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基于超快速VPCR荧光可视化检测技术的小檗皮及其藏成药中原料药的真伪鉴别研究

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中草药 2023年第12期54卷 3983-3989页

作者：李红颖宋文俊李慧林张继晨范刚陈蓉成都中医药大学药学院四川成都611137 成都中医药大学民族医药学院四川成都611137 四川天府新区新经济发展研究中心四川成都610299

目的建立藏药小檗皮BerberisCortex及藏成药中小檗皮特异性DNA的超快速荧光可视化检测方法,实现对小檗皮药材及藏成药中小檗皮的快速鉴别。方法将小檗皮及其混淆品的ITS2序列进行比对,筛选出小檗皮药材特异性DNA序列;针对该序列设计小... 详细信息

目的建立藏药小檗皮BerberisCortex及藏成药中小檗皮特异性DNA的超快速荧光可视化检测方法,实现对小檗皮药材及藏成药中小檗皮的快速鉴别。方法将小檗皮及其混淆品的ITS2序列进行比对,筛选出小檗皮药材特异性DNA序列;针对该序列设计小檗皮特异性引物,建立小檗皮药材以及藏成药中小檗皮特异性DNA的超快速VPCR扩增体系;后将该扩增体系与SYBR Green I荧光染料相结合,实现对扩增产物的荧光可视化检测;同时对该体系的特异性、灵敏度以及在真实样本中的适用性进行考察。结果该体系可以在40min内完成对小檗皮以及藏成药中小檗皮特异性DNA的扩增及荧光可视化检测;检测限低至10pg/μL;对16个批次的小檗皮药材进行分析,其中15个批次的样本产生阳性信号鉴定为小檗皮,与测序结果100%一致,1个批次的样本产生阴性信号,该样本经通用引物测序鉴定为黄柏;对3种含有小檗皮的藏成药进行分析,3个样本均产生阳性信号。结论所建方法缩短了检测时间,并且特异性良好,灵敏度高,可以对小檗皮及其藏成药中小檗皮进行快速、准确的可视化鉴别。

关键词：小檗皮 VPCR 快速扩增可视化检测藏成药

基于DNA分子鉴定技术的藏药小檗皮及其藏成药的可视化基因检测

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基于DNA分子鉴定技术的藏药小檗皮及其藏成药的可视化基因检测

作者：李红颖成都中医药大学

学位级别：硕士

藏药小檗皮为小檗科植物甘肃小檗Berberis kansuensis Schneid.及其同属多种植物的干燥内皮,是藏药中典型的多基原品种。由于小檗皮与黄柏在外观性状上的相似性,课题组调查发现市场中存在黄柏与小檗皮混用的现象;同时课题组了解到目前... 详细信息

