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猪链球菌抗氧化应激蛋白的鉴定及小RNA rss03靶位的筛选

猪链球菌抗氧化应激蛋白的鉴定及小RNA rss03靶位的筛选

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作者：王硕玥南京农业大学

学位级别：硕士

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原,可引发猪的脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎、败血症甚至死亡。宿主的免疫活性细胞,如巨噬细胞、中性粒细胞等,可产生活性氧,如超氧化物、过氧化氢(H2O2)、羟自由基等,对细菌... 详细信息

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原,可引发猪的脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎、败血症甚至死亡。宿主的免疫活性细胞,如巨噬细胞、中性粒细胞等,可产生活性氧,如超氧化物、过氧化氢(H2O2)、羟自由基等,对细菌的蛋白质、脂类和DNA等大分子造成损伤,从而对细菌发挥杀伤作用。但目前关于猪链球菌抗氧化应激的机制了解还很有限。课题组前期研究发现小RNA(srna)rss03参与猪链球菌抗氧化应激,促进猪链球菌在血液中存活,但机制未知。本研究通过寻找猪链球菌抗氧化应激相关蛋白及rss03靶位,为揭示猪链球菌的抗氧化应激机制及rss03在致病中的作用参考。1.猪链球菌抗氧化应激蛋白的鉴定为揭示猪链球菌抗氧化应激的机制,采用比较蛋白组学方法,鉴定猪链球菌抗氧化应激相关蛋白。提取猪链球菌全菌蛋白,以THB培养基培养的细菌作为对照,经H2O2处理后,液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)共鉴定出54个差异表达蛋白,其中28个蛋白在H2O2处理组中上调表达,26个蛋白下调表达。这些差异表达的蛋白主要参与胞内代谢、生物合成、抗应激等过程。选择在H2O2处理组显著上调表达的两个蛋白YbaB/EbfC家族核苷相关蛋白(YED)和2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶二磷酸激酶(AHH)进行验证。分别构建二者缺失株ΔYED和△AHH;生长曲线分析表明,两个缺失株在THB培养基中生长与野生株相似;氧化应激实验表明,经H2O2作用后,野生株存活率为97.12%,而ΔYED与ΔAHH则显著降低,分别为72.69%(p小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬与存活实验表明,RAW264.7对野生株和缺失株的吞噬率无显著差异,但与野生株相比,△YED与ΔAHH在RAW264.7内的存活率显著降低。本研究鉴定的差异表达蛋白,有助于揭示猪链球菌的抗氧化应激机制,其中YED和AHH与猪链球菌在吞噬细胞内存活相关,提示它们在猪链球菌致病过程中发挥作用。2.小RNA rss03靶位的筛选srnas靶位的鉴定对于揭示srna的功能及调控机制至关重要,而且相关研究在革兰氏阳性菌中很少。前期研究发现,猪链球菌srna rss03参与猪链球菌抗氧化应激机制,促进猪链球菌在血液中存活,但其调控的靶位未知。采用MS2识别序列纯化(MAPS)和蛋白质组技术(LC-MS/MS),并结合生物信息学方法,筛选rss03靶位。构建表达MS2-rss03的融合srna质粒pSET2-MS2-rss03和对照质粒pSET2-MS2。MAPS结果显示:与对照组相比,差异表达大于两倍的基因有155个;在MS2-rss03组显著上调表达的有116个基因;在MS2-rss03组显著下调表达的有39个基因。LC-MS/MS结果显示,差异表达蛋白总共有53个,其中34个在缺失株△rss03实验组中上调表达,19个在缺失株Δrss03实验组中下调表达。MAPS和LC-MS/MS共同筛选到的候选有8个,其中值得关注的是参与甘油与糖代谢的操纵子NJAUSSS04010-NJAUSSS04015在MS2-rss03组中显著富集,并且这两个蛋白在Δrss03中上调表达,预测rss03可同时结合这两个基因的核糖体结合位点(RBS)区域,通过LacZ翻译融合,明确rss03负调这两个直接靶位。另外,LC-MS/MS结果显示,SufD、SufS、SufU、SufB在Δrss03中显著下调,这4个蛋白由SufCDSUB基因簇编码,该基因簇参与铁硫簇的合成,在抗氧化应激和铁的代谢当中发挥重要的作用;而且预测rss03可结合SufC的5’UTR,结合位点远离RBS区域,推测rss03结合靶位后改变mRNA结构,释放原本封闭的RBS区域,促进蛋白的翻译。提示除了通过参与抗氧化应激,促进猪链球菌在血液中存活之外,rss03可能还具有其他重要的生物学功能,如参与甘油与糖代谢等,帮助猪链球菌在宿主体内增殖。

关键词：猪链球菌抗氧化应激小srna 靶位筛选

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