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尤氏泰勒虫重组抗原TuIP免疫保护效果评价

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尤氏泰勒虫重组抗原TuIP免疫保护效果评价

作者：袁延庆中国农业科学院

学位级别：硕士

尤氏泰勒虫（Theileria uilenbergi）是引起我国山羊和绵羊泰勒虫病的最主要病原之一。该病原由青海血蜱（Haemaphysalis qinghaiensis）和长角血蜱（H. longicornis）传播，寄生于山羊和绵羊淋巴细胞和红细胞内，引起动物发热、贫血和... 详细信息

尤氏泰勒虫（Theileria uilenbergi）是引起我国山羊和绵羊泰勒虫病的最主要病原之一。该病原由青海血蜱（Haemaphysalis qinghaiensis）和长角血蜱（H. longicornis）传播，寄生于山羊和绵羊淋巴细胞和红细胞内，引起动物发热、贫血和黄疸等症状，并常常导致动物死亡，给我国养羊业造成了重大经济损失。目前，该病的防治措施主要集中在传统的化学药物上，但存在着耐药性、药物残留、畜产品安全以及蜱的反复叮咬导致羊泰勒虫病频发等问题，寻求新的更为安全有效的防治措施将是解决这些问题的主要途径。本研究对尤氏泰勒虫红细胞阶段裂殖子cDNA表达文库免疫筛选出的抗原性基因TuIP进行重组和原核表达，将表达的重组蛋白rTuIP作为抗原免疫绵羊，同时将相应的空载体pEQ31表达的His标签蛋白作为对照。然后用感染尤氏泰勒虫的青海血蜱/虫血攻击绵羊，观察绵羊的反应并收集各项实验数据。统计结果显示：一、在蜱攻击实验中，免疫组动物在初免后7天便产生了特异性抗体，二免后14天便达到了高峰，之后一直保持很高水平;而对照组动物在初期则没有产生特异性抗体，但在攻蜱后30天，即大量裂殖子入侵红细胞时产生了呈大幅增长趋势的抗体，直至接近于免疫组水平。在红细胞内梨形虫的计数中，免疫组的最高染虫率（2.24%）要显著低于（P＜0.05）对照组（12.8%）且峰值出现较晚。免疫组绵羊的贫血程度要轻于对照组，体温也提前恢复到正常水平。二、在虫血攻击实验中，免疫组动物抗体的产生情况与蜱攻击免疫组结果相似。不同的是，对照组中动物产生的抗体则是以渐增式的方式增长并最终接近于免疫组水平。免疫组（0.21%）和对照组（0.37%）的最高染虫率均明显低于蜱攻击实验中的。贫血程度均较轻，无发热症状。迄今为止，在我国尚没有成功研制可用于羊的泰勒虫病防治疫苗的报道。尤氏泰勒虫的致病性强，对我国养羊业的危害大，其疫苗的研发十分重要。然而，目前该虫种的体外培养系还没有建立，不能通过体外培养的方式获得大量虫体，因此成功研制强毒或弱毒疫苗的可能性就很小。本实验通过评价TuIP重组抗原的免疫保护性，证明该抗原能刺激机体产生特异性抗体，该特异性抗体对红细胞阶段的虫体入侵有一定的抑制作用，有望作为阶段性保护抗原的候选分子。以上结果为进一步鉴定抗原表位和新型疫苗研究奠定了基础。

关键词：尤氏泰勒虫 TuIP 重组蛋白免疫保护

尤氏泰勒虫Tu88基因的特性分析及初步应用

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尤氏泰勒虫Tu88基因的特性分析及初步应用

作者：汪月凤中国农业科学院

学位级别：硕士

尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫是引起我国绵羊和山羊泰勒虫病的主要病原。该病呈地方性流行，在我国西北地区分布最为广泛，严重影响着养羊畜牧业的发展。目前对该病有效的防控手段还十分有限。前期的研究中，通过血清学方法从尤氏泰勒虫的红... 详细信息

尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫是引起我国绵羊和山羊泰勒虫病的主要病原。该病呈地方性流行，在我国西北地区分布最为广泛，严重影响着养羊畜牧业的发展。目前对该病有效的防控手段还十分有限。前期的研究中，通过血清学方法从尤氏泰勒虫的红细胞裂殖子cDNA文库中筛选出了一个具有抗原性的阳性克隆Tu88，为了弄清该基因的应用前景，本研究对该克隆及其编码蛋白的特性展开了研究。利用生物信息学软件确定其ORF以及相应的蛋白质序列，预测蛋白等电点及分子量大小、二级结构、信号肽的位置、跨膜结构、B细胞抗原表位优势位点，并对该蛋白进行亚细胞定位。结果发现Tu88编码的蛋白具有信号肽、跨膜结构域和抗原决定簇，是一个具有潜在抗原性的基因。设计引物从尤氏泰勒虫裂殖子基因组DNA中扩增出目的基因，与从cDNA文库中获得的序列一致，说明该基因无内含子。但并未能从吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、绵羊无浆体、绵羊巴贝斯虫等的基因组中扩增出同源基因，表明该基因是尤氏泰勒虫特有的。将其部分片段克隆到pET-30（a）载体中进行原核表达，western blot分析纯化的重组蛋白，发现它具有良好的反应原性，能特异地检测出尤氏泰勒虫阳性血清，而与阴性血清及其他相近虫种的阳性血清无交叉反应。还利用Southern blot分析Tu88的拷贝数，将尤氏泰勒虫基因组以不同的限制性内切酶进行消化，用0.8%的琼脂糖凝胶分离片段大小不同的DNA分子再转移到尼龙膜上，之后的标记和检测程序按照地高辛标记试剂盒操作，用化学发光法检测，结果均出现单一条带，阴性对照无条带，说明Tu88基因是以单拷贝形式存在的。从尤氏泰勒虫基因组中扩增出Tu88基因不包括终止密码子的ORF序列，与pEGFP-N1载体重组，构建出真核表达载体pEGFP-N1-Tu88。利用脂质体转染法将pEGFP-N1-Tu88转入CHO细胞中，以探究单独表达的目的蛋白Tu88在异源性真核表达体系CHO中的表达行为。通过在倒置荧光显微镜下观察并结合western blot检测结果，确定目的蛋白获得了正确表达，利用激光扫描共聚焦显微镜将Tu88蛋白的表达主要定位于细胞浆中。利用原核表达的rTu88初步建立了诊断尤氏泰勒虫的间接ELISA方法，能有效地检测出3只绵羊感染尤氏泰勒虫后的抗体，对其效价的动态变化检测，发现血清中抗Tu88的抗体能持续存在100天以上。以上的研究结果揭示了Tu88基因的生物学特性，也提示其具有潜在的应用价值。但它的功能还有待进一步探究，我们推测它有可能在虫体侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用成为寄生虫-宿主相互作用的候选分子，也可能在虫体侵入后刺激宿主细胞产生主要的抗体成为新型诊断方法和亚单位疫苗研究的候选分子。

关键词：尤氏泰勒虫 Tu88基因原核表达 Southern blot 真核转染

吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫内转录间隔区基因序列的测定与系统进化分析

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中国兽医科学 2008年第5期38卷 365-369页

作者：牛庆丽邱家祥关贵全马米玲刘志杰党志胜刘爱红高金亮任巧云李有全刘军龙白启罗建勋殷宏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

自试验感染吕氏泰勒虫（渭源株）和尤氏泰勒虫（隆德株）绵羊的血液中纯化虫体，提取虫体基因组DNA，通过PCR扩增内转录间隔区（ITS1-5．8S-ITS2 rRNA）基因，然后进行测序，构建了系统发生树并与GenBank中各种动物梨形虫的ITS1-5．8S-I... 详细信息

自试验感染吕氏泰勒虫（渭源株）和尤氏泰勒虫（隆德株）绵羊的血液中纯化虫体，提取虫体基因组DNA，通过PCR扩增内转录间隔区（ITS1-5．8S-ITS2 rRNA）基因，然后进行测序，构建了系统发生树并与GenBank中各种动物梨形虫的ITS1-5．8S-ITS2 rRNA基因序列进行比较。结果显示，这两种泰勒虫的ITS1-5．8S-ITS2 rRNA基因大小为817-842bp，同源性高达96．8％，分布在同一大枝上。通过比较ITS基因的同源性，尤其是ITS2基因的变异性，可以区别这两种泰勒虫与其他梨形虫。

关键词：系统进化分析吕氏泰勒虫尤氏泰勒虫内转录间隔区基因

吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫形态学、标签基因选择及其遗传进化分析

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江苏农业科学 2022年第9期50卷 173-178页

作者：李中波李晖罗世民怀化职业技术学院湖南怀化418000 湘西民族职业技术学院湖南吉首416000

为比较吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫形态学及选择合适基因标签,以期探究它们间的遗传进化关系。借助光学显微镜观察2种泰勒虫的形态结构;利用PCR技术分别扩增了吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫的cox1、18S rRNA及28S rRNA等3个标签基因的部分序列,分... 详细信息

