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IL-6对体外培养的牛眼小梁细胞中纤维连接蛋白的影响

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国际眼科杂志 2019年第6期19卷 911-915页

作者：刘攀孟杰刘玉震王强滨州医学院烟台附属医院眼科

目的:探讨不同浓度白细胞介素-6(IL-6)刺激下体外培养的牛眼小梁细胞中纤维连接蛋白的表达变化。方法:采用组织块培养法取新鲜牛眼的小梁网组织,提取并培养第3代牛眼小梁细胞,采用细胞形态学对细胞进行鉴定。经终浓度为0、0.1、0.5、1ng... 详细信息

目的:探讨不同浓度白细胞介素-6(IL-6)刺激下体外培养的牛眼小梁细胞中纤维连接蛋白的表达变化。方法:采用组织块培养法取新鲜牛眼的小梁网组织,提取并培养第3代牛眼小梁细胞,采用细胞形态学对细胞进行鉴定。经终浓度为0、0.1、0.5、1ng/mL的IL-6药物刺激24h后,采用荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测各浓度IL-6刺激下牛眼小梁细胞中FNmRNA和蛋白的表达。结果:培养出的牛眼小梁细胞符合第3代牛眼小梁细胞形态特征。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法显示,不同浓度IL-6刺激下的牛眼小梁细胞所产生的FNmRNA量分别为1.000±0.000、0.213±0.004、0.056±0.001、0.019±0.002,FN蛋白表达量分别为1.167±0.012、0.662±0.009、0.238±0.011、0.061±0.011,均呈下调趋势(rs=-0.713、-0.901,均P小梁细胞在外源性IL-6刺激下影响FNmRNA和蛋白的表达,且IL-6浓度与蛋白表达呈负相关性,推测IL-6可能通过影响FN基因与蛋白的表达,进而改变小梁网组织结构。

关键词：青光眼细胞培养小梁细胞白细胞介素-6 纤维连接蛋白

莱菔硫烷对体外培养牛眼小梁细胞硫氧还蛋白表达的影响及其机制

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中华实验眼科杂志 2016年第6期34卷 504-508页

作者：苏静王强刘玉震滨州医学院临床医学院山东省滨州市256603 滨州医学院附属医院眼科山东省滨州市256600

背景研究证实莱菔硫烷（SFN）可以激活多条通路,促进机体内抗氧化蛋白的表达.硫氧还蛋白（Trx）是维持细胞内氧化还原稳态的重要抗氧化蛋白之一. 目的研究SFN对体外培养的牛眼小梁细胞内Trx表达的影响及其机制.方法体外培养牛眼小梁... 详细信息

背景研究证实莱菔硫烷（SFN）可以激活多条通路,促进机体内抗氧化蛋白的表达.硫氧还蛋白（Trx）是维持细胞内氧化还原稳态的重要抗氧化蛋白之一. 目的研究SFN对体外培养的牛眼小梁细胞内Trx表达的影响及其机制.方法体外培养牛眼小梁细胞并进行形态学观察,取第3代培养的牛眼小梁细胞,分别加入终浓度为0、10、20和30 μmol/L SFN培养30 min,应用实时荧光定量PCR技术检测细胞内Trx mRNA的表达.将细胞按照随机抽样的方法分为6个组,即空白对照组、LY294002组、U0126组、SFN组、LY294002＋ SFN组和U0126＋SFN组.采用Western blot法检测各组细胞中Nrf2蛋白和Trx蛋白的相对表达量.结果体外成功培养牛眼小梁细胞.不同浓度SFN干预下,细胞Trx mRNA相对表达量总体比较差异有统计学意义（F=88.090,P＜0.01）.LY294002＋ SFN组、U0126＋SFN组和SFN组细胞中Trx蛋白和Nrf2蛋白相对表达量显著高于空白对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.LY294002＋ SFN组和U0126＋SFN组细胞中Trx蛋白和Nrf2蛋白相对表达量显著高于SFN组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）. 结论 SFN可通过磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）通路活化Nrf2,促进小梁细胞Trx mRNA及其蛋白的合成,保护细胞抵抗氧化应激损伤.

