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双生病毒侵染引起的本氏烟（Nicotiana benthamiana）小rna群体变异

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双生病毒侵染引起的本氏烟（Nicotiana benthamiana）小RNA群体变...

作者：闫成海浙江大学

学位级别：硕士

本氏烟作为研究病原物与宿主互作的模式生物,同时也是双生病毒感染的主要宿主之一。双生病毒在我国的快速蔓延,对作物生产造成了严重的经济损失,研究其与植物宿主间的互作关系变得越来越重要。双生病毒TYLCCNV单独侵染植物并不造成症状,... 详细信息

本氏烟作为研究病原物与宿主互作的模式生物,同时也是双生病毒感染的主要宿主之一。双生病毒在我国的快速蔓延,对作物生产造成了严重的经济损失,研究其与植物宿主间的互作关系变得越来越重要。双生病毒TYLCCNV单独侵染植物并不造成症状,而TYLCCNV及其卫星I)NA(TYLCCNB)共同侵染则会造叶片卷曲、黄化、花叶等症状。本研究利用TYLCCNV侵染(对照)、TYLCCNV和其β卫星TYLCCNB共同侵染以及TYLCCNV和无义突变后的TYLCCNB (mβ)共同侵染本氏烟后深度测序获得的small rna表达数据,第一次在全基因组水平上对双生病毒侵染前后本氏烟体内small rna群体的变化进行了深入研究。本研究共使用了来自三组文库的479万多条特异读序用于mirna和phased sirna的鉴定。通过生物信息学方法,共预测出了392个可能的nirna基因和一批phased sirna。对TYLCCNV和TYLCCNB侵入后本氏烟mirna群体的表达水平研究发现,有148个mirna基因显著上调表达,有31个mirna基因显著下调。对检测到的mirna*的研究发现, mirna*的表达水平和mirna基本一致,但上调或者下调幅度要大于mirna。93%的mirna基因(265个)可以在本氏烟基因集中找到共1346个靶基因,对这些靶基因进行功能聚类分析,发现有接近50%的靶基因富集在绑定和催化相关的GO子目录下,说明了mirna在转录过程中发挥着重要的作用。对27个未预测到靶基因的mirna基因研究发现,22个核苷酸的miR7122在3个库中都具有较高的表达量,其可能潜在的作用是介导tasirna形成,该途径可能是不同于拟南芥中miR173、 miR390和miR828介导的ta-sirna形成途径。通过比较β和mβ侵染后的rnirna群体变化,发现在β卫星侵染中上调或者下调的mirna,在mβ中大部分出现了回复现象。这种现象暗示着,双生病毒通过srna途径上调或者下调一些基因的表达而致病;而本氏烟在抵抗双生病毒侵染过程中,可能通过降低β卫星的活性来减少病毒带来的伤害。

关键词：双生病毒本氏烟小rna mirna sirna

鼠疫耶尔森氏菌外源获得性质粒编码小rna的筛选、鉴定与功能的初步研究

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鼠疫耶尔森氏菌外源获得性质粒编码小RNA的筛选、鉴定与功能的初...

作者：王红朵安徽大学

学位级别：硕士

研究背景鼠疫是一种自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)鼠疫菌共含有3个质粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1质粒为鼠疫菌和假结核耶尔森氏菌所共有,pMT1与pPCP1质粒则是鼠疫菌在进化过程中外源性获得的,为鼠疫菌所特... 详细信息