为比较吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫形态学及选择合适基因标签,以期探究它们间的遗传进化关系。借助光学显微镜观察2种泰勒虫的形态结构;利用PCR技术分别扩增了吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫的cox1、18S rRNA及28S rRNA等3个标签基因的部分序列,分别比对它们相应基因的同源性,分析吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫基因差异,并利用其cox1、18S rRNA和28S rRNA基因序列分别构建了它们的遗传进化树。研究结果表明,吕氏泰勒虫多呈圆点形、卵圆形和短杆状,而尤氏泰勒虫多呈逗点状、十字架状及三叶草形;吕氏泰勒虫cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的长度分别为1122、1303、1995 bp;尤氏泰勒虫cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的长度分别为1123、1303、1990 bp;两者cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列比对,其相似度分别为80.32%、95.87%及88.64%;所构建的3个遗传进化树均显示吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫未处于进化树一分支。提示吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫尽管形态极为相似,但它们间存在较远的亲缘关系,且cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列适用于泰勒虫种属的鉴别。

关键词：吕氏泰勒虫尤氏泰勒虫形态学标签基因选择遗传进化

鉴别诊断尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的LAMP方法的建立与初步应用

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鉴别诊断尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的LAMP方法的建立与初步应用

作者：刘庆东北农业大学

学位级别：硕士

羊泰勒虫病（ovine and caprine theileriosis）是中国西北地区广泛分布的一类血液原虫病，该病危害严重，给养羊业造成重大经济损失。我国的羊泰勒虫病主要由两种泰勒虫引起——吕氏泰勒虫（T. luwenshuni）和尤氏泰勒虫（T. uilenberg... 详细信息

羊泰勒虫病（ovine and caprine theileriosis）是中国西北地区广泛分布的一类血液原虫病，该病危害严重，给养羊业造成重大经济损失。我国的羊泰勒虫病主要由两种泰勒虫引起——吕氏泰勒虫（T. luwenshuni）和尤氏泰勒虫（T. uilenbergi）（早期被认为是莱氏泰勒虫（***））。大多数羊泰勒虫病例是属于吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的混合感染，但是传统的方法很难区分开，因此找到快速准确的检测技术，用于鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的感染，成了现阶段的当务之急。本文主要是针对吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的18S rRNA基因序列高变区，分别设计4条特异地识别6个区域的LAMP引物。通过优化条件，扩增产物的序列测定，评价特异性和敏感性，同时经实验动物感染样品的评价，建立了一个可以鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的LAMP方法，并在小范围的流行病学调查中进行了初步的应用。研究结果表明：根据18S rRNA的基因序列设计的通用引物可以同时检测到吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫，并且与其他的梨形虫无交叉反应。根据18S rRNA的基因序列设计的吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性引物TC1、TC2，与羊的其它梨形虫无交叉反应，敏感性分别可以达到2pg/μL和2pg/μL。扩增产物测序分析显示目的片段的测序结果与NCBI上已经提交的吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫18S rRNA序列对比完全吻合。本研究所建立的LAMP方法可以在试验羊攻蜱后14d检测出吕氏泰勒虫，尤氏泰勒虫泰勒虫13d可以检测出，均早于传统镜检的方法，说明该方法可以用于早期诊断。在对野外样品的检测中，广西壮族自治区没有发现羊泰勒虫的感染;广东省、贵州省、重庆市仅检测出吕氏泰勒虫;甘肃省既发现了吕氏泰勒虫也检测出了尤氏泰勒虫，在92份检测样品中有21份为共同感染。本研究通过对所建立的LAMP方法的敏感性与特异性、在感染羊泰勒虫的动物中最早能检测出的时间对比以及野外样品的检测，证实本实验建立的鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的LAMP方法可以用于早期诊断、鉴别诊断、以及两种泰勒虫流行病学调查，可以在基层兽医机构推广，对确定我国羊泰勒虫分布有着实际应用意义。

关键词：吕氏泰勒虫尤氏泰勒虫环介导等温扩增技术 18S rRNA 鉴别诊断

羊尤氏泰勒虫一个新生多肽复合物α多肽基因的cDNA文库筛选和测序(英文)

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中国动物传染病学报 2010年第4期18卷 60-65页