关键词：莱菔硫烷硫氧还蛋白磷脂酰肌醇-3激酶丝裂原活化蛋白激酶 Nrf2 小梁细胞

牵拉力对人小梁网细胞活性及房水流出调节功能影响的实验研究

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眼科 2019年第3期28卷 186-191页

作者：武珅张敬学刘谦王宁利首都医科大学附属北京同仁医院北京同仁眼科中心北京市眼科研究所眼科学与视觉科学北京市重点实验室

目的观察强机械牵拉力作用下,人小梁网细胞活性及房水流出调节相关基因表达的改变。设计实验研究。研究对象人小梁网细胞。方法依据牵拉力作用时间将原代培养的小梁网细胞分为0 h对照、12 h、24 h三组。采用FLEXCELL力学加载设备对体外... 详细信息

目的观察强机械牵拉力作用下,人小梁网细胞活性及房水流出调节相关基因表达的改变。设计实验研究。研究对象人小梁网细胞。方法依据牵拉力作用时间将原代培养的小梁网细胞分为0 h对照、12 h、24 h三组。采用FLEXCELL力学加载设备对体外培养的人小梁网细胞施加最大延伸比例为22%的机械牵拉力。用流式细胞学的方法检测各组小梁细胞的凋亡比率,采用蛋白印迹法检测细胞存活相关蛋白的表达,用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测与房水流出调节相关的15个基因在牵张力作用下的表达量,并比较实验组与对照组间的差异。主要指标小梁网细胞凋亡率、整合素-Fak信号通路相关分子、房水流出调节相关的15个基因的表达量。结果在牵拉力作用后,对照组、12 h组、24 h组的凋亡率分别为0.71%±0.18%、0.77%±0.19%、0.87%±0.31%(P=0.7298);三组磷酸化Akt蛋白的相对表达量分别为1.00、2.17±0.06、1.69±0.07(P小梁网细胞的活性,增强房水流出调节相关因子的表达,这可能是schlemm管成形术降低眼压的机制之一。

关键词：小梁细胞 Schlemm管成形术基质金属蛋片酶机械牵拉

蒙古族原发性闭角型青光眼患者小梁细胞凋亡的流式细胞学研究

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中华实验眼科杂志 2013年第3期31卷 288-291页

作者：崔巍孔德铭路强云丽娜内蒙古自治区人民医院眼科呼和浩特Ol0017

背景研究表明，蒙古族原发性闭角型青光眼（PACG）的患病率较汉族人群高3．02倍，了解其发病原因及机制对于蒙古族人群PACG的预防和治疗有积极的意义。目的从小梁细胞凋亡的角度探讨蒙古族PACG的发病机制。方法参照中华医学会眼科分会... 详细信息

背景研究表明，蒙古族原发性闭角型青光眼（PACG）的患病率较汉族人群高3．02倍，了解其发病原因及机制对于蒙古族人群PACG的预防和治疗有积极的意义。目的从小梁细胞凋亡的角度探讨蒙古族PACG的发病机制。方法参照中华医学会眼科分会青光眼组1987年制定的诊断标准纳入在内蒙古自治区人民医院眼科接受治疗的蒙古族PACG患者32例32眼及汉族PACG患者40例40眼，另选取因眼外伤需摘除眼球的蒙古族正常人13例13眼及汉族正常人17例17眼作为对照。术前测量受检眼眼压。所有患者均于常规小梁切除手术时取小梁组织，采用annexinv—FITC／PI双标记染色，在FACSalibur型四色流式细胞仪上进行双参数分析，测定坏死、凋亡和正常细胞的百分率。结果蒙古族、汉族PACG组及蒙古族和汉族正常对照组眼压测量值分别为（35．97±7．11）、（38．70±6．82）、（14．69±2．91）和（13．59±2．91）mmHg（1mmHg=0．133kPa），4个组间的总体比较差异有统计学意义（F=106．144，P=0．000），其中蒙古族PACG组和汉族PACG组的眼压均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。蒙古族PACG组、汉族PACG组及蒙古族正常对照组、汉族正常对照组小梁细胞凋亡率分别为（7．14±0．67）％、（5．40．4-0．69）％、（5．86±0．91）％和（2．29±0．65）％，总体差异有统计学意义（F=174．888，P=0．000），其中蒙古族PACG组小梁细胞凋亡率明显高于汉族PACG组和蒙古族正常对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。蒙古族PACG组和汉族PACG组比较、蒙古族正常对照组和汉族正常对照组间小梁细胞的凋亡率比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。小梁细胞凋亡率随着眼压的升高而增加（b=0．990，F=10．209，P=0．009），直线回归方程为＇，=2．788＋0．092X。结论蒙古族PACG人群小梁细胞凋亡率明显高于汉族人群，是否与蒙古族PACG发病率高有关值得进一步研究。