研究背景鼠疫是一种自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)鼠疫菌共含有3个质粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1质粒为鼠疫菌和假结核耶尔森氏菌所共有,pMT1与pPCP1质粒则是鼠疫菌在进化过程中外源性获得的,为鼠疫菌所特有,与鼠疫菌的致病性密切相关。细菌中除了蛋白类的调控因子之外,还存在许多发挥调控作用的非编码rna(non-coding rna),在细菌中也称作小rna(small rna,小 rna)。小rna作为调节子,可参与细菌内铁代谢、糖代谢、群体感应、外膜蛋白合成、毒力等生理功能的调控,对原核生物生理和毒力发挥着重要的调节作用。本研究利用高通量测序技术对在不同条件下生长的鼠疫菌提取它的总rna进行转录组测序,新发现了104个小rna,其中包括pMT1与pPCP1质粒上的多个小rna,而这两个质粒又是鼠疫菌在进化过程中获得的,因此验证pMT1与pPCP1质粒上小rna的功能是鼠疫菌致病机制研究的重要组成部分。本研究旨在利用Northern blot验证新发现的小rna,并构建小rna的基因缺失株,通过一系列的表型筛选实验,初步探究了小rna对鼠疫菌生存能力和致病能力的影响。结果与讨论：(1) 利用Northern blot实验方法共确定了10个小rna的存在,分别为sRl8、sR3425、sR3457、sR3461、sR3446、sR3411、sR4338、sR4340、sR6142和sR6143,又对本次确定的小rna和前期验证的部分小rna做了大小和Hfq依赖性的验证。验证大小的小rna有sR16、sR271、sR82、sR138、sR524、sR503、sR3446、sR3457、sR3461、sR4338、sR4340、sR6142、sR6143、sR18和sR3411共15个,这些小rna的大小基本和预测结果一致。sR16、sR4338、sR82、sR138和sR510在野生株的表达量高于Hfq突变株,因此这些小rna的稳定表达依赖于Hfq蛋白,sR271、sR363、sR524、sR3461、sR18和sR3411在野生株中和Hfq突变株中的表达量几乎一样,且sR503和sR147在野生株中的表达量低于突变株,这些小rna的稳定表达不依赖于Hfq蛋白。(2)采用基于λRed重组系统的基因突变技术,共成功构建了16株小rna缺失株分别是ΔsR4338、ΔsR4339、ΔsR4340、ΔsR3457、ΔsR3446、ΔsR6143、ΔsR378、ΔsR3383、ΔsR3440、ΔsR18、ΔsR6094、ΔsR3411、ΔsR6106、ΔsR6097、ΔsR3425和ΔsR3438。同时在缺失株的基础上成功构建了一株过表达株,即pBAD-sR3383。(3)利用表型和毒力实验,验证这些小rna对鼠疫菌的生理和毒力的调控关系。在生物膜形成方而,sR3446缺失后,鼠疫菌的菌落表而比野生株光滑,因此sR3446可能正调控鼠疫菌生物膜的形成。当sR3425、sR3383、sR3457和sR6143缺失后,鼠疫菌菌落表而变得更加粗糙,因此这几个小rna可能负调控鼠疫菌生物膜的形成。基于此我们又进行了结晶紫实验,对生物膜形成情况做定量分析,结果显示sR3446、sR3425、sR3383、sR3457和sR6143对鼠疫菌生物膜形成的调控与菌落表面褶皱实验结果基本一致。我们通过在正常条件、高盐条件和酸性条件下培养鼠疫菌野生株和小rna突变株分析不同菌株在胁迫条件下生长速率的变化,从而验证小rna对鼠疫菌生存能力的影响,结果显示只有ΔsR3425缺失株在这三种条件下的生长速率均低于野生株,因此sR3425能够增强鼠疫菌应对外界环境变化的能力。我们通过小鼠攻毒实验验证了小rna对鼠疫菌毒力的影响,利用软件GraphPad Prism 5对实验结果进行分析并计算鼠疫菌野生株和小rna突变株生存曲线差异的P值,当P值≤0.05时认为两者的差异有统计学意义,结果显示：ΔsR3440、ΔsR3383、ΔsR378、Δ sR6094、4 sR3411、Δ sR4339和ΔsR6097的P值分别为0.0258、0.0075、0.0004、0.0003、0.0267、0.0156和0.0143,因此我们认为这些小rna能够影响鼠疫菌的毒力。

关键词：鼠疫菌小rna 生物膜毒力

铝毒害对雪柑和酸柚根系小rna差异表达的影响

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铝毒害对雪柑和酸柚根系小RNA差异表达的影响

作者：周洋飞福建农林大学

学位级别：硕士

在酸性土壤上,铝(Al)毒是限制植物生长的主要因素,微摩尔水平的Al就可以迅速抑制植物根系的生长。柑橘主要种植于为热带、亚热带和温带地区的酸性土壤中,容易遭受Al毒危害。本研究以Al处理(1m M Al Cl3·6H2O)和对照(0m M Al Cl3·6H2O... 详细信息