藏药小檗皮为小檗科植物甘肃小檗Berberis kansuensis Schneid.及其同属多种植物的干燥内皮,是藏药中典型的多基原品种。由于小檗皮与黄柏在外观性状上的相似性,课题组调查发现市场中存在黄柏与小檗皮混用的现象;同时课题组了解到目前各藏医院、藏药厂及药材市场上使用的主流品种包括匙叶小檗*** Schneid.、鲜黄小檗*** Maxim.、甘肃小檗*** Schneid.和刺红珠*** Franch.,不同基原小檗皮之间的传统性状相似,在藏医用药中常互相代替,但课题组在研究过程中发现不同基原小檗皮的药用功效存在差异,质量也参差不齐,这些混用情况严重影响了小檗皮的质量评控与临床使用。因此,开发更加准确、简便、快速的小檗皮品种鉴别方法对小檗皮及其成药的质量控制和市场监管具有重要意义。传统的鉴定方法有一定的局限性,本研究从分子生物学角度,采用DNA分子鉴定技术对小檗皮进行真伪鉴别和品种鉴定,并利用实时荧光定量VPCR技术初步建立藏成药中小檗皮的定量检测方法。目的:1.基于位点特异性PCR技术结合荧光可视化分析技术建立小檗皮及其混淆品黄柏的荧光可视化真伪鉴别方法,实现对小檗皮药材及其藏成药当中小檗皮的快速真伪鉴别;基于位点特异性PCR技术结合荧光可视化分析技术建立藏药小檗皮4种主流品种的特异性可视化鉴别方法,实现对小檗皮药材及其藏成药当中小檗皮品种的基原鉴别。2.基于实时荧光定量VPCR技术建立小檗皮药材的定量检测方法,实现对藏成药中原料药小檗皮的定量检测。3.进一步优化藏药小檗皮DNA检测方法,实现对小檗皮药材及藏成药中小檗皮的快速检测。方法:1.对小檗皮和混淆品黄柏的ITS2序列进行对比分析,筛选出小檗皮药材特异性DNA序列,针对该序列分别设计小檗皮和混淆品黄柏的特异性引物,采用VPCR技术结合荧光可视化分析技术,进一步缩短扩增时间,同时对体系中的退火温度、引物浓度、Taq酶用量以及循环数进行优化,并利用所建立的可视化检测方法对小檗皮和黄柏的商品药材及藏成药中的小檗皮进行快速真伪鉴别,以证明方法的实用性。2.对比藏药小檗皮主流品种匙叶小檗*** Schneid.、鲜黄小檗*** Maxim.、甘肃小檗*** Schneid.和刺红珠*** Franch.的rbc L序列,利用SNPs位点,设计4种主流品种的特异性引物,采用两步法PCR,引入SYBR GreenⅠ染料检测PCR扩增产物,实现对扩增产物的荧光可视化检测。对体系中的退火温度、引物浓度、Taq酶用量以及循环数进行优化,利用所建立的可视化检测方法对小檗皮商品药材和藏成药中的小檗皮进行基原品种鉴定,以证明方法的实用性。3.根据实时荧光定量VPCR原理,建立藏成药中小檗皮药材的定量检测方法,再对方法的特异性灵敏度进行考察;为进一步缩短检测时间,考察了3种提取方法(试剂盒提取法、CTAB法和直接裂解法)对实时荧光定量VPCR体系的影响;考察DNA含量与药材重量的线性关系,最后利用所建立的小檗皮实时荧光定量VPCR体系对八味小檗皮胶囊、四味姜黄汤散、八味獐牙菜胶囊中小檗皮含量进行定量检测。4.在碱裂解法的基础上,考察药材及藏成药的用量、Na OH溶液的浓度、体积,建立小檗皮药材及其藏成药基因组DNA的快速提取方法,采用ITS2通用引物对提取出的DNA进行质量检测,观察凝胶电泳条带及荧光显色,最后利用所建立的碱裂解法提取16批小檗皮商品药材及10批藏成药的基因组DNA,并利用常规PCR技术对基因组DNA的质量进行验证。结果:1.建立的超快速VPCR可视化荧光检测体系可以将扩增检测时间从传统的2小时左右缩短至30分钟;检测限低至10 pg/μL;对18个批次的小檗皮和黄柏商品药材和10批藏成药进行分析,检测结果发现其中15个批次的药材样本为小檗皮,3个批次的药材样本为黄柏,检测结果经测序验证,与测序结果100%一致;对10批藏成药进行真伪鉴定时发现,有9个批次的样本中含有正品小檗皮,1个批次的藏成药中含有混伪品黄柏。2.本研究成功建立了匙叶小檗、甘肃小檗和刺红珠的特异性可视化鉴别体系。利用4种小檗皮的通用引物和所建立的特异性可视化鉴别体系对16个批次的小檗皮商品药材进行分析,发现其中4个样本为匙叶小檗,6个样本为甘肃小檗,2个样本为刺红珠,3个样本为鲜黄小檗,经rbc L通用引物测序与Gen Bank数据库中序列一致,剩余1个阴性样本,鉴定为混伪品黄柏;同样对9批含有小檗皮的藏成药进行基原品种鉴别时发现,其中2个批次的藏成药在投料时同时加入了匙叶小檗及甘肃小檗,1批次加入了匙叶小檗及刺红珠,3个批次的藏成药仅加入了甘肃小檗,剩余3个批次加入了鲜黄

