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穗花杉双黄酮作为金黄色葡萄球菌MgrA抑制剂对小鼠肺炎的治疗作用

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穗花杉双黄酮作为金黄色葡萄球菌MgrA抑制剂对小鼠肺炎的治疗作用

作者：苏立燕吉林大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)做为临床最为常见革兰氏阳性病原菌之一,具有较强的致病力,能引起多种人畜共患病。从轻微的皮肤软组织感染到诱发多种并发症的败血症、肺炎、心内膜炎等疾病,宿主感染后发病率和死亡... 详细信息

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)做为临床最为常见革兰氏阳性病原菌之一,具有较强的致病力,能引起多种人畜共患病。从轻微的皮肤软组织感染到诱发多种并发症的败血症、肺炎、心内膜炎等疾病,宿主感染后发病率和死亡率较高。近年来,随着耐药性的愈演愈烈,耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的出现和广泛传播给公共卫生与人类健康造成了严重的影响,临床治疗金葡菌感染疾病的药物愈发有限,探索新的治疗途径及药物靶点成为抗菌药物研发的新思路。金葡菌可以感染宿主的多个组织器官,它的致病力依赖于其本身产生的多种毒力因子。抗毒力策略是临床抗菌治疗的一种新替代途径,抗毒力药物在抑制金葡菌毒力的同时对细菌本身不具有选择性压力,既能发挥药物的疗效又能规避耐药性的产生。MgrA(multiple gene regulator)属于Mar R家族,是金葡菌中一种重要的全局性转录调控因子,从多个途径对金葡菌毒力基因进行调控,共调控约350多个基因的表达,其中包括荚膜多糖、α溶血素、蛋白酶、黏附素等。MgrA在金葡菌致病过程中发挥着至关重要的作用,被认为是开发抗菌药物的理想靶标。因此,MgrA抑制剂的筛选和研发能够为临床上治疗金葡菌感染提供新的理论依据及优秀的先导化合物。天然化合物具有来源广、种类多以及药理作用丰富等优点,从天然化合物中筛选抑制剂具有广阔的应用前景。本研究使用荧光各向异性分析法从天然化合物小分子库中筛选出穗花杉双黄酮作为MgrA的高效抑制剂。通过体外实验验证了穗花杉双黄酮对MgrA的活性抑制作用及作用模式;体外联合抑菌实验探究了穗花杉双黄酮开发为临床协同抗细菌感染药物的潜力;最后通过构建小鼠肺炎模型,对穗花杉双黄酮单独使用及与抗生素联合使用对金葡菌感染的治疗效果进行验证。首先,荧光各向异性分析法证明穗花杉双黄酮在低浓度下(IC=3.26±0.18μg/m L)显著抑制MgrA的活性,最小抑菌浓度及生长曲线的测定证实其不影响细菌的生长。凝胶迁移实验显示穗花杉双黄酮呈剂量依赖性抑制MgrA与hla启动子片段的结合,证明穗花杉双黄酮能够抑制MgrA的体外生物活性;通过荧光定量PCR测定了穗花杉双黄酮对MgrA调控的下游基因的影响作用,其中Hla、RNAⅢ、纤连蛋白结合蛋白A的编码基因Fnb A的转录水平受到显著抑制,分别下降3倍、2.5倍、1.5倍,对金葡菌中重要毒力因子α-溶血素转录水平的抑制最为明显。Ebh、Srap、Spa等编码表面蛋白、外源蛋白的基因转录分别上调2.9倍、3.5倍、2.2倍。进一步通过western blot及溶血实验证实穗花杉双黄酮显著抑制α-溶血素的表达及生物学活性;纤维蛋白原结合实验显示穗花杉双黄酮抑制了金葡菌USA300对纤维蛋白原的黏附作用;热稳定迁移实验、细胞内热稳定迁移及荧光淬灭实验揭示了穗花杉双黄酮通过与MgrA直接结合从而抑制其活性;通过分子对接、分子动力学模拟及点突变实验证实了Gln-19以及Cys-12是穗花杉双黄酮与MgrA结合的关键氨基酸残基。为了进一步发掘其临床应用价值,通过棋盘法证实穗花杉双黄酮可以与临床常见抗生素产生协同抗MRSA的作用,其中与头孢曲松钠协同作用最强;杀菌曲线进一步证实了穗花杉双黄酮可以促进金葡菌USA300对头孢曲松钠的敏感性,并显著提高其抗菌活性。最后,我们通过建立小鼠肺炎模型发现穗花杉双黄酮单独使用即能显著提高小鼠存活率,减少肺部载菌量并明显减轻金葡菌感染小鼠肺组织的病理损伤和炎症反应。与头孢曲松钠联合用药,能显著提高头孢曲松钠的治疗效果,并降低其给药剂量。以上结果表明,穗花杉双黄酮是金葡菌转录调控因子MgrA的高效抑制剂,通过与MgrA直接相互作用抑制其生物学活性,显著降低耐甲氧西林金葡菌的致病力,对其感染小鼠肺炎具有显著的治疗效果。此外,穗花杉双黄酮还可与头孢曲松钠联合使用,减少抗生素的用量,增强其抗菌活性,从而延缓耐药性的产生。本研究为后续穗花杉双黄酮作为临床抗金葡菌感染药物及辅助药物的开发提供了新的理论依据和实验证据。

