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用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的热稳定性

分析试验室 1999年第5期18卷 72-74页

作者：廖杰董方霆赵玉兰解放军总医院医学实验测试中心北京100853 军事医学科学院国家生物医学分析中心北京100850

用尺寸排阻色谱ＺｏｒｂａｘＧＦ２５０凝胶过滤柱研究了核糖核酸酶Ａ、马心肌红蛋白和溶菌酶的热稳定性。测定了蛋白质在尺寸排阻系统中的分配系数Ｋｄ，并用荧光检测器分析了加热引起的蛋白质内源性荧光的改变，从而计算出了蛋白... 详细信息

用尺寸排阻色谱ＺｏｒｂａｘＧＦ２５０凝胶过滤柱研究了核糖核酸酶Ａ、马心肌红蛋白和溶菌酶的热稳定性。测定了蛋白质在尺寸排阻系统中的分配系数Ｋｄ，并用荧光检测器分析了加热引起的蛋白质内源性荧光的改变，从而计算出了蛋白质的热变性转化点温度。测量了蛋白质天然态、热变性和盐酸胍诱导变性状态下的斯托克斯半径，实验结果进一步证实了热变性后蛋白质不是呈真正的随机线状，而是保留了部分紧密的结构区域。

关键词：尺寸排阻色谱法蛋白质热稳定性

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SU-8光刻胶制作三维光子晶体

光电工程 2007年第8期34卷 28-31页

作者：张晓玉高洪涛周崇喜刘强邢廷文姚汉民中国科学院光电技术研究所微细加工光学技术国家重点实验室四川成都610209

针对SU-8光刻胶应用于三维光子晶体的制作研究,本文提出并实现了对SU-8光刻胶的重要成分SU-8环氧树脂采用柱层析和高压液相色谱-尺寸排阻色谱法进行分离,分离结果表明SU-8环氧树脂分子量分布范围很大,从大约100～100000,包括SU-1、SU-2... 详细信息

针对SU-8光刻胶应用于三维光子晶体的制作研究,本文提出并实现了对SU-8光刻胶的重要成分SU-8环氧树脂采用柱层析和高压液相色谱-尺寸排阻色谱法进行分离,分离结果表明SU-8环氧树脂分子量分布范围很大,从大约100～100000,包括SU-1、SU-2、SU-4、SU-6、SU-8多种组分及其混合物.采用分离后的SU-8和SU-6纯组分配制了性能优化的SU-8光刻胶,并总结了其最佳光刻工艺,结合干涉光刻技术制作了晶格常数为922nm的三维面心立方光子晶体结构.

关键词： SU-8光刻胶三维光子晶体柱层析尺寸排阻色谱法

黄芪囊泡样纳米颗粒通过调节肠道菌群降低db/db糖尿病小鼠血糖的作用机制分析

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中国实验方剂学杂志 2021年第14期27卷 111-118页

作者：高文静侯敏陈潇潇王攀任钧国刘建勋中国中医科学院西苑医院基础医学研究所中药药理北京市重点实验室北京100091 北京中医药大学北京100029

目的:研究黄芪水煎液中囊泡样纳米颗粒(VLNs)的提取方法及特性,探讨黄芪VLNs通过调节db/db小鼠肠道菌群来降低血糖的作用机制。方法:采用超速离心法和尺寸排阻色谱法分别富集黄芪水煎液中的VLNs,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析... 详细信息

目的:研究黄芪水煎液中囊泡样纳米颗粒(VLNs)的提取方法及特性,探讨黄芪VLNs通过调节db/db小鼠肠道菌群来降低血糖的作用机制。方法:采用超速离心法和尺寸排阻色谱法分别富集黄芪水煎液中的VLNs,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析仪分析黄芪水煎液中VLNs的形态、粒径、浓度。选用db/db糖尿病小鼠,按血糖值随机分为模型组,黄芪VLNs高、中、低剂量(21.1,10.6,5.3 g·kg^(-1))组和二甲双胍组(0.25 g·kg^(-1)),每组7只,另设7只C57BL/6小鼠作为正常组,灌胃给药3周(每日1次),每周观察小鼠空腹血糖变化;苏木素-伊红(HE)染色观察糖尿病小鼠肝脏和胰腺病理形态情况;采集小鼠粪便进行肠道微生物16S rRNA多样性检测。结果:2种方法所得纳米颗粒粒径均在200 nm左右,超速离心法提取的黄芪VLNs具有典型的茶托状,其浓度为3.0×10^(11)个/mL;尺寸排阻色谱法所得黄芪VLNs形态相对较差,其浓度为2.2×10^(11)个/mL。给药3周后,与模型组比较,黄芪VLNs高、中、低剂量组均能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖(P<0.05,P<0.01);可改善肠道菌群失调,显著降低厚壁菌门/拟杆菌门比例,提高有益菌相对丰度,降低有害菌相对丰度。结论:黄芪VLNs可能通过调节肠道菌群中厚壁菌门/拟杆菌门的比例来降低db/db糖尿病小鼠的血糖。