在酸性土壤上,铝(Al)毒是限制植物生长的主要因素,微摩尔水平的Al就可以迅速抑制植物根系的生长。柑橘主要种植于为热带、亚热带和温带地区的酸性土壤中,容易遭受Al毒危害。本研究以Al处理(1m M Al Cl3·6H2O)和对照(0m M Al Cl3·6H2O)处理15周的雪柑和酸柚实生苗为试验材料,从生理生化和分子水平研究了两个不同柑橘品种耐铝性差异的可能机制,得出以下三点结论:***对雪柑和酸柚实生苗生长的影响与对照相比,Al处理雪柑和酸柚的植株变矮小,侧根数量减少,并且酸柚的症状更明显。Al处理显著降低了酸柚实生苗茎、叶、地上部和全株的干重,显著提高了酸柚的根冠比,而对雪柑实生苗没有明显的影响。***对雪柑和酸柚根茎叶生理生化的影响与对照相比,Al处理增加了雪柑和酸柚根、茎、叶的Al含量,并且酸柚茎、叶中Al含量的增加幅度均高于雪柑;显著降低了雪柑和酸柚根、茎、叶的磷(P)含量,并且雪柑根叶中P含量均高于酸柚;Al处理降低了酸柚根的S含量,但显著提高雪柑茎和叶的S含量;Al处理显著增加酸柚根中O2.-、H2O2和TBARS的含量,但对雪柑的影响不明显。***处理对雪柑和酸柚根系mi rnas的差异表达及与mi rna代谢相关基因表达的影响通过Illumina测序,本研究从Al处理雪柑和酸柚根系中分离了12个和16个差异表达的mi rnas,经过靶基因预测、基因GO分析和pathway通路等生物信息学分析后得出不同柑橘品种耐Al能力差异的可能原因归纳如下:(a)下调mi R160的表达,促进不定根和侧根的发育;(b)下调mi R477、mi R397和mi R398的表达,上调与逆境胁迫响应和信号转导相关靶基因的表达(SGT1、PLC和AAO);(c)降低mi R3627的表达,增加柠檬酸的分泌;(d)降低mi R482和mi R172的表达,增强植物碳水化合物代谢和硫代谢;(e)提高HEN1、SE1、AGO1、HASTY1、HYL1和HESO1的表达,更灵活的调控mi rna的代谢。总之,本研究探讨了不同柑橘耐铝性差异的生理生化和分子机制,研究结果为进一步分析柑橘耐铝机制提供了思路,为柑橘高产优质栽培提供科学依据。

关键词：柑橘耐Al 元素含量小rna 调控

立枯丝核菌AG-1的比较转录组和小rna研究

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立枯丝核菌AG-1的比较转录组和小RNA研究

作者：王嫣然四川农业大学

学位级别：硕士

立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG-1是一类重要的植物病原菌,寄主能够达到近50种,包括水稻、玉米、大麦、大豆、莴苣、番茄等多种重要粮油作物及蔬菜水果。由Rhizoctonia solani AG-1IA引起的水稻纹枯病是水稻的三大病害之一,在我国发... 详细信息