关键词：金黄色葡萄球菌穗花杉双黄酮 MgrA 抑制剂联合用药小鼠肺炎

应用裂解性噬菌体治疗多重耐药肺炎克雷伯氏菌引起的小鼠肺炎

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应用裂解性噬菌体治疗多重耐药肺炎克雷伯氏菌引起的小鼠肺炎

作者：曹放大连理工大学

学位级别：硕士

肺炎克雷伯氏菌是医院获得性肺炎主要的条件致病菌。近年来抗菌药物的不合理使用,导致肺炎克雷伯氏菌耐药株增多、耐药性增强,给用药及治疗造成了极大的困扰,严重威胁人的生命健康。噬菌体是一类细菌性病毒,在自然环境中普遍存在,因其... 详细信息

肺炎克雷伯氏菌是医院获得性肺炎主要的条件致病菌。近年来抗菌药物的不合理使用,导致肺炎克雷伯氏菌耐药株增多、耐药性增强,给用药及治疗造成了极大的困扰,严重威胁人的生命健康。噬菌体是一类细菌性病毒,在自然环境中普遍存在,因其具有特异性、高效性、安全性、低成本、开发周期短等优点,被认为是最具前景的抗生素替代品。本研究探索应用裂解性噬菌体防治多重耐药肺炎克雷伯氏菌引起的小鼠肺炎,为多重耐药菌的治疗提供一条新途径。从医院患肺炎病人的痰液中分离纯化病原菌,经形态学观察、生理生化实验、16SrRNA序列分析、药敏实验分析、生物被膜形成实验对病原菌进行分类鉴定,分离获得一株产生物被膜的多重耐药肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae),命名为KP1513。将已分离的病原菌作为宿主菌,采用双层平板法从医院处理前污水中分离裂解性噬菌体。该噬菌体纯化后,通过透射电镜观察,考察其氯仿敏感性、pH稳定性、温度稳定性、宿主谱、潜伏期、裂解量等噬菌体生物学特性,将筛选获得的裂解性噬菌体命名为phage1513。该噬菌体属于有尾噬菌体目、长尾噬菌体科,宿主专一性强,对氯仿不敏感,因而不含脂类物质,且在小于40℃,pH为5-10范围内较稳定。感染宿主菌的潜伏期约30min,裂解量约264PFU/cell。phage1513基因组测序及功能基因分析表明,该噬菌体基因组大小为49462bp,编码72个基因,含有4个功能模块,与Tunalinkevirus噬菌体属亲缘关系最近,不含抗生素抗性基因及毒素基因,且其裂解机制与穿孔素及裂解酶相关。通过测定细菌与噬菌体共培养物在650nm处的吸光值来考察噬菌体对病原菌的体外裂解效果。体外抑菌实验表明,phage1513具有快速感染并裂解宿主菌的能力,能够抑制生物被膜的形成。体内实验采用滴鼻的给药方式。小鼠致死模型中,通过对比PBS组、噬菌体预防实验组(攻毒24h前给药)和噬菌体治疗实验组(攻毒2h后给药)小鼠的存活率,评价噬菌体防治小鼠肺炎的效果。结果表明,治疗组中不同感染复数的噬菌体均能一定程度上降低小鼠死亡率,且感染复数越高,死亡率越低,但噬菌体不能对小鼠肺炎起到预防作用。在小鼠亚致死模型中,通过考察小鼠肺部组织病理切片,小鼠体重变化,以及肺组织匀浆液中菌数、噬菌体数以及炎症因子(IL-6,TNF-α)的变化,证明phage1513在体内能高效裂解病原菌,改善肺炎症状,减轻炎症反应。本研究筛选了针对多重耐药肺炎克雷伯氏菌的裂解性噬菌体,研究其生物学性质,进行基因组测序及功能基因分析,并对体外体内裂解宿主的能力和效果进行评价,为噬菌体应用于细菌性肺炎的防治提供了依据。

