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基于小rna深度测序技术检测鉴定山东省及周边地区番茄病毒种类

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基于小RNA深度测序技术检测鉴定山东省及周边地区番茄病毒种类

作者：闫亚莉山东农业大学

学位级别：硕士

番茄是一种在我国大面积种植的蔬菜作物,其产量和品质常常受到多种病虫害的影响。其中,番茄病毒病的种类和数量不断增加,病毒病的爆发流行会导致番茄减产,影响农民收益,是我国番茄产业发展面临的一个巨大挑战。为了进一步明确侵染番茄... 详细信息

番茄是一种在我国大面积种植的蔬菜作物,其产量和品质常常受到多种病虫害的影响。其中,番茄病毒病的种类和数量不断增加,病毒病的爆发流行会导致番茄减产,影响农民收益,是我国番茄产业发展面临的一个巨大挑战。为了进一步明确侵染番茄的病毒种类以及病毒的发生分布情况,本研究利用小rna深度测序技术和PCR技术,以山东产区为主,对采自山东省及周边地区的487份番茄样品进行了病毒的检测与鉴定,并对检出率最高的番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)的3个分离物的全基因组序列进行克隆测序及分析。将ToMV病毒的全基因组序列与GenBank中该病毒有代表性的不同分离物基因组序列进行比对,并分别对其全基因组核苷酸序列进行了相似性、系统进化和重组分析。对首次发现的侵染番茄的甜菜西方黄化病毒(Beet western yellows virus,BWYV)进行了鉴定。主要研究结果如下:1.利用小rna深度测序技术对山东省番茄主产区番茄样品进行深度测序,通过将样品中小rna序列分别与核酸序列数据库(Nucleotide Sequence Database,NT)中的序列进行对比,发现小rna序列与40种病毒核苷酸序列相似性大于80%。这40种病毒分别属于8个科的8个属,分别为双生病毒科(Geminiviridae)的菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)、花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)的木薯脉花叶病毒属(Cavemovirus)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)的黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、黄症病毒科(Luteoviridae)的马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)、Amalgaviridae科的Amalgavirirus属、长线形病毒科(Closteroviridae)的毛形病毒属(Crinivirus)、帚状病毒科(Virgaviridae)的烟草花叶病毒属(Tobamovirus)。2.对采集到的487份番茄样品进行40种病毒检测,共检测出8种病毒,分别是ToMV、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、辣椒脉黄化病毒(Pepper vein yellows virus,PeVYV)、BWYV、番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)、南方番茄病毒(Southern tomato virus,STV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV),其中BWYV侵染番茄为国际上首次报道。胜红蓟黄脉病毒(Ageratum yellow vein virus,AYVV)、红辣椒曲叶病毒(Chilli leaf curl virus,ChiLCuV)、野茼蒿黄脉病毒(Crassocephalum yellow vein virus,CYVV)等32种病毒未检测到。所采全部样品中,病毒的检出率为83.16%。病毒的检出率由高到低依次为:ToMV(49.69%)>TYLCV(49.08%)>ToCV(29.98%)>CMV(24.02%)>PeVYV(18.89%)>STV(7.60%)>PVY(6.57%)>BWYV(0.82%)。3.在检测的487份样品中,405份为阳性样品。此中,83份样品为单一病毒的侵染,其余样品为2种及以上病毒的复合侵染。病毒的复合侵染类型共有12种。病毒的复合侵染率为79.51%。此中以2种病毒的复合侵染率最高,为46.67%,3种病毒复合侵染率为22.47%,4种病毒复合侵染率为8.64%,5种病毒复合侵染率为1.73%。4.对检出率最高的病毒ToMV进行全基因组序列扩增,分别从江苏省连云港市赣榆县和上海浦东新区,河北省沧州市青县中采集的感染ToMV的番茄样品中各选取一个进行ToMV全基因组序列扩增,得到3条ToMV的全基因组序列,序列长均为6383 bp。5.对ToMV的全基因核苷酸序列进行相似性分析和系统进化树分析,结果表明:3个ToMV分离物中ToMV-HBQX与日本烟草分离物(AB355139)聚类在一个分支上,亲缘关系最近。ToMV-SHPD和ToMV-JSGY都与中国番茄分离物(MF002491)聚类在一个分支上,亲缘关系最近。整体上这三个分离物与亚洲亚组聚类在一个大的分支上。利用RDP4软件的7个程序包对ToMV进行重组分析,结果表明:ToMV-SHPD、ToMVJSGY和ToMV-HBQX与其他所选分离物之间没有发生基因重组。

关键词：番茄病毒病小rna深度测序技术番茄花叶病毒复合侵染全基因组序列分析

3型猪源呼肠孤病毒的小rna深度测序技术鉴定及其TaqMan qPCR检测方法建立和应用

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3型猪源呼肠孤病毒的小RNA深度测序技术鉴定及其TaqMan qPCR检测...

