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小鼠睾丸糖基化蛋白质组学研究

小鼠睾丸糖基化蛋白质组学研究

作者：刘方娟南京医科大学

学位级别：硕士

N-糖基化是生物体内最重要和最普遍的修饰方式之一,参与多种生物进程包括蛋白质折叠、蛋白质定位。很多证据表明糖基化在精子发生以及受精过程中起到重要作用,但我们对糖基化修饰蛋白的组成和生物结构知道的很少。睾丸作为一个重要的生... 详细信息

N-糖基化是生物体内最重要和最普遍的修饰方式之一,参与多种生物进程包括蛋白质折叠、蛋白质定位。很多证据表明糖基化在精子发生以及受精过程中起到重要作用,但我们对糖基化修饰蛋白的组成和生物结构知道的很少。睾丸作为一个重要的生殖内分泌器官,主要产生精子和分泌雄激素。睾丸结构复杂以及其在男性生殖系统中的重要作用都表明了其在研究男性生育方面至关重要的影响力。而在另一方面,蛋白质组学技术广泛地应用于组织和细胞水平整体蛋白质的定性和定量研究;而近年来马普实验室利用凝集素来富集糖基化蛋白后,再使用质谱进行鉴定,同时利用重水环境对糖肽段进行凝集素酶切,使蛋白质组学能够用于系统而全面地解析样本中糖蛋白的具体修饰位点。目前,尚未有小鼠睾丸组织糖基化修饰谱系报道,因此本实验主要通过结合液相色谱-串联质谱蛋白质组学技术和糖肽富集技术构建小鼠睾丸N-糖基化蛋白质谱系,共鉴定到了1463个糖基化位点,分布于740种N-糖基化蛋白质。我们通过生物信息学方法系统阐释这些修饰位点的序列特征、对应修饰蛋白主要参与的功能和调控通路。我们发现除鉴定的NXS和NXT基序外,在睾丸中最为富集的基序为NCX。GO和KEGG功能富集分析揭示了这些蛋白主要定位在细胞膜、溶酶体和高尔基体等部位,具有水解酶和肽酶等活性,主要参与细胞黏附、蛋白质水解和定位等事件。最后,我们进一步挑选了部分非分泌型的睾丸特异性的糖基化蛋白进行详细分析,构建了复杂交互作用和基因功能调控网络,发现这些糖蛋白与精子发生等过程密切相关。本实验为研究糖蛋白在精子发生过程中作用的分子机制研究提供了理论基础和备选分子靶标。

关键词：小鼠睾丸蛋白质组学 N端糖基化糖基化蛋白质谱质谱

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黄芩苷对热应激小鼠睾丸氧化损伤的保护作用

农业生物技术学报 2017年第9期25卷 1470-1477页

作者：高琛隋君霞周颖璐姜忠玲王新丛霞曹荣峰李华涛田文儒青岛农业大学动物科技学院

哺乳动物各种生理功能中,生殖功能最易受热应激损伤。热应激使组织产生氧化应激,破坏雄性动物精子生成,从而影响繁殖效率。为探究黄芩苷对热应激小鼠(Mus musculus)睾丸损伤的影响,探讨黄芩苷的抗氧化作用机制,本研究将小鼠分成4组,常... 详细信息