关键词：噬菌体多重耐药肺炎克雷伯氏菌小鼠肺炎

噬菌体对多重耐药肺炎克雷伯菌所致小鼠肺炎和体外生物被膜的作用

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药品评价 2023年第6期20卷 684-687页

作者：李环羽何帆江西省人民医院(南昌医学院第一附属医院) 江西南昌330006 江西省儿童医院江西南昌330006

目的探究噬菌体对多重耐药肺炎克雷伯菌所致的肺炎小鼠模型的治疗效果及其对体外生物被膜的作用。方法选取2019年1月至2021年12月就诊于江西省人民医院的肺炎患者,分别从肺炎患者痰液和医院处理前废水中获取提纯病原菌和噬菌体,经检测... 详细信息

目的探究噬菌体对多重耐药肺炎克雷伯菌所致的肺炎小鼠模型的治疗效果及其对体外生物被膜的作用。方法选取2019年1月至2021年12月就诊于江西省人民医院的肺炎患者,分别从肺炎患者痰液和医院处理前废水中获取提纯病原菌和噬菌体,经检测结果分析为多重耐药肺炎克雷伯菌和裂解性噬菌体。提纯的宿主菌和噬菌体分别进行体外和体内实验。先测定共培养物650 nm处吸光度值,观察炎症噬菌体在体外的裂解效果。体内实验对构建的肺炎小鼠模型通过滴鼻给药的方式进行噬菌体干预,对比小鼠存活情况,以观察噬菌体对肺炎的治疗效果。结果体外实验表明,噬菌体在体外具有很好的裂解效果。噬菌体在体内可以有效地治疗肺炎克雷伯菌引起的小鼠肺炎。噬菌体对小鼠感染肺炎的保护作用与感染复数呈正相关。结论噬菌体可治疗多重耐药肺炎克雷伯菌引发的小鼠肺炎,提示临床治疗多重耐药菌肺炎也可采用噬菌体进行治疗,为多重耐药肺炎克雷伯菌肺炎提供新的治疗思路。

关键词：肺炎克雷伯菌抗药性,多种,细菌噬菌体小鼠肺炎

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空调故障引发实验小鼠肺炎的报道

中国比较医学杂志 2007年第8期17卷 I0019-I0019页

作者：李贵才姜媛丽张健锋王蓓蕾薄文学长春生物制品研究所长春130062

目的某实验室在屏障系统饲养KM实验小鼠3组,共24只。由于空调系统突然发生故障,小鼠相继出现疾病症状,经病理确诊为肺炎。结果全部实验鼠做淘汰处理。提示屏障系统实验室无论在新建、改建都应考虑两套设备,在发生紧急情况时可以避免突... 详细信息

