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Cx43、β-catenin、Smo在第二生心区的表达规律及意义

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中国组织工程研究 2024年第19期28卷 3042-3048页

作者：丁泽原闫玉楠谢建山师亮景雅杨艳萍山西医科大学组织胚胎学教研室山西省太原市030001

背景:第二生心区对于胚胎心脏发育具有重要意义,其发育异常会导致多种心脏畸形,Cx43基因敲除后第二生心区细胞的形成和增殖减少,但具体原因尚未明确。目的:①明确β-catenin、Smo以及Cx43在内胚层与第二生心区的表达模式,观察其有无共表... 详细信息

背景:第二生心区对于胚胎心脏发育具有重要意义,其发育异常会导致多种心脏畸形,Cx43基因敲除后第二生心区细胞的形成和增殖减少,但具体原因尚未明确。目的:①明确β-catenin、Smo以及Cx43在内胚层与第二生心区的表达模式,观察其有无共表达;②探究Cx43与Wnt/β-catenin通路或Shh通路之间是否存在相互作用,共同参与第二生心区的发育。方法:选取胚龄10-12 d的ICR小鼠胚胎石蜡包埋连续切片,进行免疫组织化学染色、苏木精-伊红染色、免疫荧光染色;剥离胚龄11 d小鼠胚胎的原始消化管用于蛋白印迹实验和免疫共沉淀。结果与结论:①胚龄10-12 d,Cx43与Isl1在前肠腹侧和心包腔背侧壁的部分间充质细胞呈共表达,Isl1阳性细胞增多的同时Cx43阳性细胞也增多;②胚龄10-12 d,Cx43与β-catenin在内胚层腹侧共表达;③胚龄10-12 d,Cx43与Smo在内胚层上共表达;④免疫共沉淀结果表明Cx43与β-catenin之间存在相互作用,共同参与第二生心区的发育。

关键词：小鼠胚胎第二生心区流出道 Wnt/β-catenin通路 Shh通路 Cx43 免疫共沉淀

Notch2信号参与调控小鼠胚胎心脏主动脉与肺动脉瓣膜的发育

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中国组织工程研究 2023年第14期27卷 2176-2181页

作者：王佳佳谢建山李海荣景宜馨杨艳萍山西医科大学组织胚胎学教研室山西省太原市030001

背景:先天性心脏畸形常表现为动脉瓣膜发育异常,其中以主动脉瓣二叶式畸形最常见,但目前对于胚胎主、肺动脉瓣膜的具体发育过程有待阐明。目的:探讨小鼠胚胎心脏流出道的分隔与主、肺动脉瓣膜原基形成及其重塑过程。方法:2月龄SPF级健康... 详细信息

背景:先天性心脏畸形常表现为动脉瓣膜发育异常,其中以主动脉瓣二叶式畸形最常见,但目前对于胚胎主、肺动脉瓣膜的具体发育过程有待阐明。目的:探讨小鼠胚胎心脏流出道的分隔与主、肺动脉瓣膜原基形成及其重塑过程。方法:2月龄SPF级健康ICR小鼠雌鼠16只、雄鼠10只,于每日晚18:00以雌雄2∶1的比例进行合笼,次日6:00发现阴栓者记为妊娠0.5 d。选取胚龄9.5-15 d的小鼠胚胎石蜡包埋连续切片,免疫组织化学染色观察胚龄9.5-15 d的小鼠胚胎心脏Isl1、Nkx2.5、肌球蛋白重链、Ap2α、Sox9、α-平滑肌肌动蛋白、Snail、Jag1、Notch2、Alk3和p-Smad1/5/8的蛋白表达;心脏的三维重建观察流出道心内膜垫和插入垫的变化以及瓣膜的形态。结果与结论:(1)胚龄9.5-10.5 d小鼠胚胎,流出道内皮细胞经过上皮-间充质转化形成心胶质内的间充质细胞,参与形成流出道心内膜垫;胚龄11-11.5 d,咽前Isl1阳性细胞延伸入流出道壁形成插入垫,此过程未发生上皮-间充质转化;Notch2信号参与流出道心内膜垫形成过程但未参与插入垫的形成;(2)胚龄12.5 d,流出道心内膜垫远端融合形成主动脉的左、右冠瓣和肺动脉的左、右半月瓣原基,插入垫形成主动脉的无冠瓣和肺动脉的前半月瓣原基,Notch2信号表达于所有瓣膜原基;胚龄13-15 d,动脉瓣膜原基完成重塑形成细长的瓣膜,Notch2信号在瓣膜的表达逐渐变弱;(3)研究结果提示,流出道插入垫内的间充质细胞来自第二生心区Isl1阳性细胞;Notch2信号可能未参与插入垫的形成,但可能参与流出道心内膜垫的形成以及主、肺动脉瓣膜原基的重塑。