哺乳动物各种生理功能中,生殖功能最易受热应激损伤。热应激使组织产生氧化应激,破坏雄性动物精子生成,从而影响繁殖效率。为探究黄芩苷对热应激小鼠(Mus musculus)睾丸损伤的影响,探讨黄芩苷的抗氧化作用机制,本研究将小鼠分成4组,常温对照组(C组)、黄芩苷组(C+B组)、热应激组(H组)和热应激加黄芩苷组(H+B组)。C组和H组小鼠腹腔注射生理盐水,C+B组和H+B组小鼠腹腔注射黄芩苷(50 mg/kg),连续注射7 d,H组与H+B组于第8天热应激(41℃)2 h,热应激结束后立即用断颈法处死所有处理组和对照组小鼠,取睾丸及附睾检测脏器系数和制备睾丸组织切片,睾丸组织用于检测氧化损伤指标丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活力。末端脱氧核苷酸转移酶检测法(Td T-mediated d UTP nick-end labeling,TUNEL)法检测睾丸组织细胞的凋亡。Western blot检测睾丸组织内Fas/Fas L蛋白的表达。结果显示,热应激能够显著降低睾丸和附睾脏器系数(P睾丸组织结构发生病理性损伤,而黄芩苷可以显著缓解热应激引起的睾丸脏器系数降低(P小鼠睾丸组织中MDA含量显著降低,SOD、CAT和GSH-Px活力则显著增加(P小鼠睾丸组织细胞凋亡率与对照组相比显著增加(P小鼠睾丸细胞凋亡率则显著降低(P小鼠睾丸组织Fas(P小鼠睾丸组织中Fas/Fas L蛋白表达(P小鼠睾丸组织因氧化损伤造成的凋亡,其机制可能与增加抗氧化酶活性以及抑制Fas/Fas L蛋白表达来抑制细胞凋亡有关,这为寻找缓解动物热应激方法提供理论依据。

关键词：黄芩苷热应激小鼠睾丸细胞凋亡氧化损伤 Fas/Fasl

小鼠睾丸巨细胞病毒感染对精子顶体反应与膜功能的影响

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中华医学杂志 2005年第24期85卷 1714-1717页

作者：熊锦文熊承良田永红李双徐惠敏胡廉丁晓芳华中科技大学同济医学院计划生育研究所生殖医学中心武汉430030

目的探讨小鼠睾丸巨细胞病毒(MCMV)感染对附睾尾部精子顶体反应与膜功能的影响。方法随机选择无MCMV感染史的BALB/c雄性小鼠48只作为实验组,睾丸直接接种MCMV,分别于感染后第1、2、4、6、9、14天处死小鼠,用地高辛标记的MCMVM83mRNA寡... 详细信息

目的探讨小鼠睾丸巨细胞病毒(MCMV)感染对附睾尾部精子顶体反应与膜功能的影响。方法随机选择无MCMV感染史的BALB/c雄性小鼠48只作为实验组,睾丸直接接种MCMV,分别于感染后第1、2、4、6、9、14天处死小鼠,用地高辛标记的MCMVM83mRNA寡核苷酸探针对睾丸组织进行原位杂交,检测睾丸MCMV感染情况,同时取附睾尾部成熟精子进行精子顶体反应与精子膜低渗肿胀功能检测。另设平行对照组雄性小鼠30只(同法随机选择),睾丸接种不含MCMV的细胞培养液,其他处理方法同实验组。结果实验组48只雄性小鼠睾丸组织间质及(或)生精细胞中均出现原位杂交阳性信号。实验组精子顶体反应与膜功能在接种病毒后的第2天、第4天,精子顶体反应率(58%±9%、56%±9%)低于平行对照组(71%±6%、70%±7%)(P均小鼠睾丸MCMV感染模型成功建立。小鼠睾丸MCMV急性感染可导致精子顶体反应与膜功能的显著下降。

关键词：精子顶体反应小鼠睾丸巨细胞病毒感染膜功能 MCMV BALB/c 寡核苷酸探针雄性小鼠原位杂交地高辛标记细胞培养液顶体反应率低渗肿胀率实验组对照组直接接种睾丸组织 mRNA 感染情况功能检测成熟精子处理方法

Transcriptome profiling of the developing postnatal mouse testis using next-generation sequencing

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Science China(Life Sciences) 2013年第1期56卷 1-12页

作者： GONG Wei PAN LinLin LIN Qiang ZHOU YuanYuan XIN ChengQi YU XiaoMin CUI Peng HU SongNian YU Jun CAS Key Laboratory of Genome Sciences and Information Beijing Institute of GenomicsChinese Academy of Sciences Graduate University of Chinese Academy of Sciences