作者：武松山东北农业大学

学位级别：硕士

世界各地新发或再发传染病频繁发生,新型病毒出现的概率也随之增加,这对于传统的病毒检测手段提出了严峻挑战,需要改进相应的检测方法。由于传统病毒检测依赖于对病毒信息的了解,并且并非所有的病毒都可以进行分离培养,仅依赖传统病毒... 详细信息

世界各地新发或再发传染病频繁发生,新型病毒出现的概率也随之增加,这对于传统的病毒检测手段提出了严峻挑战,需要改进相应的检测方法。由于传统病毒检测依赖于对病毒信息的了解,并且并非所有的病毒都可以进行分离培养,仅依赖传统病毒检测方法鉴定未知病毒或新出现的病毒周期长、耗费较大量人力物力。小rna深度测序技术属于二代测序技术,在对病毒没有了解的情况下便可以完成对未知病毒或者新型病毒的鉴定,并且有利于进一步建立该病毒的特异性诊断方法。哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)在自然界分布广泛,人和动物感染MRV非常普遍,可引起呼吸道、肠道症状和心肌炎。动物源分离的MRV毒株与能够引起人类疾病的MRV毒株亲缘关系很近,对公共安全存在重大威胁。为了对MRV-3进行流行病学调查、病原诊断和防控提供技术支持,实现对MRV-3毒株检测监控。本研究通过小rna深度测序技术对未知病毒样本小rna测序共获得0.73G Reads,Q30在95.46以上;去除宿主的小rna后,经组装和去冗余后该样品分别得到758条病毒uniq contig序列;病毒contig序列比对核酸和蛋白库数据库,得到了234条病毒contig。最终检测出了19条病毒序列,11条为MRV(其中MRV-1、MRV-2、MRV-3和MRV-4分别为1、3、6和1条),其余8条分别为α乳头瘤病毒、鲤疱疹病毒、巨细胞病毒、慢病毒、绵羊疱疹病毒、蓝舌病毒、副流感病毒和猪瘟病毒。由于MRV的S1基因决定血清型,所以本研究选择MRV-3的S1基因985～1130 bp处设计引物和TaqMan探针,构建阳性质粒标准品,建立了针对MRV-3毒株的TaqMan RTqPCR检测方法。结果显示Ct值与阳性质粒标准品浓度在1.50×107～1.50×100 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.994;该方法最适引物浓度和TaqMan探针浓度分别为0.4μmol/L和0.2μmol/L;特异性实验结果表明此方法仅对MRV-3毒株进行扩增;本研究建立的TaqMan RT-qPCR敏感性优于常规PCR,其最低检测浓度达到1.50×10-1 copies/μL;重复性实验证明本方法重复性和稳定性好;通过临床样品的检测证明了本研究建立的检测方法效果较好,优于国标T/CALAS 50-2017所推荐的常规PCR和传统PCR方法,可以用于临床检测。综上所述,本文应用小rna深度测序技术快速对临床样品进行病毒的鉴定,在此基础上建立了MRV-3毒株的TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,为检测MRV-3病毒株提供了技术手段。

关键词：哺乳动物呼肠孤病毒小rna深度测序技术小rna TaqMan实时荧光定量PCR检测方法

北京地区番茄及两种花卉病毒病的病原鉴定及其序列分析

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北京地区番茄及两种花卉病毒病的病原鉴定及其序列分析

作者：董铮北京农学院

学位级别：硕士

北京地区番茄、丁香及大丽花植物上均出现了黄化、花叶、皱缩等病毒病症状,使自身价值受到了不同程度影响。本文通过小rna深度测序技术对北京地区侵染番茄、丁香和大丽花植物的病毒进行鉴定,明确病毒种类并构建部分病毒侵染性克隆,为相... 详细信息