目的某实验室在屏障系统饲养KM实验小鼠3组,共24只。由于空调系统突然发生故障,小鼠相继出现疾病症状,经病理确诊为肺炎。结果全部实验鼠做淘汰处理。提示屏障系统实验室无论在新建、改建都应考虑两套设备,在发生紧急情况时可以避免突发故障造成的损失。

关键词：空调故障小鼠肺炎屏障系统

鸢尾黄素作为MgrA抑制剂对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的治疗作用

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中国畜牧兽医 2021年第7期48卷 2617-2626页

作者：苏立燕王莉吴佳岂关舒函王大成王琳吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室长春130062 吉林大学动物科学学院长春130062

本研究旨在从中药小分子库中筛选出金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)转录调控因子MgrA的单体抑制剂,并探讨其对金黄色葡萄球菌主要毒力因子的影响及对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的治疗作用。使用荧光各向异性分析法进行抑制剂的筛选... 详细信息

本研究旨在从中药小分子库中筛选出金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)转录调控因子MgrA的单体抑制剂,并探讨其对金黄色葡萄球菌主要毒力因子的影响及对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的治疗作用。使用荧光各向异性分析法进行抑制剂的筛选,通过实时荧光定量PCR、溶血试验及纤维蛋白原黏附试验考察药物对MrgA调控的相关毒力基因转录表达及对溶血和黏附的抑制作用,采用热稳定迁移试验对其抑制机制进行初步探讨,最后通过建立小鼠肺炎模型评估鸢尾黄素对金黄色葡萄球菌诱导的小鼠肺炎的治疗作用。结果显示,鸢尾黄素作为MgrA的抑制剂,在不影响细菌生长的低浓度下(IC50=20.35μg/mL)就能显著抑制MgrA的活性(P小鼠肺炎试验结果显示,鸢尾黄素能极显著提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率(P小鼠肺脏组织的病理损伤和炎症反应。以上结果表明,鸢尾黄素能通过抑制转录调控因子MgrA的活性对金黄色葡萄球菌感染引起的小鼠肺炎起到治疗作用,可作为开发治疗金黄色葡萄球菌感染的先导化合物,并为以毒力因子MgrA为靶标的药物研发提供了理论依据。

关键词：鸢尾黄素金黄色葡萄球菌 MgrA 抑制剂小鼠肺炎

异牡荆苷作为sortase A抑制剂对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的保护作用

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中国兽医学报 2020年第7期40卷 1339-1346页

作者：田莉莉母丹王莉王铁东王大成高丰王琳吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062 吉林大学动物科学学院吉林长春130062

sortase A(SrtA)是一种重要的毒力决定因子,负责将多种毒力相关蛋白锚定在金黄色葡萄球菌(***)的细胞表面,在其致病过程中发挥重要作用,是开发抗金黄色葡萄球菌毒力药物的理想靶点。本研究首先通过荧光共振能量转移试验发现异牡荆苷是S... 详细信息

sortase A(SrtA)是一种重要的毒力决定因子,负责将多种毒力相关蛋白锚定在金黄色葡萄球菌(***)的细胞表面,在其致病过程中发挥重要作用,是开发抗金黄色葡萄球菌毒力药物的理想靶点。本研究首先通过荧光共振能量转移试验发现异牡荆苷是SrtA的可逆抑制剂;又利用细胞侵袭试验证明异牡荆苷能够显著抑制金黄色葡萄球菌对A549细胞的内化作用;最后考察了异牡荆苷对小鼠肺炎的保护作用,发现异牡荆苷能明显减轻金黄色葡萄球菌感染性肺炎小鼠肺组织的病理损伤和炎症反应,减少肺部载菌量,显著提高小鼠存活率。以上结果表明,异牡荆苷能够通过抑制毒力因子SrtA对金黄色葡萄球菌引起的小鼠肺炎起到保护作用,是一种很有前景的抗金黄色葡萄球菌毒力活性化合物,可作为开发治疗金黄色葡萄球菌感染药物的先导化合物。