Mammalian testis development is a complex and highly sophisticated process. To study the dynamic change of normal testis development at the transcriptional level, we investigated mouse testes at three postnatal ages: 6 days postnatal, 4 weeks old, and 10 weeks old, representing infant (PN1), juvenile (PN2), and adult (PN3) stages, respectively. Using ultra high-throughput RNA sequencing (RNA-seq) technology, we obtained 211 million reads with a length of 35 bp. We identified 18837 genes that were expressed in mouse testes, and found that genes expressed at the highest level were involved in spermatogenesis. The gene expression pattern in PN1 was distinct from that in PN2 and PN3, which indicates that spermatogenesis has commenced in PN2. We analyzed a large number of genes related to spermatogenesis and somatic development of the testis, which play important roles at different developmental stages. We also found that the MAPK, Hedgehog, and Wnt signaling pathways were significantly involved at different developmental stages. These findings further our understanding of the molecular mechanisms that regulate testis development. Our study also demonstrates significant advantages of RNA-seq technology for studying transcriptome during development.

关键词：小鼠睾丸发育过程转录水平测序基因表达模式 Wnt信号通路组分精子发生

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草甘膦暴露对小鼠睾丸代谢物的影响

中文科技期刊数据库（引文版）医药卫生 2022年第11期 0248-0250页

作者：齐磊李瑜鹏董艳梅马淑丽李刚齐齐哈尔医学院公共卫生学院黑龙江齐齐哈尔161000 齐齐哈尔医学院附属第三医院体检科黑龙江齐齐哈尔161000

草甘膦是全球范围内使用最广泛和使用量最大的除草剂。早期研究显示,草甘膦对哺乳动物几乎无毒,故其被广泛应用于农作物的种植与生产过程。近年来研究显示,抗草甘膦大豆作物可以富集更高浓度的草甘膦,进而通过食物链进入人体。随着草甘... 详细信息

草甘膦是全球范围内使用最广泛和使用量最大的除草剂。早期研究显示,草甘膦对哺乳动物几乎无毒,故其被广泛应用于农作物的种植与生产过程。近年来研究显示,抗草甘膦大豆作物可以富集更高浓度的草甘膦,进而通过食物链进入人体。随着草甘膦用量的不断增加,它对生物生殖系统的毒作用逐渐受到人们的关注。研究显示草甘膦的毒性能够抑制有益菌生长而促进有害菌的生长致使肠道菌群失衡而导致结菌群代谢紊乱。基于对肠道菌群的干扰功能,草甘膦可以影响生殖发育,还可以增加患癌风险。睾丸是外源有毒化学物敏感的靶器官,已有大量研究表明草甘膦能够引起动物睾丸组织损伤。如,高剂量的草甘膦暴露可以诱导大鼠睾丸间质细胞凋亡,低剂量暴露时还可以引起内分泌代谢紊乱。除此,研究者发现草甘膦能够引起小鼠生殖器官重量降低,精子浓度减少,精子畸形率增加,显示出较强的生殖毒性作用。相关体外研究发现,经草甘膦农药处理的小鼠精原细胞皱缩明显,密度降低,部分细胞呈现空泡化,染色质固缩。相关机制研究表明,氧化应激在草甘膦的毒作用损伤中扮演者重要作用。有研究表明,草甘膦暴露能够促进活性氧的产生,降低谷胱甘肽含量和相关抗氧化酶活性,如氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶;同时,还能导致生殖细胞脂质过氧化,使得丙二醛生成量增多。另外,草甘膦暴露能够导致细胞膜受损,通透性增强,DNA断裂。

关键词：草甘膦小鼠睾丸影响

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小鼠睾丸hsc70t基因的克隆与序列分析

中国农学通报 2009年第4期25卷 14-17页

作者：侯春霞姜忠玲田文儒青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109

为了获得小鼠睾丸hsc70t基因的开放阅读框,根据GenBank中已发表的hsc70t的基因序列设计了特异性引物(GenBank accession No:NM_013558),提取睾丸中的总DNA,利用PCR方法扩增hsc70t基因序列,连接到pMD18-T载体上,然后进行序列测定与序列... 详细信息