关键词：黄芪囊泡样纳米颗粒超速离心法尺寸排阻色谱法空腹血糖肠道菌群粒径分布

口蹄疫病毒自身核酸片段对病毒样颗粒组装的促进作用

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生物工程学报 2020年第10期36卷 2076-2082页

作者：柳海云董虎靳野郭慧琛孙世琪中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室OIE/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

选取能够与口蹄疫病毒结构蛋白相互作用且有特殊结构的核酸片段5′非翻译区(5′UTR)和内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)作为支架,进行病毒样颗粒组装的研究。通过对组装产物进行粒径、表面电位、凝胶阻滞、核酸... 详细信息

选取能够与口蹄疫病毒结构蛋白相互作用且有特殊结构的核酸片段5′非翻译区(5′UTR)和内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)作为支架,进行病毒样颗粒组装的研究。通过对组装产物进行粒径、表面电位、凝胶阻滞、核酸酶消化、尺寸排阻色谱、透射电镜、圆二色光谱等检测,结果表明,核酸片段5′UTR和IRES能与口蹄疫病毒样颗粒共组装并形成病毒样颗粒。通过统计学分析发现VLPs-5′UTR的75S颗粒的组装效率显著高于单纯VLPs组(P<0.001)和VLPs-IRES(P<0.01),而VLPs-IRES的12S颗粒的组装效率显著高于单纯VLPs组(P<0.0001)和VLPs-5′UTR(P<0.0001),表明口蹄疫病毒自身核酸片段5′UTR更有利于口蹄疫病毒样颗粒的组装。该研究对促进口蹄疫病毒样颗粒组装提出了新的思路和优化策略,有助于病毒样颗粒疫苗的研发。

关键词：口蹄疫病毒病毒样颗粒 5′非翻译区内部核糖体进入位点尺寸排阻色谱法

β-淀粉样蛋白单体及寡聚体鉴定方法的改进与优化

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中国生物化学与分子生物学报 2017年第8期33卷 835-844页

作者：石镜明刘航马辉武美娜吴涛孙正启西藏民族大学基础医学院形态学教研室陕西咸阳712082

β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)经过自身聚集形成寡聚体,是导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发病的重要风险因素之一。鉴定Aβ寡聚状态对于细胞毒性和寡聚抑制的研究非常重要。本文通过优化Aβ42蛋白用量、增加交联... 详细信息

β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)经过自身聚集形成寡聚体,是导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发病的重要风险因素之一。鉴定Aβ寡聚状态对于细胞毒性和寡聚抑制的研究非常重要。本文通过优化Aβ42蛋白用量、增加交联剂、尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography,SEC)和硫磺素T(thioflavin T,Th T)荧光分析等方法,对Aβ42的蛋白质聚集状态进行检测。得到改进和优化的方案:(1)对电泳和电镜的优化,16.5%的Tris-tricine胶,最适合分析Aβ42寡聚状态。使用电泳和电镜对Aβ42检测时,其用量有较严格的限制。电泳的上样量应为0.5μg最佳。50μg/m L Aβ42单体浓度,最适合电镜观察;(2)对Aβ42交联的优化,终浓度为0.3mmol/L BS3,有利于对Aβ42寡聚体的区分;(3)SEC可以利用凝胶孔隙的大小,实现Aβ42单体和寡聚体在非变性条件下的分离。与Aβ40相比,Aβ42进行SEC分析时,单次上样量需达到6.75μg以上;(4)细胞毒性实验和Th T检测,可以反馈Aβ42寡聚状态的鉴定效果。上述检测方法的细化和改进,将为Aβ42肽在AD的研究中提供一定的参考。一些Aβ42特异性寡聚体的鉴定方法本文未提及,仍需要在今后的研究中进一步改进与优化。

关键词： β-淀粉样蛋白电泳尺寸排阻色谱法交联

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用尺寸排阻色谱测定蛋白质的构象转化点

现代科学仪器 2005年第5期 51-53页

作者：廖杰董方霆于力方赵玉兰北京100850 国家生物医学分析中心解放军总医院医学实验测试中心解放军总医院医学实验测试中心北京100853

建立了用尺寸排阻色谱研究蛋白质构象改变转化点的方法,测定了核糖核酸酶A在尺寸排阻色谱系统中的分配系数K d,并用荧光检测器监测了加热所导致的蛋白质内源性荧光变化,从而计算出了核糖核酸酶A的热变性转化温度。通过液相色谱梯度洗脱... 详细信息