关键词：小檗皮特异性DNA VPCR 质量控制藏成药碱裂解

小檗皮总生物碱提取物的大孔树脂纯化工艺与质量标准考察

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中国实验方剂学杂志 2019年第16期25卷 97-103页

作者：冯慧赵娅王小艳向宇楠郝露李啟恩李先加赖先荣成都中医药大学民族医药学院成都611137 青海大学藏医学院西宁810000

目的:优选小檗皮总生物碱提取物的大孔树脂纯化工艺,并建立其质量标准,为该有效部位的制剂开发提供参考。方法:采用酸性染料比色法考察小檗皮总生物碱提取物的纯化工艺,考察的工艺参数包括上样液质量浓度、上样速度、树脂柱径高比、水... 详细信息

目的:优选小檗皮总生物碱提取物的大孔树脂纯化工艺,并建立其质量标准,为该有效部位的制剂开发提供参考。方法:采用酸性染料比色法考察小檗皮总生物碱提取物的纯化工艺,考察的工艺参数包括上样液质量浓度、上样速度、树脂柱径高比、水洗用量、洗脱剂体积分数及用量、洗脱流速等。采用HPLC测定小檗皮总生物碱提取物中4种生物碱类成分(木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱)的含量,流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱,检测波长270 nm,确定最佳纯化工艺。按2015年版《中国药典》的要求进行小檗皮总生物碱纯化物的薄层色谱鉴别、含量测定、特征图谱等质量标准研究。结果:小檗皮总生物碱提取物的最佳纯化条件为采用HPD100型大孔树脂10 g,树脂柱径高比1∶8,上样液质量浓度11 g·L^-1,上样液体积50 mL,上样流速1 mL·min^-1,加4 BV水洗脱(1 BV=15 mL),加30%乙醇9 BV洗脱;纯化后小檗皮总生物碱的转移率>80%,纯度>65%。建立了小檗皮总生物碱纯化物的质量标准,特征图谱中共有峰有19个,整体相似度均>0.99。结论:优选的纯化工艺稳定可行,建立的质量标准可靠,适用于小檗皮总生物碱提取物的纯化及质量控制。

关键词：小檗皮总生物碱大孔树脂纯化工艺质量标准特征图谱盐酸小檗碱

电子加速器辐照对藏药小檗皮中主要有效成分及灭菌效果的影响

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中南药学 2023年第12期21卷 3192-3197页

作者：吴剑英尼玛次仁张国庆张继稳陈丽华谢和兵安徽中医药大学药学院合肥230012 西藏神猴药业有限责任公司西藏日喀则857000 长三角药物高等研究院江苏南通226000 江苏云视药物科技有限公司江苏南通226000 江西中医药大学南昌330004

目的探究电子加速器辐照对小檗皮粉末和其水提液的灭菌效果及对主要活性成分的影响。方法采用2、4、6、8、10 kGy辐照剂量对小檗皮粉末和水提液进行灭菌,分别比较辐照前后小檗皮粉末和水提液的性状、显微特征、薄层色谱图、微生物水... 详细信息

目的探究电子加速器辐照对小檗皮粉末和其水提液的灭菌效果及对主要活性成分的影响。方法采用2、4、6、8、10 kGy辐照剂量对小檗皮粉末和水提液进行灭菌,分别比较辐照前后小檗皮粉末和水提液的性状、显微特征、薄层色谱图、微生物水平、主要活性成分(盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、木兰花碱)的含量变化和指纹图谱相似度。结果经不同辐照剂量灭菌后,小檗皮粉末和水提液的性状、显微特征、薄层色谱图均未见明显变化,盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、木兰花碱的含量无显著变化(P>0.05),细菌菌落数、霉菌和酵母菌菌落总数显著降低(P小檗皮中的主要有效成分无显著影响,在4 kGy时达到良好的灭菌效果,电子束辐照适用于小檗皮及其提取液的灭菌。