关键词：小鼠胚胎动脉瓣膜流出道心内膜垫上皮-间充质转化 Notch2 第二生心区心脏

Cas9在小鼠早期胚胎的靶向切割和脱靶效应的研究

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Cas9在小鼠早期胚胎的靶向切割和脱靶效应的研究

作者：杨丽芸昆明理工大学

学位级别：硕士

CRISPR/Cas系统在细菌、古生菌和噬菌体中被发现,以序列特异性方式靶向破坏DNA和RNA,以提供了对入侵质粒和病毒的免疫力。其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统是广泛应用于各个领域中的基因编辑工具,它是由Cas9蛋白、cr RNA(CRISPR RNA)和tracr RNA... 详细信息

CRISPR/Cas系统在细菌、古生菌和噬菌体中被发现,以序列特异性方式靶向破坏DNA和RNA,以提供了对入侵质粒和病毒的免疫力。其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统是广泛应用于各个领域中的基因编辑工具,它是由Cas9蛋白、cr RNA(CRISPR RNA)和tracr RNA(trans-activating cr RNA)组成,在原间隔序相邻基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列存在的情况下,单链向导RNA(small guide RNA,sg RNA)引导Cas9蛋白切割DNA双链形成平末端切口。CRISPR/Cas9系统在特定位点诱导产生DNA双链断裂(double-strand breakage,DSB)是基因编辑中的第一步,DSB激活细胞内修复机制才能实现基因编辑的目的。CRISPR/Cas9系统操作简单,打靶效率高,但也存在脱靶效应。脱靶可能会导致基因组不稳定,基因异常表达、细胞死亡或发生肿瘤,并破坏其他正常基因的功能。为了控制CRISPR/Cas9系统的脱靶,会采取一些措施来降低脱靶,如:对影响脱靶效应的相关因素进行优化、改进和检测等。目前,关于脱靶检测的技术层出不穷,单一的脱靶检测手段只能发现小部分的脱靶或者假阳性,结果存在一定的局限性。多个脱靶检测试验结果结合在一起才可能对CRISPR/Cas9系统在动物疾病模型构建中的脱靶效应有更广泛和更深入的理解。我们利用现有的脱靶检测技术,对在小鼠早期胚胎应用Cas9技术产生的脱靶开展一系列的检测研究,主要的研究内容和结果分为以下2部分:第1部分:sg RNA预测脱靶率高低对小鼠胚胎体内外发育的影响。我们利用在线预测脱靶软件在小鼠酪氨酸酶(Tyr)基因上设计了两个潜在脱靶数为18和691的两个sg RNA,通过体外转录的方式,拿到了质量合格的sp Cas9 m RNA、Tyr-low sg RNA和Tyr-high sg RNA,而且它们在小鼠早期胚胎中均有较高的编辑效率,可以很好的应用于随后开展的小鼠早期胚胎Cas9切割产生脱靶的检测研究。随后,我们将Tyr-low sg RNA和Tyr-high sg RNA分别同sp Cas9 m RNA注射至小鼠受精卵中,验证sg RNA预测脱靶率高低对小鼠胚胎卵裂率、囊胚率和足月小鼠出生率的影响。结果显示,Tyr-high sg RNA对小鼠胚胎的卵裂率没有明显的影响,但显著降低了囊胚率和足月小鼠出生率。而Tyr-low sg RNA对小鼠胚胎卵裂率、囊胚率和足月小鼠出生率均无影响。接着对两组新生的小鼠或13.5d解剖的小鼠胚胎进行基因型和表型的鉴定,发现其基因型和表型一致,且两组新生小鼠或13.5d解剖的小鼠胚胎突变率较高。最后根据预测脱靶软件对突变小鼠进行潜在脱靶位点检测,在Tyr-low组的3个预测潜在脱靶位点未发现切割痕迹;在Tyr-high组中,有1个预测脱靶位点同Tyr-high sg RNA无错配碱基,此预测脱靶位点同Tyr-high sg RNA一样存在编辑情况,其余2个预测脱靶位点无编辑情况。而且sp Cas9核酸酶在与sg RNA存在4个碱基错配的其他5个非靶向位点无切割现象,sp Cas9核酸酶特异性高。第2部分:利用DSB识别技术检测Cas9蛋白切割造成的脱靶。我们利用了DSB检测手段,发现直接跟踪Cas9核酸酶诱导产生的DSB可以用来检测Cas9脱靶。通过免疫荧光法检测DSB的响应蛋白γH2AX可以直接观察比较脱靶位点的数量,而且通过适用于少量细胞数目的Cut&Tag技术可以进行脱靶位点的检测。首先通过γH2AX免疫荧光法去动态检测γH2AX焦点,根据γH2AX焦点的形成和消失动力学特点,追踪DSB的变化。结果表明在小鼠胚胎中DSB的数目在注射后6h开始增加,而注射后9h注射组的DSB的数目明显高于未注射组,注射后15h的DSB数目达到相对最高点,然后开始下降,直到注射后27h注射组的DSB数目与未注射组无明显差异。接着在DSB数目的相对最高点注射后15h时,比较了未注射组、Tyr-low组和Tyr-high组的γH2AX焦点的数目,结果显示Tyr-low组和Tyr-high组Cas9核酸酶切割产生的DSB数目多于未注射组,而Tyr-low组和Tyr-high组的γH2AX焦点数目无明显差异。为了检测Cas9产生的DSB在基因组上的特性,用Cut&Tag技术对500个注射后15h的早期胚胎细胞进行分析,结果显示在Tyr-low组的18个脱靶位点未发现存在切割情况,但存在很高的非sg RNA依赖的随机切割,经过GO富集分析发现这些非sg RNA依赖的随机切割主要与神经发育和细胞死亡等相关。若这些DSB切割在修复时产生错误,则可能会造成早期胚胎发育停滞甚至致死。总的来说,本研究验证了在线脱靶软件预测脱靶率高的sg RNA存在脱靶,且会降低小鼠胚胎的囊胚率和足月小鼠