关键词：异牡荆苷金黄色葡萄球菌 sortase A(SrtA) 小鼠肺炎

耐药性鲍曼不动杆菌噬菌体特性和基因组及应用效果评价

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耐药性鲍曼不动杆菌噬菌体特性和基因组及应用效果评价

作者：彭帆中南大学

学位级别：硕士

目的：耐药性鲍曼不动杆菌已成为医院主要的病原体,且很容易通过交叉感染在医院内爆发流行,威胁患者的生命。寻找有效的预防及治疗的方法是临床亟待解决的问题。噬菌体被认为是针对耐药菌防治的一种有效手段。本论文对噬菌体消毒和治疗... 详细信息

目的：耐药性鲍曼不动杆菌已成为医院主要的病原体,且很容易通过交叉感染在医院内爆发流行,威胁患者的生命。寻找有效的预防及治疗的方法是临床亟待解决的问题。噬菌体被认为是针对耐药菌防治的一种有效手段。本论文对噬菌体消毒和治疗的有效性进行了初步研究,为防治多耐药鲍曼不动杆菌感染提供新的思路。方法：本研究根据鲍曼不动杆菌耐药严重的现状,对收集到的40株耐药性鲍曼不动杆菌进行脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型;并以这些菌为指示菌分离噬菌体;选取其中一株噬菌体IME-AB2进行生物学特性和全基因组分析;并对该噬菌体在菌液及物体表面的消毒效果进行了探究,采用噬菌体吸入治疗小鼠多耐药鲍曼不动杆菌肺部感染,研究其体内治疗效果。结果：40株耐药性鲍曼不动杆菌显示对大多数抗生素耐药,包括含酶抑制剂和碳氢霉烯类。通过脉冲场凝胶电泳可将细菌分为A、B、C共3个种克隆型,B型26(65%)株,为主要的克隆型。多位点序列分型中发现细菌共分13个ST型,以ST208为最原始ST型,ST218、ST195、ST369、ST451、ST238、ST368、ST469均由ST208分化而来,共24株(占60%)。本研究成功分离出16株耐药性鲍曼不动杆菌噬菌体,对40株菌的裂解覆盖率达78%。选取一株噬菌体IME-AB2进行研究,该株噬菌体滴度高达1011pfu/ml,可以快速吸附到宿主菌表面,潜伏期和爆发时间短,在LB培养基中可以4℃长期保存,反映出该株噬菌体裂解的高效能和稳定性。电镜观察显示这株噬菌头部呈二十面体结构,含有尾部结构,属于肌尾噬菌体。噬菌体IME-AB2基因组是一条环状的双链DNA分子,全长43665bp,全基因组平均GC含量为37.5%,编码82个蛋白质基因。全基因组序列已在NCBI GenBank注册(GenBank Accession number:JX976549)。该株噬菌体能在4小时内使混浊菌液变澄清,并且能使器物表面的细菌数量明显减少。在通过吸入治疗小鼠肺炎的研究中,小鼠肺部接种细菌后30min,4h,24h给予噬菌体治疗,分别得到100%,50%,20%的生存率;以不同MOI(感染复数)进行治疗,MOI=1时生存率100%,MOI=0.1时生存率80%, MOI=0.01时生存率60%,MOI=0.001时生存率50%,PBS组生存率只有10%。治疗的小鼠肺泡灌洗液中的细菌明显少于非治疗组,噬菌体数量没有明显差异,小鼠肺脏病理结果显示噬菌体疗效显著。结论：噬菌体对耐药性鲍曼不动杆菌具有良好的体内、外抗菌作用,为临床开发防治耐药性鲍曼不动杆菌感染的制剂提供实验基础。图16幅,表13个,参考文献41篇。

关键词：鲍曼不动杆菌噬菌体脉冲场凝胶电泳多位点序列分型生物学特性全基因组小鼠肺炎噬菌体治疗