关键词：小檗皮辐照有效成分含量灭菌指纹图谱

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一测多评法测定藏药小檗皮中6种成分的含量

中国新药杂志 2020年第24期29卷 2852-2858页

作者：徐鑫梅武鑫玥易欢李琪赖先荣蒋桂华范刚成都中医药大学药学院成都611137 成都中医药大学民族医药学院成都611137

目的:建立一测多评法同时测定藏药小檗皮中6种成分的含量,并验证方法的可行性。方法:采用高效液相色谱法,以小檗碱为内参物,建立蟾毒色胺内盐、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木兰花碱、药根碱和巴马汀的相对校正因子(fsi),并通过fsi计... 详细信息

目的:建立一测多评法同时测定藏药小檗皮中6种成分的含量,并验证方法的可行性。方法:采用高效液相色谱法,以小檗碱为内参物,建立蟾毒色胺内盐、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木兰花碱、药根碱和巴马汀的相对校正因子(fsi),并通过fsi计算30批小檗皮样品中各成分的含量,同时用外标法测定各成分的含量,比较2种方法的差异,以验证一测多评方法的准确性与可行性。结果:蟾毒色胺内盐、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木兰花碱、药根碱和巴马汀的fsi分别为0.219,0.435,0.531,0.971和0.972。采用一测多评法与外标法得到的30批小檗皮样品各成分含量无显著性差异。结论:建立的一测多评法准确性好,可为藏药小檗皮的质量控制方法提供参考。

关键词：小檗皮一测多评相对校正因子高效液相色谱

藏族药小檗皮中6种成分的含量测定及不同品种比较研究

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中国中药杂志 2019年第5期44卷 968-974页

作者：李琪杜欢文焕松徐僮王毓杰赖先荣范刚成都中医药大学药学院四川成都611137 成都普思生物科技有限公司四川成都610045 成都中医药大学民族医药学院四川成都611137

为明确藏族药小檗皮中的特征成分,该文采用制备液相色谱法对小檗皮水提液中未知成分进行定向分离,利用波谱分析鉴定其结构,结果从中分离得到2个化合物,分别鉴定为蟾毒色胺内盐(Ⅰ)和阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅱ),两者均为首次从小... 详细信息

为明确藏族药小檗皮中的特征成分,该文采用制备液相色谱法对小檗皮水提液中未知成分进行定向分离,利用波谱分析鉴定其结构,结果从中分离得到2个化合物,分别鉴定为蟾毒色胺内盐(Ⅰ)和阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅱ),两者均为首次从小檗皮及小檗属植物中分离得到。此外,成功建立了小檗皮中6种成分的HPLC含量测定方法,并结合化学计量学方法研究了3个品种的化学成分差异,结果药根碱和蟾毒色胺内盐为主要的种间差异成分,与甘肃小檗及鲜黄小檗相比,匙叶小檗含有明显更多的药根碱(P小檗中的蟾毒色胺内盐含量明显比甘肃小檗更高(P小檗皮3个品种的药效差异,该研究结果可为小檗皮药材的质量控制、药效物质基础研究及其开发利用提供参考依据。

关键词：小檗皮蟾毒色胺内盐阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷甘肃小檗鲜黄小檗匙叶小檗

基于HPLC-QqQ-MS研究肠道菌群对藏族药小檗皮5种入血成分的影响

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中国中药杂志 2020年第2期45卷 418-424页

作者：杜欢徐鑫梅徐僮李琪赵程成易欢范刚成都中医药大学药学院四川成都611137 成都中医药大学民族医药学院四川成都611137

为阐明小檗皮中生物碱类成分在生物体内吸收代谢情况,该研究采用HPLC-QqQ-MS技术,以乙腈-0.1%甲酸水为流动相,梯度洗脱,并在多反应监测模式下进行入血成分的定性及定量分析。此外,为探讨肠道菌群对小檗皮生物碱类成分体内代谢的影响,建... 详细信息