北京地区番茄、丁香及大丽花植物上均出现了黄化、花叶、皱缩等病毒病症状,使自身价值受到了不同程度影响。本文通过小rna深度测序技术对北京地区侵染番茄、丁香和大丽花植物的病毒进行鉴定,明确病毒种类并构建部分病毒侵染性克隆,为相关植物病害防治提供基础,实验结果如下:1.使用小rna深度测序技术检测出番茄上带有番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)和一种新的卫星 rna病毒(satellite rna,Sat rna)。①设计特异性引物扩增ToCV全序列并分析其基因组结构及酶切位点,选择pCB301载体,用无缝克隆方法成功构建侵染性克隆pCB301-ToCV并转入农杆菌浸润本氏烟及番茄,本氏烟接种7天后在系统叶中检测出ToCV,番茄接种15天后只在接种叶中检测出ToCV,pCB301-ToCV可以侵染烟草,不能侵染番茄,且在本氏烟中没有症状产生。②设计特异性引物扩增Sat rna全序列并分析其基因组结构及酶切位点,选择pCB301载体,用双酶切方法成功构建侵染性克隆pCB-Sat rna并转入农杆菌侵染本氏烟和番茄,本氏烟接种7天后检测,番茄接种15天后检测,均没有检测到Sat rna。③由于Sat rna病毒不能自己复制和移动,完全依赖于辅助病毒进行复制和包被,因此与pCB301-ToCV一起侵染本氏烟及番茄研究pCB-Sat rna是否是ToCV的一种Sat rna病毒,通过实验得出该Sat rna与ToCV无关。2.丁香黄化曲叶病毒(Lilac vellow leaf curl virus,LYLCV)为本实验室发现的新病毒,已经获得了全序列,在此基础上分析LYLCV基因组结构和酶切位点,选择pCAMBIA1300载体,用双酶切方法分两部分成功构建了 pCAMBIA1300-LYLCV侵染性克隆并转入农杆菌浸润本氏烟,7天后在本氏烟接种叶和系统叶中检测到LYLCV,在本氏烟中没有明显症状产生。3.通过小rna深度测序技术检测出大丽花上带有黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、大丽花普通花叶病毒(Dahlia common mosaic virus,DCMV)和一种暂时命名为大丽花矮化相关病毒(dahlia stunt-associated virus,DSaV)的新病毒。①设计特异性引物扩增DCMV-BJ全序列,经过NCBI网站比对与ICTV网站各病毒科基因组描述,DCMV-BJ属于花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)花椰菜花叶病毒属(Caulimovirius),其基因组为双链DNA病毒,全长7949 bp。该病毒编码运动蛋白、蚜虫传播因子蛋白、DNA结合蛋白、衣壳蛋白、聚合酶多聚蛋白和包涵体蛋白。通过相似性比对与系统发育树的构建判断DCMV-BJ为DCMV-NZ的一个相似度极高的分离物。②设计特异性引物扩增DSaV全序列,经过NCBI网站比对与ICTV网站各病毒科基因组描述,D SaV属于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae)蚕豆病毒属(Fabavirus),其基因组为两条正义单链rna,rna1全长5560 bp,rna2全长3460 bp。rna1编码辅酶因子、解旋酶、病毒基因组连接蛋白、蛋白酶、rna依赖性的rna聚合酶;rna2编码运动蛋白、大外壳蛋白和小外壳蛋白。通过相似性比对与系统发育树的构建判断DSaV为蚕豆病毒属的一个新成员。

关键词：番茄花卉病毒小rna深度测序技术侵染性克隆

我国部分省市草莓种苗病毒种类检测与序列分析

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我国部分省市草莓种苗病毒种类检测与序列分析

作者：王佳北京农学院

学位级别：硕士

随着草莓保护地栽培面积的增加和无性繁殖种苗的繁殖与调运,草莓病毒病的发生与流行日益严重。为明确侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类,本文应用小rna深度测序技术对来自北京、河北、内蒙古、四川、辽宁、云南和陕西7个省市草莓种苗... 详细信息

随着草莓保护地栽培面积的增加和无性繁殖种苗的繁殖与调运,草莓病毒病的发生与流行日益严重。为明确侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类,本文应用小rna深度测序技术对来自北京、河北、内蒙古、四川、辽宁、云南和陕西7个省市草莓种苗病毒病进行检测,经RT-PCR验证发现仅在‘红颜’种苗中检出草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)、草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMo V)和草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)3种病毒,病毒复合侵染普遍发生。不同省市的‘红颜’种苗病毒检出率和病毒种类具有明显差异,且检出的SVBV和SMo V分离物的部分核苷酸序列同源性分别为97.98%～99.8%和98.12%～99.34%。SMYEV辽宁分离物lnhy26的cp基因核苷酸序列与中国甘肃分离物sy02的同源性高达99.02%。为进一步明确不同品种草莓种苗病毒病发生情况,对来自北京和河北的33个品种草莓种苗病毒病进行调查及RT-PCR检测,明确侵染不同草莓品种的主要病毒种类是SVBV、SMo V、SMYEV和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)4种病毒,且存在8种不同的病毒复合侵染类型。不同品种的草莓种苗病毒检出率和病毒种类具有明显差异。不同品种草莓种苗上检出的SVBV和SMo V分离物的部分核苷酸序列同源性分别为98.51%～100%和91.11%～100%。SMYEV北京爱莎分离物bjash6的cp基因核苷酸序列与中国甘肃分离物sy02同源性为98.31%。2个CMV不同品种分离物的部分cp基因核苷酸序列同源性为100%,隶属亚组ⅠA。为明确SMYEV辽宁分离物lnhy26的分子变异情况,扩增获得SMYEV辽宁分离物lnhy26约5 890 nt的核苷酸序列,其ORF1～ORF5基因核苷酸序列与Gen Bank上已登录的分离物的同源性为84.29%～99.02%,氨基酸序列同源性为86.87%～99.17%,基因重组分析均未发现重组事件。利用实时荧光定量PCR检测发现同一植株不同叶片中的SVBV和SMo V的含量差异显著,距离生长点较远的叶片SVBV含量较多,而SMo V与之相反。