关键词：小鼠胚胎脱靶检测 γH2AX Cut&Tag 胚胎发育

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小鼠胚胎Sry基因的RNA干涉研究

生物化学与生物物理进展 2006年第9期33卷 890-894页

作者：赵金红杜卫华道尔吉裴杰张丽林秀坤内蒙古农业大学动物医学与动物科学学院呼和浩特010018 中国农业科学院畜牧研究所北京100094 西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100

为了研究Sry基因的调控网络,采用siRNA技术使Sry基因沉默,探讨了有效沉默Sry基因的途径和最佳条件.设计、合成针对小鼠Sry基因的发夹状寡核苷酸链,退火后连入真核表达载体pSilencer4.1-CMVneovector,构建以小鼠Sry基因为靶点的siRNA干... 详细信息

为了研究Sry基因的调控网络,采用siRNA技术使Sry基因沉默,探讨了有效沉默Sry基因的途径和最佳条件.设计、合成针对小鼠Sry基因的发夹状寡核苷酸链,退火后连入真核表达载体pSilencer4.1-CMVneovector,构建以小鼠Sry基因为靶点的siRNA干涉载体pSilencer4.1/Sry217及pSilencer4.1/Sry565,通过尾静脉注射法将载体质粒导入妊娠小鼠体内,于小鼠妊娠第11.5天,即11.5dpc(dayspostcoitum,性交后天数)取出胚胎,采用双重PCR法对胚胎进行性别鉴定,鉴定为雄性的胚胎采用半定量RT-PCR法检测Sry基因的表达量,研究不同干扰序列、不同注射时间及注射剂量对Sry基因表达量的影响.研究结果,确定了质粒的最佳注射时间为9.5dpc,注射剂量为20μg,注射干扰质粒pSilencer4.1/Sry565对Sry基因的抑制效率达85%左右.结果表明,siRNA可以显著抑制雄性胚胎Sry基因的表达.