为阐明小檗皮中生物碱类成分在生物体内吸收代谢情况,该研究采用HPLC-QqQ-MS技术,以乙腈-0.1%甲酸水为流动相,梯度洗脱,并在多反应监测模式下进行入血成分的定性及定量分析。此外,为探讨肠道菌群对小檗皮生物碱类成分体内代谢的影响,建立糖尿病大鼠与伪无菌糖尿病大鼠模型,结合偏最小二乘法判别分析和单因素方差分析寻找不同组间入血成分的含量差异。该研究首次建立了小檗皮5种入血成分的定量分析方法,发现不同组间小檗皮入血成分存在差异。通过正常组与糖尿病模型组比较,发现在健康和病理2种不同状态下,小檗皮中小檗碱、木兰花碱的吸收代谢能力不同;并且发现伪无菌糖尿病大鼠血清中小檗碱、木兰花碱、药根碱的含量显著低于糖尿病大鼠。研究结果揭示了肠道菌群在小檗皮生物碱类成分体内代谢过程中的重要作用,可为小檗皮的药效物质基础研究提供参考。

关键词：小檗皮糖尿病生物碱 HPLC-QqQ-MS 肠道菌群

小檗皮HPLC指纹图谱建立及不同品种模式识别

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中成药 2021年第1期43卷 264-267页

作者：徐鑫梅易欢赖先荣冯图李琪蒋桂华范刚成都中医药大学药学院四川成都611137 成都中医药大学民族医药学院四川成都611137 贵州工程应用技术学院生态工程学院贵州毕节551700

目的建立小檗皮HPLC指纹图谱,并进行不同品种模式识别。方法小檗皮盐酸-70%甲醇提取物的分析采用WondaSil^■C18-WR色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相乙腈-0.2%磷酸,梯度洗脱;检测波长210 nm。采用SIMCA-P软件,对小檗皮3个主流品种的... 详细信息

目的建立小檗皮HPLC指纹图谱,并进行不同品种模式识别。方法小檗皮盐酸-70%甲醇提取物的分析采用WondaSil^■C18-WR色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相乙腈-0.2%磷酸,梯度洗脱;检测波长210 nm。采用SIMCA-P软件,对小檗皮3个主流品种的共有峰进行模式识别分析。结果15批样品HPLC指纹图谱中有13个共有峰,并鉴定了其中6个,相似度0.779~0.964,模式识别分析能够很好的区分3个基原品种。结论该方法简便、可靠,可用于小檗皮的基原鉴定及质量控制。小檗皮3个品种之间的化学成分存在明显差异。

关键词：小檗皮 HPLC指纹图谱模式识别

基于1H-NMR代谢组学和抗糖尿病活性的小檗皮不同基原品种质量评价研究

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中国中药杂志 2020年第19期45卷 4677-4685页

作者：范刚李琪徐鑫梅杜欢徐僮赖先荣杜蕾蕾成都中医药大学民族医药学院四川成都611137 成都中医药大学药学院四川成都611137

为评价小檗皮4种主流基原品种的质量差异,该研究采用氢核磁共振(1H-NMR)代谢组学技术整体检测小檗皮药材中的初级和次级代谢产物,结合偏最小二乘法判别分析和方差分析筛选种间差异成分。此外,以高脂饲料和链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠... 详细信息

为评价小檗皮4种主流基原品种的质量差异,该研究采用氢核磁共振(1H-NMR)代谢组学技术整体检测小檗皮药材中的初级和次级代谢产物,结合偏最小二乘法判别分析和方差分析筛选种间差异成分。此外,以高脂饲料和链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠动物模型,评价4个品种的抗糖尿病活性差异。结果从小檗皮药材中同时检测并鉴定了包括生物碱类、有机酸类、糖类及氨基酸类在内的16种化合物,并首次发现种间差异标志物(markers)为木兰花碱、药根碱、蟾毒色胺内盐和蔗糖。匙叶小檗和甘肃小檗具有较好的降血糖、改善胰岛素抵抗、提高胰岛素敏感性及抗炎作用,刺红珠有一定的抗糖尿病作用,而鲜黄小檗的抗糖尿病活性较差。从4个差异成分的含量及抗糖尿病活性评价结果可知,不同基原小檗皮药材的质量优劣为:匙叶小檗≈甘肃小檗>刺红珠>鲜黄小檗,该研究结果可为小檗皮药材的品种整理、质量标准建立及开发利用提供参考依据。今后应进一步深入研究匙叶小檗和甘肃小檗的抗糖尿病活性及其作用机制。

关键词：小檗皮质量评价 1H-NMR代谢组学 2型糖尿病多基原