立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG-1是一类重要的植物病原菌,寄主能够达到近50种,包括水稻、玉米、大麦、大豆、莴苣、番茄等多种重要粮油作物及蔬菜水果。由Rhizoctonia solani AG-1IA引起的水稻纹枯病是水稻的三大病害之一,在我国发生面积非常广阔、流行性极强且频率高,造成的产量损失大。该病可从苗期到穗期都对水稻产生危害,并且以抽穗前后时期最严重,主要侵染水稻的叶片和叶鞘,也会侵入茎秆并蔓延到穗部,造成倒伏或整株枯死,或导致稻株不能够正常地抽穗,成为水稻稳产高产不可忽视的障碍,如何有效控制Rhizoctonia solani AG-1的发生与危害非常值得关注。本研究的目的在于从病原菌基因组比较转录水平和侵染过程的小rna表达调控水平寻求病害侵染和发生机制的可能性依据,为病原菌的有效防治提供可靠的理论依据。为此,一方面,我们从细胞学上观察并比较立枯丝核菌1类融合群AG-1IA、IB、IC的侵染寄主的过程和特点,通过Illumina GA II技术完成3个亚群的转录组测序、组装和注释,并对3个亚群转录组进行比较和分析,同时侧重对这3个亚群转录本的转录表达致病因子分泌小蛋白进行预测和比较分析,试图寻找转录特点与它们的致病特异性之间的相关性,比较分析并验证不同亚种中分泌致病小蛋白在致病机制中的差异和特点;另一方面,我们研究AG-1IA在侵染水稻过程中6个不同时期小rna的差异表达特点,预测并分析与致病基因表达调控相关的小rna和靶基因,从小rna负调控致病靶基因方面解析病原菌侵染寄主的过程和特点。本研究主要包括以下结论：1、通过致病性测定、侵染过程和侵染结构的显微观察,我们观察到接种病原菌不同融合亚群IA、IB和IC到不同寄主时,出现病斑的大小、特点不同;其中,比较分析侵染过程中产生的侵染结构：侵染垫和附着胞,以及菌丝的直接侵入和从气孔侵入的侵染特征差异。2、在转录组分析过程中,分别获得平均长度为75bp的6,367,931个reads (IATS),6,038,800个reads (IBTS)和5,104,515个reads(ICTS)的cDNA文库;测序后经过组装分别得到17,020,336bp、17,354,840bp和14,807,518bp的序列,以及21,542、20,487和18,503个转录本。其中,14,124,358bp的序列在IA基因组中预测到。3、运用3种预测方法对IA、IB和IC的转录组序列进行综合预测并获得20,732(96.24%)、19,827(96.78%)和17,938(96.95%)个ORFs。与多个数据库比对得到在IA、IB和IC分别有11129(53.68%)、10886(54.90%)和10161(56.65%)个转录本可比对到已知基因,并进行了基因的KOG分类,及致病性相关的功能蛋白的分析。4、在转录组数据验证过程中,我们选取了部分蛋白进行PCR验证,与测序结果基本一致,说明组装结果的可靠性。同时对转录表达预测到编码与致病性存在高度关联的富半胱氨酸的分泌小蛋白的基因进行克隆和诱导表达,并进行对寄主的HR生物活性检测。5、侵染寄主小RAN分析方面,我们得到IA营养生长时期的以及侵染各时期(10h、18h、24h、32h、48h、72h)的小rna预测数目。其中,侵染时期2(18h)的总小rna数最多,是其他侵染时期的8到9倍。统计各个时期小rna的大小分布,长度从18到28nt,峰值在23或24nt。将这些序列比对到基因组,发现除未注释的srna外最多的是rrna。与基因组比较,各个时期的小rna在基因组的分布趋势相似。6、通过软件预测获得264条新mirna,对这些新mirna进行靶基因预测,结果发现靶基因功能主要为binding、catalytic activity、cell、cell part、cellular process和metabolic process六类。7、对样品中表达的已知mirna进行统计,分析样品两两之间的表达差异,形成表达模式聚类分析图,推测这些发生了显著或极显著差异表达的已知mirna可能通过其上调或下调的差异性表达参与到侵染水稻的过程。8、完成对差异表达的mirna的靶基因预测和GO分析,发现病原菌在侵染的不同阶段mirna的调节差异。

关键词：立枯丝核菌AG-1 Illumina测序转录组小rna

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实时荧光定量PCR方法检测小rna

中国细胞生物学学报 2010年第3期32卷 359-360页

作者：贺小宏刘默芳兰州大学生命科学院兰州730000 中科院上海生命科学研究院生化细胞所rna研究技术平台上海200031

Real—time Quantitative PCR Detecting System，即实时定量核酸扩增检测系统，也称为实时定量基因扩增检测系统，简称定量PCR（qPCR）。荧光定量PCR-般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧... 详细信息

Real—time Quantitative PCR Detecting System，即实时定量核酸扩增检测系统，也称为实时定量基因扩增检测系统，简称定量PCR（qPCR）。荧光定量PCR-般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量PCR（以SYBRGreen I为例）方法对小rna进行定量分析。SYBRGreen I qPCR分析小rna的优点为：实验设计简单，一般需要一条特异性反转录引物，一条特异性正向PCR引物，反向PCR引物可通用于所有小rna分析，无需象TaqMan方法那样专门设计探针；实验成本相对较低；可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术，而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下：

关键词：荧光定量PCR PCR方法小rna 检测系统实时定量 PCR引物非特异性 TaqMan

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伤寒沙门菌小rna T64的相关功能研究

伤寒沙门菌小RNA T64的相关功能研究

作者：徐慧江苏大学

学位级别：硕士

目的:随着生物信息学预测和分子生物学技术的不断发展,在细菌基因组内发现了越来越多的小rna(small rna,srna),其作为基因表达的调控因子,在细菌的生命活动中发挥着关键作用。T64为本研究组在伤寒沙门菌中新发现的srna,其基因位置和表... 详细信息