关键词： siRNA Sry 小鼠胚胎基因沉默

N-钙黏连蛋白和层黏连蛋白在小鼠胚胎心流出道的时空表达及作用

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N-钙黏连蛋白和层黏连蛋白在小鼠胚胎心流出道的时空表达及作用

作者：徐春雨山西医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨N-钙黏连蛋白(N-cadherin,N-CAD)和层黏连蛋白(Laminin,LN)在小鼠胚胎心流出道(Outflow tract,OFT)发育早期的时空表达及其在心OFT发育中的可能作用。方法:对E8～13小鼠心石蜡连续切片行免疫组织化学SABC法染色并对E9～12的心... 详细信息

目的:探讨N-钙黏连蛋白(N-cadherin,N-CAD)和层黏连蛋白(Laminin,LN)在小鼠胚胎心流出道(Outflow tract,OFT)发育早期的时空表达及其在心OFT发育中的可能作用。方法:对E8～13小鼠心石蜡连续切片行免疫组织化学SABC法染色并对E9～12的心连续切片进行三维重建。选部分心切片行免疫荧光染色。结果:E8,左右心管尚未愈合。N-CAD表达较α-SMA和α-SCA表达强且范围广。NCAD于心管心肌细胞间呈线状强阳性表达,α-SMA和α-SCA表达位于肌膜下。E9,OFT与原始心室直接相连。E10～11,近OFT的ISL-1阳性鳃弓间充质细胞、背侧心包上皮和动脉囊壁细胞进入OFT远端,逐渐表达α-SMA和α-SCA,OFT逐渐增长;添加至心包腔背侧壁的ISL-1阳性细胞逐渐表达LN,LN至OFT远段达高峰,随着向近心端延伸又逐渐减弱,与ISL-1表达型一致。E12,OFT变短,OFT远段心肌ISL-1和LN表达消失。E10～13,右心室出现并逐渐扩大,近段OFT从近端向远端逐渐小梁化改建为右心室。E10～12,OFT近段嵴内间充质细胞逐渐增多,靠近心肌的细胞逐渐表达α-SMA和α-SCA,荧光双染示心内膜细胞来源的间充质细胞标记SOX9与心肌细胞标记α-SCA共定位于OFT嵴内近间充质细胞处的小梁心肌细胞。E10～13,从近端至远端,OFT近段心肌细胞LN表达逐渐减弱,LN表达于E11达高峰。N-CAD表达于E11达高峰,E12～13逐渐下降。结论:1.心肌分化过程中,N-钙黏连蛋白表达早于α-SMA、α-SCA,层黏连蛋白表达晚于α-SMA、α-SCA。2.层黏连蛋白与添加在流出道远段的第二生心区来源细胞的迁移、增殖和分化有关。3.流出道近段右心室化使流出道变短。心室化过程中小梁心肌细胞来源包括流出道心肌、EMT来源的间充质细胞。4.N-钙黏连蛋白与层黏连蛋白参与了流出道近段的小梁化过程。

关键词：小鼠胚胎流出道 N-钙黏连蛋白层黏连蛋白免疫组织化学

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小鼠胚胎早期血细胞发生的研究进展

解剖学报 2019年第5期50卷 698-702页

作者：刘东华何曦裴一岩梁雨森李凌衡刘慧雯哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室哈尔滨150081 Stowers医学研究院美国密苏里州堪萨斯64110 哈尔滨医科大学基础医学院哈尔滨150081

根据时空上的不同,小鼠胚胎发育时期的血细胞发生目前被分为原始造血、红系/髓系祖细胞(EMPs)的产生和造血干细胞(HSCs)成熟并分化为各种血细胞3个阶段。最新的观点也把原始造血和EMPs的产生归结为非HSCs依赖性的血细胞谱系分化阶段,将... 详细信息

根据时空上的不同,小鼠胚胎发育时期的血细胞发生目前被分为原始造血、红系/髓系祖细胞(EMPs)的产生和造血干细胞(HSCs)成熟并分化为各种血细胞3个阶段。最新的观点也把原始造血和EMPs的产生归结为非HSCs依赖性的血细胞谱系分化阶段,将第3阶段称为HSCs依赖性的血细胞谱系分化阶段。尽管胚胎时期的血细胞发生涉及多个造血器官,但本文中我们主要对近年在细胞和分子水平进行的造血细胞和HSCs在卵黄囊和腹主动脉-性腺-中肾(AGM)区发育的研究进行归纳总结,以此展示新近发现的胚胎发育早期血细胞发生的特点及其潜在机制。

