检索结果-南通市图书馆

作者：何清暨南大学

学位级别：硕士

目的：建立小鼠胚胎干细胞实验(EST)模型,验证该模型检测胚胎毒性的有效性,探讨aFGF的胚胎发育毒性及其对小鼠胚胎干细胞分化的影响。方法：体外培养小鼠胚胎干细胞,通过形态学观察、核型分析和碱性磷酸酶(AKP)染色等方法用于ES的鉴定,... 详细信息

目的：建立小鼠胚胎干细胞实验(EST)模型,验证该模型检测胚胎毒性的有效性,探讨aFGF的胚胎发育毒性及其对小鼠胚胎干细胞分化的影响。方法：体外培养小鼠胚胎干细胞,通过形态学观察、核型分析和碱性磷酸酶(AKP)染色等方法用于ES的鉴定,并按照欧洲替代试验方法验证中心(ECVAM)推荐的发育毒性评价方法,验证所建立的EST模型评价药物发育毒性的有效性;MTT法检测aFGF对ES细胞和BALB/c 3T3细胞增值的影响,RT-PCR半定量分析法检测aFGF对未分化基因Sox-2表达的影响,评价aFGF的胚胎毒性：并进一步采用RT-PCR方法测定不同剂量aFGF对ES细胞分化为外、中、内三个胚层过程中不同组织特异性分子标记物基因表达的影响,探讨aFGF较大剂量使用时,是否具有直接或潜在的胚胎发育毒性及致畸性,并用细胞免疫荧光检测分化的三个胚层特异性蛋白的表达量,以验证细胞分化的完整性。结果：(1)成功建立EST模型,5-Fu、DPH和Penicillin G细胞毒性检测结果表明,其胚胎毒性依次为强、弱和无,与临床药物毒性相一致。(2)aFGF(14-154)在0.01-100μg/mL范围内对3T3细胞和ES细胞呈不同程度的促增殖作用：当其大于100μg/ml时对ES细胞和3T3细胞均有不同程度的抑制作用：而在0.01-100μg/mL范围内对ES细胞的分化已经产生抑制作用。计算aFGF(14-154)对两种细胞增值及其对ES细胞分化的影响,结果显示分别为：IC50 3T3=263.786μg/mL, IC50 ES=393.12μg/mL,ID50 ES=6.42μg/mL,毒性评价结果为aFGF(14-154)具有弱胚胎毒性。(3)aFGF(14-154)在较低剂量下对外胚层标记物GFAP、Oligo2和Nestin基因表达有促进作用,并且都在1μg/mL aFGF时达到最高值,超过该剂量则促进作用下降;对中胚层各典型标记物BMP4、MHC和MyoD基因表达作用趋势不一致;而对内胚层标记物GATA6、TTR和ALB基因表达呈明显抑制作用。结论：依据本实验评价模型,aFGF的胚胎毒性判定为弱胚胎毒性,aFGF(14-154)对三个胚层特异性基因的表达的影响呈浓度依赖性,aFGF在同一剂量下对三个胚层的发育作用显示不一致甚至相反,其作用的不平衡性可能与其弱胚胎毒性相关;其中对内胚层标记物GATA6、TTR和ALB基因表达的抑制作用在判断aFGF的胚胎毒性中可能具有重要科学意义。

关键词：重组人酸性成纤维生长因子小鼠胚胎干细胞实验胚胎发育毒性毒性评价

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两种胚胎干细胞实验模型评价邻苯二甲酸（2-乙基己基）酯胚胎发育毒性的比较研究

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中华预防医学杂志 2016年第7期50卷 645-651页

作者：罗莎方海琴杨辉张立实贾旭东四川大学华西公共卫生学院成都610041 卫生部食品安全风险评估重点实验室国家食品安全风险评估中心

目的：建立并应用小鼠胚胎干细胞实验（mEST）模型与人胚胎干细胞实验（hEST）模型评价邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的胚胎发育毒性。方法参照欧洲替代方法研究中心（ECVAM）的标准操作方法，建立mEST、hEST模型，并选用ECVAM... 详细信息

目的：建立并应用小鼠胚胎干细胞实验（mEST）模型与人胚胎干细胞实验（hEST）模型评价邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的胚胎发育毒性。方法参照欧洲替代方法研究中心（ECVAM）的标准操作方法，建立mEST、hEST模型，并选用ECVAM推荐的已知强胚胎发育毒性物质5-氟尿嘧啶（5-FU）和无胚胎毒性物质青霉素G（PN-G）进行模型验证，在模型验证有效的基础上，以15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0μg/ml 浓度的DEHP分别染毒小鼠胚胎干细胞D3（mESC-D3）、Balb/c小鼠成纤维细胞3T3（3T3）及人胚胎干细胞H9（hESC-H9）7 d，采用CCK-8法检测不同浓度DEHP染毒后mESC-D3、3T3及hESC-H9细胞存活百分数和半数增殖抑制浓度（IC50）。根据细胞毒性实验结果，使用15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0μg/ml 浓度的DEHP分别处理分化的mESC-D3、hESC-H9细胞10 d，采用Real-time PCR检测不同浓度DEHP作用下，分化标志基因心肌细胞肌球蛋白重链（α-MHC）的表达情况，拟合效应曲线，得出半数分化抑制浓度（ID50）。并将ID50、IC50代入线性判别函数公式进行计算与比较。结果细胞生长状态良好，免疫荧光染色可见未分化hESC-H9细胞高表达、干性关键转录因子八聚体结合转录因子（OCT4）、阶段特异性胚胎抗原（SSEA-4）及肿瘤排斥抗原（Tra-1-60），细胞处于未分化状态。拟胚体大小均一、形态一致，可重复性高。采用ECVAM推荐已知发育毒性物质（5-FU和PN-G）对模型进行验证，所建模型有效，可用于受试物胚胎发育毒性的评价。DEHP对mESC-D3的IC50为210.0μg/ml、ID50为246.8μg/ml及对3T3的IC50为197.3μg/ml，代入线性判别函数公式得出函数Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ值分别为7.78、7.58、-7.79，因Ⅰ〉Ⅱ〉Ⅲ，mEST模型评价DEHP为无胚胎发育毒性。DEHP对hESC-H9的IC50为184.8μg/ml，ID50为84.3μg/ml及对3T3的IC50为195.4μg/ml，代入线性判别函数公式得出函数Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ值分别为3.21、5.77、-6.46，因Ⅱ〉Ⅰ〉Ⅲ， hEST模型评价DEHP为弱胚胎发育毒性。结论 hEST模型相对于mEST模型在评价受试物的弱胚胎发育毒性方面可能更为敏感。

关键词：二乙基己基邻苯二甲酸胚胎干细胞小鼠胚胎干细胞实验人胚胎干细胞实验胚胎发育毒性评价

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