目的:随着生物信息学预测和分子生物学技术的不断发展,在细菌基因组内发现了越来越多的小rna(small rna,srna),其作为基因表达的调控因子,在细菌的生命活动中发挥着关键作用。T64为本研究组在伤寒沙门菌中新发现的srna,其基因位置和表达特性都已经在前期研究中得到论证,本论文拟对该小rna在伤寒沙门菌中的相关功能进行探究。方法:1.T64高表达菌株的制备。根据前期研究获得的srna T64基因序列,在转录起始端和终止端处分别设计上下游引物,扩增获得编码T64的基因片段,经Nco I和Hind III双酶切,与同样双酶切的质粒pBAD/Myc-His A定向连接,并导入大肠杆菌DH5α。筛选出阳性克隆,从中提取重组质粒电击导入伤寒沙门菌野生株,作为srna T64高表达菌株。2.在hfq基因缺陷株中高表达T64。提取携带编码T64的基因片段的重组质粒,电转导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷株,在hfq基因缺陷株中诱导T64高表达。3.T64高表达菌株生长曲线测定。将T64高表达菌株和空质粒对照株分别在TSB中振荡培养,每隔1 h检测1次菌液的OD600值,连续测量10 h。以生长时间为横坐标,OD600值为纵坐标绘制生长曲线,比较T64高表达菌株和空质粒对照株的生长情况。4.T64高表达菌株的动力实验。将T64高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD600 0.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖继续培养0.5 h,以诱导T64表达,分别取T64高表达菌株和空质粒对照株的1μl菌液点种于含0.3%琼脂糖的LB或TSB半固体培养基,37°C培养12 h后测量动力圈直径,比较细菌的动力。5.实时荧光定量pcr检测基因转录水平。细菌经过培养后,以trizol法提取总rna,用特异性引物进行逆转录及实时荧光定量pcr,分析野生株在不同培养基中培养时t64的表达差异,以及t64高表达菌株中生物膜形成相关靶基因的转录水平变化。6.生物膜形成实验。将细菌培养至对数期(od6000.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖继续培养0.5h,以诱导t64表达,取菌液接种于96孔板,30°c静置4天,结晶紫染色后570nm比色定量。7.刚果红实验。过夜培养的t64高表达菌株和空质粒对照株菌液离心收菌,用pbs重悬菌体沉淀并调节菌量一致。滴种5μl重悬液到刚果红平板上,28°c静置3天,观察菌苔形态。结果:1.酶切、pcr验证和序列分析结果显示,成功构建阳性重组载体pbad-t64,并将其导入***野生株,成功制备srnat64高表达菌株(wt+pbad-t64)。***验证结果显示,伤寒沙门菌hfq基因缺陷株中成功导入了pbad-t64,即菌株Δhfq+pbad-t64制备成功。3.生长曲线结果表明,在一定时间内,t64高表达菌株生长速度明显快于空载体对照株。4.动力实验表明,在tsb半固体培养基中,t64高表达菌株的动力较空质粒对照株稍稍减弱;而在lb半固体培养基中,两者动力几乎无差别。5.荧光定量pcr结果显示,野生株在lb和tsb两种培养基中培养时t64的表达量有差异,在tsb中t64的表达量明显升高;在t64高表达菌株中,生物膜形成相关靶基因fimy、pilp、stcb和stgd转录均上调。6.生物膜形成实验结果显示,t64高表达菌株的生物膜形成能力强于空载体对照株;回补T64基因后,T64缺陷株生物膜形成能力基本恢复;hfq基因缺陷株即使高表达T64也难以形成生物膜。7.刚果红实验结果显示,T64高表达菌株和空质粒对照株都只能形成光滑和白色的菌苔,未展现出与生物膜形成对应的菌落形态。结论:伤寒沙门菌小rna T64的表达受到培养条件的影响,高表达T64后能促进细菌的生长,并且能在一定程度上抑制细菌的动力。T64有助于伤寒沙门菌形成生物膜并促进生物膜形成相关基因的表达,但不足以消除hfq基因缺失对生物膜形成的抑制作用。

关键词：伤寒沙门菌小rna T64 生长动力生物膜形成

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痢疾杆菌小rna功能的研究

痢疾杆菌小RNA功能的研究

作者：李娜中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

志贺菌属(shigella)细菌通称痢疾杆菌,是一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌,能够通过侵袭肠上皮细胞引起患者典型的菌痢症状(发热、腹痛、腹泻)。志贺菌分4群37种血清型,在我国主要的流行菌群为福氏(86%),福氏志贺菌... 详细信息