作者：党志胜刘志杰罗建勋关贵全马米玲刘爱红李有全高金亮任巧云白启杉本千寻殷宏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国兰州730046 日本北海道大学人兽共患病研究中心国际协力教育机构日本札幌001-0020

为筛选羊尤氏泰勒虫裂殖子功能基因,用羊尤氏泰勒虫裂殖子提取物免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14细胞融合,融合细胞培养上清用酶联免疫吸附法和免疫印记法检测。提取羊尤氏泰勒虫裂殖子mRNA后,进行cDNA合成与文库构... 详细信息

为筛选羊尤氏泰勒虫裂殖子功能基因,用羊尤氏泰勒虫裂殖子提取物免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14细胞融合,融合细胞培养上清用酶联免疫吸附法和免疫印记法检测。提取羊尤氏泰勒虫裂殖子mRNA后,进行cDNA合成与文库构建。文库在免疫学噬斑筛选后,将阳性克隆进行测序和序列BLAST搜索。筛选结果显示有两个阳性克隆。所得序列BLAST搜索结果显示,它与12类寄生虫新生多态相关复合物α多肽基因的同源性在39%到78%之间。结果提示,所筛选的序列为羊尤氏泰勒虫裂殖子新生多态相关复合物α多肽基因不完全序列。该研究为今后使用单克隆抗体筛选羊泰勒虫功能性基因提供了参考。

关键词：尤氏泰勒虫裂殖子 cDNA文库单克隆抗体测序新生多肽相关复合物

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两种羊泰勒虫的形态学观察和比较

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第2期27卷 184-186页

作者：李有全关贵全马米玲罗建勋殷宏家畜疫病病原生物国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

经PCR鉴定的吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫各感染1只除脾绵羊,取羊耳尖血涂片,光学显微镜观察其形态。两种泰勒虫的细胞浆呈浅蓝色,细胞核为紫色,主要形态包括梨籽形、圆形(或卵圆形)、针形、杆状、三叶草形、十字架形、逗点形和不规则形等。... 详细信息

经PCR鉴定的吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫各感染1只除脾绵羊,取羊耳尖血涂片,光学显微镜观察其形态。两种泰勒虫的细胞浆呈浅蓝色,细胞核为紫色,主要形态包括梨籽形、圆形(或卵圆形)、针形、杆状、三叶草形、十字架形、逗点形和不规则形等。在整个病程中,梨籽形、圆形(或卵圆形)和针形3类虫体数量居多。两种羊泰勒虫在形态学上无明显差异。

关键词：吕氏泰勒虫尤氏泰勒虫形态学

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羊尤氏泰勒虫病的病理学观察

畜牧兽医学报 2008年第11期39卷 1567-1574页

作者：李有全罗建勋关贵全马米玲高金亮刘志杰党志胜刘爱红任巧云刘军龙鲁炳义陈怀涛白启魏永红牛庆丽田占成殷宏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室兰州730046

对尤氏泰勒虫人工感染的绵羊进行了病理学观察。主要的组织病变:淋巴结充血、出血及淋巴窦网状内皮细胞增生;肺脏出血,间质淋巴细胞和网状细胞增生,肺泡隔增厚;肾小球内皮细胞、血管内皮细胞增生,淋巴网状细胞灶状积累,甚至形成结节;心... 详细信息

对尤氏泰勒虫人工感染的绵羊进行了病理学观察。主要的组织病变:淋巴结充血、出血及淋巴窦网状内皮细胞增生;肺脏出血,间质淋巴细胞和网状细胞增生,肺泡隔增厚;肾小球内皮细胞、血管内皮细胞增生,淋巴网状细胞灶状积累,甚至形成结节;心肌细胞变性、坏死,染色不均;肠道固有膜明显充血、出血;肝细胞颗粒变性,有散在细胞坏死,汇管区和小叶间有淋巴网状细胞增生;瘤胃黏膜下层有散在性出血,肌层见灶状出血。

关键词：尤氏泰勒虫实验感染病理变化

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羊梨形虫分子分类遗传标记的研究进展

中国预防兽医学报 2020年第3期42卷 309-314页

作者：郝桂英西昌学院动物科学学院四川西昌615013

羊梨形虫(piroplasms)隶属于顶复门(Apicom-plexa)、孢子虫纲(Sporozoea)、梨形虫亚纲(Piro-plasmia)、巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)[1]。

关键词：巴贝斯虫未定种系统发育树基因序列尤氏泰勒虫吕氏泰勒虫梨形虫分子分类绵羊泰勒虫