关键词：血细胞发生造血干细胞卵黄囊腹主动脉-性腺-中肾区小鼠胚胎

HSP70在不同应激程度CUMS昆明小鼠胚胎中的表达及作用

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四川大学学报（医学版） 2017年第4期48卷 515-519页

作者：李小红罗珊樊伟曾珣白瑜秦朗李尚为四川大学华西第二医院生殖医学中心出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室成都610041

目的建立雌性昆明小鼠慢性轻度不可预见性应激(CUMS)动物模型,探讨在心理应激状态下,热休克蛋白70(HSP70)是否参与机体对胚胎的应激保护作用。方法将300只雌性昆明小鼠以9种应激因子在28d内随机应用造模,并分为轻度、中度和重度应激3组... 详细信息

目的建立雌性昆明小鼠慢性轻度不可预见性应激(CUMS)动物模型,探讨在心理应激状态下,热休克蛋白70(HSP70)是否参与机体对胚胎的应激保护作用。方法将300只雌性昆明小鼠以9种应激因子在28d内随机应用造模,并分为轻度、中度和重度应激3组。对照组(50只)不造模。通过孕马血清促性腺激素/人绒毛膜促性腺激素促排卵,观察卵巢反应及胚胎发育潜能;采用免疫荧光染色及实时荧光定量PCR检测HSP70在2-细胞胚胎及孕4d(D4)胚胎中的表达。结果 28dCUMS刺激后,实验组小鼠轻度应激占50%(150只),中度应激占32%(96只),重度应激占18%(54只)。促排卵后,轻度应激组小鼠2-细胞胚胎数、D4胚胎数和优胚率等与对照组比较差异均无统计学意义,而中、重度应激组小鼠较对照降低(P小鼠2-细胞胚胎和D4胚胎中的表达高于对照组(P<0.05),而重度应激组较对照组差异无统计学意义。结论 CUMS刺激后HSP70的表达升高,可能与其应激保护作用有关。

关键词：热休克蛋白70 慢性轻度不可预见性应激小鼠胚胎免疫荧光染色

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小鼠胚胎首次在太空中生长

大众科学 2023年第10期 30-31页

哺乳动物的胚胎第一次被送人太空,以便科学家可以研究零重力如何影响正在成长的胎儿。近日,日本山梨大学的研究人员首次在国际空间站(ISS)上成功培养了小鼠胚胎,以探索人类在太空怀孕是否安全。相关研究结果发表于《交叉科学》。

关键词：国际空间站小鼠胚胎交叉科学零重力太空哺乳动物首次

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c-型钠钛对小鼠胚胎体外发育的影响

黑龙江动物繁殖 2022年第3期30卷 11-17页

作者：杨诗雨施泓如王晓东刘瑞妍倪志翔佟英伟刘成李翔何长久华中农业大学动物科技学院动物医学院/农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/国家级国际联合研究中心武汉430070

为了探讨c-型钠钛(CNP)对小鼠2细胞/4细胞胚胎转变及囊胚腔形成的影响,收集了小鼠原核期胚胎进行体外培养,随后在不同发育时期的培养体系中添加0,100,200μg/L CNP,分别为对照组、1组和2组。当胚胎发育至2-细胞阶段添加CNP,统计4细胞率... 详细信息

为了探讨c-型钠钛(CNP)对小鼠2细胞/4细胞胚胎转变及囊胚腔形成的影响,收集了小鼠原核期胚胎进行体外培养,随后在不同发育时期的培养体系中添加0,100,200μg/L CNP,分别为对照组、1组和2组。当胚胎发育至2-细胞阶段添加CNP,统计4细胞率和囊胚率;当胚胎发育至致密桑葚胚阶段添加CNP,统计囊胚成腔率、囊胚腔扩张率及囊胚孵化率,并测定扩张囊胚直径、囊胚腔面积占比及囊胚细胞数。结果表明:(1)2细胞阶段添加CNP后,与对照组相比,2组的4细胞发育率和囊胚率显著降低(P0.05),但囊胚总细胞数显著降低(P小鼠2细胞/4细胞胚胎的转变、囊胚腔的形成与扩张,并降低了囊胚细胞数。

关键词： c-型钠肽小鼠胚胎体外发育囊胚腔 2细胞 4细胞囊胚细胞数