志贺菌属(shigella)细菌通称痢疾杆菌,是一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌,能够通过侵袭肠上皮细胞引起患者典型的菌痢症状(发热、腹痛、腹泻)。志贺菌分4群37种血清型,在我国主要的流行菌群为福氏(86%),福氏志贺菌最主要的血清型为2a(80%)。临床感染痢疾杆菌可以导致痢疾,其症状以发热、脱水和便血为特征。痢疾是世界上,尤其是发展中国家重要的传染病之一。据世界卫生组织公告报道,全球每年菌痢患者达1.647亿,有1.632亿分布于发展中国家,并导致150万人死亡。在我国,菌痢发病率也很高,其中福氏2a型占到50-70%。目前治疗痢疾的主要方式是抗生素,但高达95%的临床分离株对多种抗生素产生了耐药性;最佳治疗手段是疫苗,但对其致病机理和宿主的免疫保护机制还不很清楚。菌痢严重危害我国人们的健康,对痢疾杆菌进行研究具有重要的意义。因此,福氏2a志贺氏菌的基础研究对于我国卫生防疫工作尤为重要。在原核生物基因组中除了trna、rrna和mrna这三种我们很熟悉的rna以外,目前已经知道还含有许多编码非常规调控的rna。这些rnas的长度为50-400nt,通常由原核生物的基因间区编码但是并不翻译成蛋白质,因此被称为非编码小rna,简称小rna(srna)或非编码rna(ncrna)。近年来,随着生物信息学和分子生物学技术的不断发展,在原核生物体内陆续发现了上百种srna分子,这些srna分子具有多样的生物学功能。小rnas作为一类新发现的基因表达调控子已经引起了高度的重视。它们在细菌中发挥着多种调控功能,有助于细菌对生理系统进行精细调控以便适应迅速变化的环境。因而深入认识这些srnas可能开辟一个新的研究领域,它们可能代表着一个新层次上的基因表达调控方式。人们现在已认识到srnas参与许多有机体的基因调节,在细菌中行使诸如翻译激活、翻译抑制、持家srnas、密度感应系统、蛋白的降解、离子动态平衡、糖代谢和生长依赖性外膜蛋白表达调控等多种功能,有人把这些srnas称为“凌驾于”基因组之上的调控成分。虽然现在细菌中发现的srnas在迅速增加,但是它们中的大部分功能都还未知,从目前积累的知识分析,细菌可能借助于这些srnas对它们的生理系统进行精细调控以便适应迅速变化的环境。因而深入认识这些srnas可能开辟一个新的研究领域,因为它们可能代表着一个新层次上的基因表达调控方式。功能分析表明srnas是进行细菌调控研究中一直被忽略的一环。最新认识到的srnas的生理功能已经填补了我们对细菌离子动态平衡、糖代谢和生长依赖性外膜蛋白表达调控知识的空白。对痢疾杆菌全基因组srnas的功能进行研究,必将促进对该菌生理学、系统进化以及致病机理等方面的研究,为痢疾的药物开发提供新的作用靶标,为痢疾杆菌疫苗研制提供一个新的思路。首先,本研究根据目前发现的大肠杆菌的srnas的本身的特点,利用生物信息学,根据基因组之间的序列对比、rna的二级结构分析以及对非依赖性终止子分析等方法对福氏2a志贺氏菌301毒力大质粒(pCP301)上的srnas进行预测,采用Northern blot对预测出的srnas进行验证。本研究成功预测了301毒力大质粒上的6个srna;综合文献报道和网络信息初步预测sf301基因组5个功能未知的srna:IS061 srna、IS102 srna、C0719 srna、tke1 srna和ryfA srna(http://***)。研究证明srna在细菌的物质代谢、环境适应、群体感应和细菌毒力发挥了重要的调节作用。本研究采用改进的λ-Red重组系统成功构建了sf301的8个srnas的缺失突变体(简称sf301Δsrnas),分别是预测的3个质粒编码srnas和sf301基因组5个功能未知的srnas,并对突变株进行了生理生化特征研究。结果表明:这8个srna的缺失对菌体的物质代谢和生长影响不大。接下来本文对sf301Δsrnas对sf301毒力的影响进行了评价。本研究通过sf301Δsrnas与野生株的HeLa细胞竞争性侵袭力、小鼠肺部竞争性侵袭感染能力和豚鼠角膜侵染实验进行毒力评价研究,验证预测的srna和基因组上已报道但是功能未知的srna是否对细菌毒力的发挥起到了重要的调控作用。结果表明:基因组上的C0719 srna和IS061 srna的缺失造成了sf301的HeLa细胞侵袭力及小鼠肺部侵袭力的增强;毒力大质粒预测的ln3 srna的缺失使得sf301的HeLa细胞侵袭力及小鼠肺部侵袭力的减弱。对细菌不同状态下的蛋白质组进行比较是蛋白质学研究中很重要的一个方面,这包括同一株菌在不同培养条件下的蛋白质组的变化的研究、同一细菌的不同菌株的蛋白质组比较以及同一菌株的突

