均有分布,在肝组织中的相对表达量最高,其次为鳃、肠道、胃、眼、肌肉、脾脏、脑、心脏、头肾。经无乳链球菌刺激后,On-ECdh基因相对表达量在头肾、眼和肠道中显著上调,而在胃、鳃和肝脏中呈下调趋势。眼、头肾和肠道中相对表达量分别在刺激1、3、12 h后达到最高峰,并在高峰后呈现回落趋势。胃、肝脏和鳃中的相对表达量分别在1、3、24 h时最低,胃和鳃中的相对表达量随时间呈现波浪型变化,肝脏中的则持续降低。试验结果表明,无乳链球菌可诱导On-ECdh基因表达,表明E-钙黏着蛋白可能在尼罗罗非鱼感染无乳链球菌时发挥一定的防御作用。

关键词： E-钙黏着蛋白尼罗罗非鱼基因克隆序列分析表达模式

尼罗罗非鱼核糖体蛋白S6基因克隆及组织表达分析

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基因组学与应用生物学 2022年第6期41卷 1193-1201页

作者：巫祎琴张志强陈福暖江栢坚简纪常黄瑜广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室湛江524088 水产经济动物病害控制广东省普通高等学校重点实验室湛江524088

核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6,RPS6)是构成40S小亚基核糖体的关键蛋白之一,在蛋白质合成、调控细胞周期和凋亡、调节肿瘤细胞增殖和转移等方面具有重要作用。为探究RPS6在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中的分子结构、表达特... 详细信息

核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6,RPS6)是构成40S小亚基核糖体的关键蛋白之一,在蛋白质合成、调控细胞周期和凋亡、调节肿瘤细胞增殖和转移等方面具有重要作用。为探究RPS6在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中的分子结构、表达特性和生物学功能,本研究从尼罗罗非鱼中克隆获得RPS6基因的编码区序列(GenBank登录号:XM_003454192.4;命名为On-RPS6),并采用qPCR法分析该基因在健康鱼体各组织的分布特征以及无乳链球菌刺激后该基因在鱼体肝脏、脾脏、脑和头肾中的表达模式。结果显示:On-RPS6的开放阅读框长度为750 bp,编码249个氨基酸,理论分子量为28.70 kDa,等电点为10.90。氨基酸序列分析显示,On-RPS6具有一个高度保守的核糖体蛋白S6e结构域,且与其他物种具有较高同源性。系统进化树分析表明,尼罗罗非鱼RPS6与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)RPS6聚为一支,表明二者具有较近的亲缘关系。qPCR结果显示,尼罗罗非鱼各组织均能检测到On-RPS6基因mRNA的表达,且在血液中的表达量最高;经无乳链球菌刺激后,On-RPS6基因在肝脏、脾脏、脑和头肾中的表达模式均呈现先上调后下降的趋势。结果表明,On-RPS6在尼罗罗非鱼抵抗细菌感染的免疫应答过程中发挥了重要作用。

关键词：尼罗罗非鱼核糖体蛋白S6 基因克隆表达分析无乳链球菌

尼罗罗非鱼选择性自噬接头受体基因(sqstm1)克隆及其功能分析

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农业生物技术学报 2023年第3期31卷 569-579页

作者：黄美玲江栢坚冯佳敏李星黄瑜简纪常广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室/广东省高等学校水生经济动物疾病控制重点实验室

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)选择性自噬接头受体蛋白1 (sequestosome 1 receptor protein,Sqstm1)是一种选择性自噬接头蛋白，可选择性参与清除细胞内受损的细胞器和蛋白质。为分析sqstm1基因的功能，研究其在健康尼罗罗非鱼各... 详细信息

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)选择性自噬接头受体蛋白1 (sequestosome 1 receptor protein,Sqstm1)是一种选择性自噬接头蛋白，可选择性参与清除细胞内受损的细胞器和蛋白质。为分析sqstm1基因的功能，研究其在健康尼罗罗非鱼各组织中的表达分布及抗菌抗病毒应答过程中的表达模式，本研究克隆了On-sqstm1基因(GenBank No. XP＿005463852) ORF序列，通过生物信息学及亚细胞定位分析Onsqstm1基因的序列和定位特征，利用q PCR技术分析其在健康罗非鱼各组织及不同刺激物刺激后各组织中的表达模式，采用双荧光素酶报告系统检测On-sqstm1基因过表达对核因子κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)活性的影响。结果显示，本研究成功克隆了On-sqstm1基因的ORF序列，长度为1 287 bp，编码428个氨基酸；亚细胞定位结果显示On-Sqstm1蛋白定位于细胞质。qPCR结果显示On-sqstm1基因在罗非鱼各组织中均有表达，在肝脏中表达量最高；在无乳链球菌(Streptococcus agalctiae)和Poly I:C病毒类似物刺激后，该基因在罗非鱼的脑、头肾、肝脏、肠道及脾脏组织中的表达量均显著上调(P<0.05)。双荧光素酶报告系统显示On-Sqstm1蛋白可以显著激活NF-κB活性。以上结果显示，On-Sqstm1蛋白可能通过介导NF-κB信号通路的活性参与对病原体感染的免疫应答过程。本研究为进一步研究On-Sqstm1蛋白的作用机制提供了参考。