建立了用尺寸排阻色谱研究蛋白质构象改变转化点的方法,测定了核糖核酸酶A在尺寸排阻色谱系统中的分配系数K d,并用荧光检测器监测了加热所导致的蛋白质内源性荧光变化,从而计算出了核糖核酸酶A的热变性转化温度。通过液相色谱梯度洗脱系统在线增加尿素浓度,测定K d值的动态变化,计算出使溶菌酶发生变性的尿素溶液浓度。用所建立的方法绘制了蛋白质变性前后的尺寸排阻色谱工作曲线,探讨了溶液p H对核糖核酸酶A热稳定性的影响。

关键词：尺寸排阻色谱法蛋白质构象转化点

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利用色谱法研究α－淀粉酶变性动力学

色谱 1995年第1期13卷 51-52,55页

作者：程克勤党鑫让李华儒西北大学化工系

提出用尺寸排阻色谱法研究酶的变性动力学。此法将高效色谱分离同灵敏的紫外检测结合起来，消除了紫外法测定蛋白质变性速度时变性体的影响。确定了个淀粉酶在盐酸胍溶液中变性时的反应级数，测定了不同浓度变性剂中酶的变性速度常数，... 详细信息

提出用尺寸排阻色谱法研究酶的变性动力学。此法将高效色谱分离同灵敏的紫外检测结合起来，消除了紫外法测定蛋白质变性速度时变性体的影响。确定了个淀粉酶在盐酸胍溶液中变性时的反应级数，测定了不同浓度变性剂中酶的变性速度常数，并和失活速度常数进行了比较，讨论了影响酶变性速度的因素。

关键词：尺寸排阻色谱法 α-淀粉酶变性动力学

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抗Her2抗体偶联药物的偶联工艺开发

抗Her2抗体偶联药物的偶联工艺开发

作者：范啸宇上海交通大学

学位级别：硕士

随着2013年治疗乳腺癌的kadcyla被FDA批准上市,ADC药物得到了飞速发展。到目前为止,已经有四种ADC药物获准上市,市场非常广阔。但是ADC药物在血浆中必须保持足够的稳定性,进入肿瘤细胞后又必须快速准确地释放出来,因此对ADC药物的质量... 详细信息

随着2013年治疗乳腺癌的kadcyla被FDA批准上市,ADC药物得到了飞速发展。到目前为止,已经有四种ADC药物获准上市,市场非常广阔。但是ADC药物在血浆中必须保持足够的稳定性,进入肿瘤细胞后又必须快速准确地释放出来,因此对ADC药物的质量提出了很高的要求。而ADC药物的偶联工艺更是保证ADC药物质量标准的最重要环节之一。本课题着重研究抗Her2抗体偶联药物的偶联工艺开发,并探索了ADC药物的偶联工艺的影响因素。本文主要利用化学偶联方法将抗her2抗体的赖氨酸残基与小分子细胞毒素DM1通过SMCC相连接,研究了影响最终关键质量属性药物抗体连接比例(DAR值)和SEC-HPLC单体纯度的关键因素,并通过实验设计(DOE)确定实验计划,模拟出相应的分析模型。通过对方差、误差统计和残差的分析验证了模型的可靠性,并通过等高线图和3D曲面图分析各个关键影响因素的权重,最终通过模型模拟出优选条件,并加以验证。首先,我们将抗体的赖氨酸残基与SMCC相接,通过分析发现反应时间、反应p H值和抗体与SMCC的比例是影响DAR值的三个影响因素。通过响应面法进行实验设计,根据结果得知SMCC与抗体的摩尔浓度比对结果影响最大,其次是反应时间,最后是反应p H值。初步选定反应p H 6.0,反应时间100分钟,SMCC与抗体的摩尔浓度比为8作为第一步的反应条件。接下来,将第一步的产物与小分子毒素DM1相连,通过分析发现反应p H值、反应时间和DM1与抗体的摩尔比对最终产品的抗体偶联比例和SEC-HPLC单体纯度都有影响。通过响应面法进行试验设计,根据结果得知,对于DAR值而言,反应p H值影响最大,其次是反应时间,而DM1与抗体的摩尔比在限定范围内对结果影响不是很大。而对于最终产品的SEC-HPLC单体纯度而言,反应p H值影响最大,反应时间和DM1与抗体的摩尔比对结果影响都不是很大。综合两方面的结果,选定反应p H 5.2,反应时间5小时(300分钟),DM1与抗体的摩尔浓度比为7.3作为第二步的反应条件。将得到的第一步和第二步的反应条件进行三次平行验证试验,最终的UV-DAR值为3.52,SEC-HPLC单体纯度为98.8%,符合设定的质量要求。