关键词：福氏志贺氏菌2a 301 小rna 表达调控

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十字花科黑腐病菌六个小rna的功能鉴定

十字花科黑腐病菌六个小RNA的功能鉴定

作者：陈承晓广西大学

学位级别：硕士

rna分为编码rna和非编码rna(英文全称non-codingrna,简称ncrnas)。细菌中的非编码rna 一般被称为小rna(简称srnas),近年来细菌研究领域兴起了对小rna的探索热潮,因为小rna已经被发现对细菌的各种代谢过程甚至包括致病过程有重要的作用... 详细信息

rna分为编码rna和非编码rna(英文全称non-codingrna,简称ncrnas)。细菌中的非编码rna 一般被称为小rna(简称srnas),近年来细菌研究领域兴起了对小rna的探索热潮,因为小rna已经被发现对细菌的各种代谢过程甚至包括致病过程有重要的作用。本课题组致力于研究十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称Xcc)。其小rna的鉴定工作目前已经进展到了一个重要阶段。经高通量测序(rna-seq)以及Northern杂交验证鉴定出来的小rna数量达到100个左右。本工作的内容是对其中六个小rna——srna-Xcc19、srna-Xcc20、srna-Xcc21、srna-Xcc22、srna-Xcc23、srna-Xcc24 的功能进行鉴定。为了研究这些小rna的功能,我们拟通过这样的技术路线:构建它们的过量表达菌株和缺失突变体并进行表型分析。目前,我们完成了这六个过量表达菌株以及一个缺失突变体的构建,根据它们过量表达或者缺失的小rna分别将其命名为OE19、OE20、OE21、OE22、OE23、OE24、DM19。然后以野生型Xcc8004以及Xcc8004p(导入空质粒的对照菌株)为对照,对其进行了碳源利用、金属离子耐受性、蛋白质变性剂、胞外酶及胞外多糖、致病性、过敏性、游动性等多方面的多种表型分析。结果显示,其中2个过量表达菌株和Xcc8004以及Xcc8004p相比在几个方面分别有较明显的表型变化——OE23的胞外蛋白酶的分泌显著下降了,同时其对Cu2+、Zn2+以及Cd2+和Ni2+以及蛋白质变性剂SDS耐受能力下降,在营养缺乏条件下的生长能力低于Xcc8004以及Xcc8004p;OE24在营养缺乏条件下生长速度明显低于Xcc8004以及Xcc8004p,值得关注其对寄主的致病力严重下降,几乎消失;其他五个菌株的各种表型与Xcc8004以及Xcc8004p相比都没有明显的差异。srna-Xcc23和srna-Xcc24是否参加了相关的代谢过程,是否和致病相关,其余的四个小rna是否不参与相关的代谢过程,是否不和致病相关,都需要进一步的实验论证,包括构建其余五个小rna的缺失突变体以及对应的互补菌株。

关键词：小rna 高通量测序过量表达菌株表型缺失突变体

玉米小rna种内变异的遗传机制全基因组分析

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玉米小RNA种内变异的遗传机制全基因组分析

作者： Abdul Saboor Khan 华中农业大学

学位级别：硕士

长度为18-30个核苷酸(nt)的小rna(s rnas)广泛存在于动物、植物以及真菌中,是一类重要的rna分子,在生物体的众多生物过程中发挥了至关重要的作用。早在上世纪80年代,人们就已经对s rna进行研究,发现s rnas是通过内切酶DICERLIKE(DCL)加... 详细信息