关键词：尼罗罗非鱼自噬接头受体蛋白1(Sqstm1) 无乳链球菌 Poly Ⅰ:C 表达模式

尼罗罗非鱼CD209v-1基因表达特征及其功能鉴定

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南方农业学报 2023年第4期54卷 1244-1252页

作者：宋长江喻大鹏赵天珍唐怀庆丘金珠梁富郑汉生黄梅燕黄瑜宋海霞中山市农产品质量安全检验所广东中山528400 广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东海洋大学深圳研究院广东深圳510000

【目的】明确分化群抗原209(CD209)变体CD209v-1与罗非鱼机体免疫功能的相关性,为深入探析CD209及其家族成员在鱼类免疫系统中的作用机制提供理论依据,同时为罗非鱼细菌性疾病的防治及新型疫苗研发打下基础。【方法】采用PCR扩增尼罗罗... 详细信息

【目的】明确分化群抗原209(CD209)变体CD209v-1与罗非鱼机体免疫功能的相关性,为深入探析CD209及其家族成员在鱼类免疫系统中的作用机制提供理论依据,同时为罗非鱼细菌性疾病的防治及新型疫苗研发打下基础。【方法】采用PCR扩增尼罗罗非鱼CD209v-1基因(OnCD209v-1)开放阅读框(ORF),利用Berry-Psite、InterProScan、TMHMM 2.0、ExPASy、SignalP 4.1及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测OnCD209v-1基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达情况。随后克隆OnCD209v-1基因胞外段构建pET-OnCD209v-1重组原核表达质粒,经原核诱导表达后,通过细菌结合试验和凝集试验体外探究rOnCD209v-1蛋白对多种水生动物致病菌的识别结合及凝集功能。【结果】OnCD209v-1基因ORF长780 bp,共编码259个氨基酸残基;OnCD209v-1基因编码蛋白相对分子量为29.424 kD,理论等电点(pI)为6.54,在第113~246位氨基酸间存在1个保守的C型凝集素(CTL)结构域。OnCD209v-1氨基酸序列与横线扁鼻丽鱼CD209氨基酸序列的相似性最高(86.49%),基于CD209氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示尼罗罗非鱼与横线扁鼻丽鱼先聚在同一分支上,二者的亲缘关系较近。OnCD209v-1基因在尼罗罗非鱼各组织中均有表达,尤其以肝脏和肠道中的相对表达量较高,其次是血液。原核诱导表达获得的rOnCD209v-1蛋白能识别并结合多种致病菌,且在Ca2+存在的情况下对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、无乳链球菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌具有凝集活性。【结论】OnCD209v-1基因是罗非鱼CD209基因的变体,具有1个保守的CTL结构域,广泛表达于罗非鱼各组织中;原核诱导表达获得的rOnCD209v-1蛋白能识别并结合嗜水气单胞菌、大肠杆菌、哈维氏弧菌、无乳链球菌、副溶血弧菌及金黄色葡萄球菌等常见致病菌,在Ca2+存在的情况下对多种病原菌具有凝集活性。即OnCD209v-1基因作为重要的免疫分子参与了罗非鱼响应细菌感染的免疫过程。

关键词：尼罗罗非鱼 CD209v-1基因表达特征病原菌凝集活性

尼罗罗非鱼生长性状相关微卫星标记的筛选与验证

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大连海洋大学学报 2023年第6期38卷 925-934页

作者：刘志刚高风英佟延南衣萌萌王淼朱海卢迈新可小丽曹建萌中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 海南省海洋与渔业科学院海南海口570206

为筛选尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长相关微卫星分子标记用于指导其选育工作,选用29个微卫星标记对尼罗罗非鱼高要F_(0)群体、高要F_(1)群体、番禺群体和海南群体的生长性状(体质量、全长、体长、头长、体高和体宽)进行了关联... 详细信息

为筛选尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长相关微卫星分子标记用于指导其选育工作,选用29个微卫星标记对尼罗罗非鱼高要F_(0)群体、高要F_(1)群体、番禺群体和海南群体的生长性状(体质量、全长、体长、头长、体高和体宽)进行了关联性分析和基因型间比较。结果表明:在高要F_(0)群体中29个微卫星位点共检测到242个等位基因,平均等位基因数(N_(a))为8.345,平均观测杂合度(Ho)为0.621,平均多态性信息含量(PIC)为0.842,各位点PIC值均大于0.5,具高度遗传多样性;29个微卫星标记中有6个标记(GM114、GM213、GM423、GM642、UNH130和UNH985)在高要F_(0)群体中与至少一种生长性状显著相关(P尼罗罗非鱼不同世代和不同群体中均与生长性状显著相关,GM642的DD和HH基因型,UNH130的AD、BC和FF基因型,以及UNH985的GH和CF基因型具有明显生长优势,可作为尼罗罗非鱼潜在的生长相关分子标记。

关键词：尼罗罗非鱼高要群体生长性状微卫星标记