关键词：小rna深度测序技术草莓轻型黄边病毒实时荧光定量PCR 病毒检测

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浙江省和江西省蔬菜病毒鉴定与变异研究

浙江省和江西省蔬菜病毒鉴定与变异研究

作者：刘雪建浙江大学

学位级别：硕士

蔬菜病毒病已成为制约蔬菜产业发展的一个重要因素,然而目前对蔬菜病毒病的种类、发生分布、变异进化等缺乏系统的了解。鉴于蔬菜病毒病的严重危害,本论文对浙江省和江西省蔬菜病毒病的种类、发生分布及变异进化规律开展了系统研究,以... 详细信息

蔬菜病毒病已成为制约蔬菜产业发展的一个重要因素,然而目前对蔬菜病毒病的种类、发生分布、变异进化等缺乏系统的了解。鉴于蔬菜病毒病的严重危害,本论文对浙江省和江西省蔬菜病毒病的种类、发生分布及变异进化规律开展了系统研究,以期为蔬菜病毒病的防治提供依据。 2013-2014年,在浙江省和江西省分别采集蔬菜样品1816份和995份,涵盖茄科、葫芦科、豆科、十字花科等蔬菜。首先,利用黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus, ToMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)、蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus, BBWV)的单克隆抗体,运用班点杂交ELISA (Dot-ELISA)方法对所有蔬菜样品进行普查,初步明确这些常见病毒病在浙江省和江西省的发生分布和危害情况。小rna深度测序技术是最近兴起的一种挖掘病毒的新方法,具有灵敏度高、不依赖于病毒序列等优点。我们对葫芦科、豆科、茄科等蔬菜进行8个混合样本的小rna深度测序。测序结果表明,蔬菜上的病毒病种类非常丰富,包括西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)、甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G, SPVG)、甘薯C病毒(Sweet potato virus C, SPVC)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus, SPLV)、南方番茄病毒(Southern tomato virus, STV)、辣椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus, PVMV)、红辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus, Chi VMV).辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)、辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus, PepMoV)、辣椒隐症病毒(Pepper cryptic virus, PCV)、紫荆黄环斑病毒(Redbud yellow ringspot virus, RYRV)、菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus, BCMV)甘薯杆状DNA病毒B (Sweetpotato badnavirus B, SPBV-B)、甘薯杆状DNA病毒A (Sweetpotato badnavirus A, SPBV-A)等等。利用PCR/RT-PCR对小rna深度测序发现的病毒进行扩增和序列测定,明确了浙江省和江西省蔬菜病毒病的种类和发生分布。浙江省的蔬菜病毒病种类主要为CMV、TMV、ToMV、TLCV、CGMMV、WMV、ZYMV、TuMV、BBWV、 PepMoV、PVMV、STV、PMMoV和BCMV;江西省蔬菜病毒病种类与浙江省的类似,此外还包括PCV,不过没有检测到TYLCV的发生。其中,感染茄科的主要病毒是CMV、ToMV、TMV、TYLCV、BBWV、PepMoV、PVMV、ChiVMV、 STV和PMMoV,还检测到PCV、TMV、马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)。葫芦科蔬菜上的主要病毒病是CMV、 ***和CGMMV,此外还检测到番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRSV)、甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus, MYSV)和瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)。豆科蔬菜上的主要病毒病是CMV、 BBWV和BCMV,还检测到黑眼豇豆花叶病毒(Blackeye cowpea mosaic virus, B1CMV)、苎麻花叶病毒(Ramie mosaic virus, RaMoV)、花生条纹病毒(Peanut stripe virus, PStV)、大豆褪绿斑驳病毒(Soybean chlorotic mottle viru

关键词：蔬菜病毒病小rna深度测序技术系统关系树 PepMoV分离物