长度为18-30个核苷酸(nt)的小rna(s rnas)广泛存在于动物、植物以及真菌中,是一类重要的rna分子,在生物体的众多生物过程中发挥了至关重要的作用。早在上世纪80年代,人们就已经对s rna进行研究,发现s rnas是通过内切酶DICERLIKE(DCL)加工产生。1999年在植物中首次发现和基因转录后沉默相关的s rnas。随后大量研究表明,s rnas可以在转录、转录后或翻译水平上通过与靶基因序列互补配对的方式调控基因表达,从而参与植物的生长发育、代谢进程以及响应各种胁迫反应的信号通路调控,具有重要的生物学意义。s rnas在植物中存在广泛的变异,且在同一物种内不同材料之间的变异也广泛存在,并有报道s rnas在种内变异可能与物种内的表型变异紧密相关。然而我们对种内s rnas变异的类型与变异的内在分子机制还不清楚,这些限制了我们对植物表型变异的理解与分子育种的实践应用。为了系统鉴定s rnas的种内变异类型并解析其变异的分子机制,我们收集了两个玉米优良自交系B73和Mo17叶片组织的深度s rnas测序数据,并收集了一个具有广泛遗传变异的玉米关联群体(338份优良自交系)相关时期叶片的s rnas测序数据。该s rnas数据集包涵了15.530亿条有效s rnas序列。经过序列的质量筛选,我们获得了18～26nt的3.087亿条高质量的s rnas序列。在我们获取的B73和Mo17叶片组织深度s rnas数据集中,有1.546亿条s rnas序列被特异地定位到B73参考基因组中,1.541亿条s rnas序列特异地定位到Mo17玉米基因组,s rnas序列分别覆盖了B73和Mo17基因组的6.98%和7.06%。依s rnas在基因组中的分布来看,在B73中,38.47%的s rna分布在基因间区,其次30.37%是基因区域;而在Mo17的基因组中,s rnas有42.78%分布于基因间区,基因区域占比28.43%。s rnas在B73和Mo17基因组中不同区域的分布存在一定的差异。基于表达丰度(RPM)大于等于0.6并在至少60个不同的自交系中同时检测到的标准,我们共获得了339797条特异的s rnas,其中,B73基因组中检测到171813条s rnas,Mo17中检测到167984 s rnas,同时在两个基因组中都检测到的s rnas有156422条。进一步分析发现,B73和Mo17之间的s rnas表达发生了一定程度的变化。在B73和Mo17的基因组中,分别发现了15391和11562条种内特异表达的s rnas,同时,鉴定到3537条差异表达的s rnas。为了解析B73和Mo17之间的种内s rnas变异的分子机制,我们在具有广泛遗传变异的关联群体中对1999条B73和Mo17之间具有两倍及以上差异表达的s rnas进行了全基因组的表达关联分析,共鉴定到72671个与种内s rnas变异显著关联的基因组SNP位点。进一步的关联位点去冗余分析,获得了5744个影响s rna变异的反式e QTL。这些e QTL在玉米10条染色体中分布具有一定的偏好性,其中,第8号染色体鉴定到最多的e QTL(1633个),其次是第2(1077)、1(731)号染色体中,第10(183)号染色体中鉴定到的e QTL最少。为了挖掘控制玉米全基因组种内s rnas变异的关键调控因子,我们通过Mont Carl模拟分析发现,这5744个e QTL中的反式e QTL显著富集于26.37 Mb基因组区间内,其中调控大量s rna变异的25个反式e QTL热点集中在2.2Mb的基因组区间内。在这些反式e QTL热点中,chr1,chr2和chr8上分布了三个主要的e QTL热点。在chr8号染色体的e QTL热点区域,有13个基因与其调控的469条种内变异s rnas中的428条具有表达上的显著相关性。值得注意的是,469条被chr8号染色体的e QTL热点调控的s rnas大都为24nt的s rnas,存在显著的s rnas长度富集。这些24nt的s rnas主要与chr8号染色体的e QTL热点区域的三个基因具有表达相关性。这三个基因分别是Zm00001d008982,Zm00001d008983,Zm00001d008984,这3个基因可能主要参与了24nt s rnas的合成与调控途径。同理,在chr2号染色体的e QTL热点调控了180条s rnas的表达变异,其中,75条s rnas为22nt的s rnas。而这些22nt长度的s rnas主要与chr2号染色体的e QTL的热点区域的一个功能未知的基因具有显著的表达相关。通过类似的关联分析与表达丰度相关分析,我们共鉴定到十个可以调控s rnas表达变异的功能基因位

关键词：玉米小rna 全基因组关联研究表达变异数量性状基因位点 eQTL反式热点