为了获得小鼠睾丸hsc70t基因的开放阅读框,根据GenBank中已发表的hsc70t的基因序列设计了特异性引物(GenBank accession No:NM_013558),提取睾丸中的总DNA,利用PCR方法扩增hsc70t基因序列,连接到pMD18-T载体上,然后进行序列测定与序列分析。测序结果表明PCR扩增得到一条1926bp左右的基因片段。所测序列被GenBank收录,收录号为EU549780,与GenBank上公布的小鼠hsc70t基因序列同源性达99.9%,与大鼠(Rattus norvegicus)、猕猴(Macaca mulatta)、黑猩猩(Pan troglodytes)、蟾蜍(Xenopus)、人类(Homo)和青鳉(Oryzias latipes)的相似性分别为94.4%、85.4%、84.9%、72.7%、71.9%、67.1%;进化树构建结果表明小鼠与大鼠距离最近。证实了hsp70基因的高度保守性,并为hsc70t的进一步研究和应用奠定了基础。

关键词：小鼠睾丸 hsc70t基因同源性

内质网应激在DEHP诱导的雄性小鼠睾丸损伤中的作用

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内质网应激在DEHP诱导的雄性小鼠睾丸损伤中的作用

作者：潘俊霖山东师范大学

学位级别：硕士

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)通常作为塑化剂被广泛应用于生活中。作为一种无处不在的环境内分泌干扰物,DEHP对动物和人类健康存在多种毒性作用,如发育毒性、免疫毒性、神经毒性。在这些毒性影响中,对雄性生殖系统的损伤最为严重... 详细信息

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)通常作为塑化剂被广泛应用于生活中。作为一种无处不在的环境内分泌干扰物,DEHP对动物和人类健康存在多种毒性作用,如发育毒性、免疫毒性、神经毒性。在这些毒性影响中,对雄性生殖系统的损伤最为严重。已有相关证据表明,DEHP孕期暴露,可以对雄性子代产生不利的生殖影响。本实验选取6周龄ICR雌鼠与9周龄ICR雄鼠进行交配,检栓成功后孕鼠被随机分配到橄榄油对照组、675 mg/kg/day的DEHP处理组以及675 mg/kg/day DEHP和100 mg/kg/d 4-PBA(内质网应激的抑制剂)共同处理组中。橄榄油与DEHP通过灌胃的方式在妊娠期第9.5天到第15.5天对孕鼠进行暴露。4-PBA以腹腔注射的方式于孕期的第9.5天到18.5天进行持续注射,并于出生后第10天对子代雄性小鼠进行注射,直至取材结束。胚胎第18.5天、出生后第14天、28天和35天雄性小鼠取其睾丸后应用HE染色、透射电镜技术,分别在组织学水平以及超微结构水平上对F1代雄性小鼠的生殖系统损伤情况进行评估。进一步应用转录组分析、免疫组织化学、qRT-PCR、Western Blot等实验方法,从内质网应激、黏附连接角度进一步解释DEHP造成睾丸组织形态异常与细胞内质网应激的关系,以此对DEHP造成子代雄性生殖损伤具体机制进行探讨。结果发现,DEHP孕期暴露后1)胚胎期睾丸生精小管数目显著性减少以及内质网肿胀。2)青春期小鼠肛殖距和睾丸湿重明显下降、曲细精管萎缩、睾丸组织内部产生脱落的细胞、胞间间隙增大、空泡化以及内质网肿胀。3)出生后35天小鼠睾丸的转录组分析表明,与对照组相比,DEHP处理后差异表达基因大部分显著下调。4)PND 28d和35d小鼠睾丸组织细胞黏附连接相关蛋白(N-cadherin)表达显著下调。5)青春期小鼠睾丸细胞启动内质网应激反应同时启动了内质网应激介导的凋亡信号通路。6)青春期小鼠注射4-BPA抑制内质网应激后,DEHP所导致的曲细精管萎缩以及内质网肿胀现象得以明显修复,N-钙黏蛋白表达上调。综上所述,可以得到以下结论:1)孕期DEHP暴露可以对F1代胚胎和青春期小鼠产生不利的生殖影响,造成胚胎期和青春期小鼠睾丸组织形态异常。2)对子代青春期小鼠而言,DEHP暴露后激活了内质网应激反应中的未折叠蛋白反应和内质网应激介导的凋亡信号通路,并且该反应进一步导致了细胞黏附连接蛋白(N-cadherin)表达的下调。3)应用内质网应激抑制剂进一步证实了DEHP诱导的睾丸曲细精管的萎缩和内质网肿胀现象与内质网应激反应密切相关。