关键词：抗体偶联药物抗her2抗体试验设计反应时间反应pH值药物抗体连接比例尺寸排阻色谱法

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基于光散射效应的精浆外泌体检测研究

基于光散射效应的精浆外泌体检测研究

作者：张群福建师范大学

学位级别：硕士

不育症一直是生殖系统疾病的重大难题,男性因素导致不育约占整体不孕不育病症的50%。无精子症是男性射精中缺乏精子的一种男性不育症,在男性不育症患者中,无精子症的患者占不育男性的10%。无精子症的确诊目前主要依赖专业医疗机构开展... 详细信息

不育症一直是生殖系统疾病的重大难题,男性因素导致不育约占整体不孕不育病症的50%。无精子症是男性射精中缺乏精子的一种男性不育症,在男性不育症患者中,无精子症的患者占不育男性的10%。无精子症的确诊目前主要依赖专业医疗机构开展检查和分析。然而,临床上显微镜下观察精液中精子细胞存在与否,进而诊断无精子症存在主观性,且不同的仪器和实验检测条件易导致诊断结果的差异。尤其,区分患者是否患有梗阻性或非梗阻性无精子症,临床常规方法存在一定诊断困难,患者需要接受活检检查,造成心理压力,存在一定的损伤风险。因此,探寻更加安全和有效的方法来评估和分析无精子症,进而辅助解决男性低生育能力问题,无疑具有重要的学术和社会意义。本论文针对男性无精子症问题以光散射效应原理为理论基础,聚焦光散射效应中的丁达尔效应以及拉曼散射效应,开展无精子症患者精浆外泌体的光学检测,旨在尝试发展一种基于光散射效应技术的男性生育能力检测评估新技术。本论文的主要内容包括:1、第一章节首先介绍了光散射效应的基本概念及其所包含的散射类型;接着分别介绍了弹性散射的丁达尔效应与非弹性散射的拉曼散射效应,以及他们在生物医学领域中的检测应用;最后介绍了外泌体的组成,以及外泌体检测与男性生殖生育能力的关系及检测的重要性。2、在第二章的工作中,提出了一种采用智能手机记录胶体产生的丁达尔效应的便携式检测方法。通过向纳米胶体溶液中加入肌酐的操作,初步开展基于丁达尔效应的生物传感检测可行性评估。即当纳米粒子与肌酐发生作用,促使纳米粒子聚集,在638 nm红色激光笔照射下,产生光路“增强”的丁达尔效应现象,通过智能手机记录,随后开展丁达尔效应图像的灰度值分析,进而实现反映肌酐含量的定量检测。该章节提出的丁达尔效应检测方法策略具有简便、低成本和易操作的优点,为肌酐检测乃至推广到其它物质的检测提供了一种潜在的便携检测新方法。3、第三章中,使用尺寸排阻色谱法进行精浆外泌体的提取,结合多种手段对提取出的精浆外泌体进行表征,接着利用丁达尔效应对经色谱柱提取的精浆外泌体进行浓度检测表征。初步结果表明,使用色谱柱可有效地进行精浆外泌体提取,实现精浆样本中外泌体与其他物质的有效分离。随后,利用丁达尔效应对外泌体的浓度进行检测,获得外泌体检出限为10～5 Particles/m L。通过色谱柱与丁达尔效应相结合,可缩短外泌体检测时间,无需大型仪器设备的使用,以及实现外泌体的低成本检测。我们期待将该外泌体提取、检测的方法优化,有望为今后开展基于外泌体的疾病个性化诊疗发挥重要作用。4、第四章主要介绍利用SERS技术开展对无精子症患者精浆外泌体的评估研究。研究以金纳米粒子为SERS基底,优化参数以获取高质量的外泌体SERS光谱;此外,探究正常与无精子症两类精浆外泌体生化成分差异的SERS光谱响应,结合多种机器学习方法,成功构建对外泌体SERS光谱的判别分析诊断模型(准确率为99.59%)。研究有望实现提供基于SERS技术的无精子症评估的新技术路线。综上,将丁达尔效应应用于生物医学领域的检测,并通过对肌酐的检测验证丁达尔效应在生物医学领域检测的可行性,构建基于丁达尔效应的便携式检测方法,成功地应用丁达尔效应检测精浆外泌体的浓度;此外,利用拉曼散射效应的SERS技术,结合多种机器学习模型分析方法,可有效区分无精子症和正常精浆外泌体。本论文研究有望为男性不育症的检测和诊断评估提供无损、便携、快速的潜在新方法,具有广阔的临床应用前景。

关键词：光散射效应丁达尔效应表面增强拉曼光谱尺寸排阻色谱法精浆外泌体机器学习