关键词： DEHP 小鼠睾丸内质网应激 N型钙粘蛋白

基于新一代测序方法的小鼠睾丸出生后发育的转录组研究

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中国科学：生命科学 2013年第2期43卷 137-150页

作者：龚未潘林林林强周媛媛辛成齐俞晓敏崔鹏胡松年于军中国科学院北京基因组研究所基因组学与信息重点实验室北京100029 中国科学院大学北京100049

哺乳动物睾丸的发育是一个高度复杂而精密的过程.为了从转录组水平研究睾丸正常发育过程中的动态变化,本实验选取了出生后6日龄、4周龄和10周龄的3组小鼠,分别代表其幼年期、青春期以及成年期.应用超高通量的新一代测序技术(RNA-seq),... 详细信息

哺乳动物睾丸的发育是一个高度复杂而精密的过程.为了从转录组水平研究睾丸正常发育过程中的动态变化,本实验选取了出生后6日龄、4周龄和10周龄的3组小鼠,分别代表其幼年期、青春期以及成年期.应用超高通量的新一代测序技术(RNA-seq),获得了2.11亿条长度为35bp的序列,鉴定出18837个基因,并且发现表达量最高的基因均与精子发生相关.同时,也发现6日龄小鼠睾丸的基因表达谱明显有别于4和10周龄,表明4周龄小鼠已进入性发育期.本文分析了睾丸发育过程中大量与精子发生和体细胞发育相关的基因,找到了MAPK,Hedgehog和Wnt等信号通路在睾丸不同发育阶段中所起的重要作用.这些研究结果加深了对睾丸发育的分子调控机制的认识.本研究也表明新一代测序技术在转录组研究中具有很大优势.

关键词：新一代测序转录组小鼠睾丸发育

氯化汞对小鼠睾丸的生精机能及酶活性影响的研究

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黑龙江畜牧兽医 2017年第8期 224-227,298页

作者：何刘常洋于立辉姜丽莹李慧杨淑华何剑斌沈阳农业大学畜牧兽医学院沈阳110161 沈北新区动物防疫监督所沈阳110000

汞俗称水银,是银白色液态金属,广泛分布于环境中,并用于工农业生产、医药、国防等多个领域。由汞废弃物所造成的环境污染日趋严重,汞对植物、动物以及人体都会产生一定程度的毒害作用。环境中的汞及其氯化物等均有环境激素的作用,环境... 详细信息

汞俗称水银,是银白色液态金属,广泛分布于环境中,并用于工农业生产、医药、国防等多个领域。由汞废弃物所造成的环境污染日趋严重,汞对植物、动物以及人体都会产生一定程度的毒害作用。环境中的汞及其氯化物等均有环境激素的作用,环境激素对雄性动物生殖系统的影响表现为：性腺发育不良，生精细胞、支持细胞、间质细胞数目减少，精子数目减少，精液质量下降等。

关键词：小鼠睾丸生精雄性动物睾丸组织酶活性生殖系统精子畸形率支持细胞生殖毒性环境激素