关键词：青光眼原发性闭角型青光眼蒙古族发病机制凋亡小梁细胞流式细胞学

血小板源性生长因子-BB对体外培养的牛眼小梁细胞中基质金属蛋白酶-2表达的影响

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中华实验眼科杂志 2013年第3期31卷 238-242页

作者：王康王强孙大康张磊滨州医学院附属医院眼科 256603

背景目前在青光眼的治疗研究中，血小板源性生长因子-BB（PDGF—BB）作为直接作用于小梁网的药物手术刀正处于研究中，期望药物成分能直接作用于小梁网，在不破坏正常房角生理结构的前提下，疏通小梁网房水流出通道，从而达到降眼压的... 详细信息

背景目前在青光眼的治疗研究中，血小板源性生长因子-BB（PDGF—BB）作为直接作用于小梁网的药物手术刀正处于研究中，期望药物成分能直接作用于小梁网，在不破坏正常房角生理结构的前提下，疏通小梁网房水流出通道，从而达到降眼压的目的。目的探讨PDGF—BB对体外培养的牛眼小梁细胞中基质金属蛋白酶．2（MMP-2）表达的影响及其意义。方法取新鲜牛眼球的小梁组织，以组织块培养法培养小梁细胞，通过形态学观察和神经元特异性烯醇化酶（NSE）染色对培养的细胞进行鉴定。将第3代小梁细胞接种于6孔培养板，在培养基中加入不同质量浓度（0、5．0、12．5、25．0μg／L）的PDGF-BB培养2h，分别采用逆转录PCR（RT—PCR）法和免疫组织化学法观察PDGF—BB对牛眼小梁细胞MMP．2mRNA（相对值）和蛋白在小梁细胞中的表达水平，分析各组培养细胞中阳性信号的吸光度（A）值。结果牛眼小梁组织块培养5～9d时可见细胞游出，第3代小梁细胞可见较多突起，细胞核居中，NSE染色细胞基质中呈绿色荧光。RT—PCR检测结果发现，0、5．0、12．5、25．0Ixg／LPDGF—BB组小梁细胞中MMP-2mRNA／β-actin的A值分别为0．127-＋0．026、0．147-＋0．045、0．178-＋0．053和0．222±0．062，差异有统计学意义（F=56．71，P〈0．05），其中5．0、12．5、25．0μg／LPDGF—BB组小梁细胞中MMP-2mRNA表达量明显高于0μg／LPDGF—BB组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。免疫组织化学检测发现，0、5．0、12．5、25．0μg／LPDGF—BB组小梁细胞中MMP-2蛋白表达量（A值）分别为446．12±13．81、1444．65±54．64、2086．18±73．18和3488．65±25．98，差异有统计学意义（F=213．12，P〈0．01），各组间两两比较，差异均有统计学意义（P〈O．05）。结论在体外培养的条件下，PDGF—BB可促进牛眼小梁细胞中MMP-2的表达，其作用呈剂量依赖的方式。

关键词：小梁细胞血小板源性生长因子-BB 基质金属蛋白酶-2

地塞米松对低渗诱导的人小梁细胞容积敏感性氯电流的影响

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吉林大学学报（医学版） 2014年第6期40卷 1144-1148页

作者：王霁雪刘姝邢晨龙郑雅娟黑龙江省哈尔滨普瑞眼科医院眼科黑龙江哈尔滨150000 吉林大学第二医院眼科吉林长春130041

目的:分析地塞米松对低渗诱导的人小梁细胞容积敏感性氯电流的影响,探讨容积敏感性氯通道(VACC)在激素性青光眼(GIG)发病中的可能机制。方法:人小梁细胞悬液接种于直径35mm塑料培养皿中单层生长,按培养液中是否含地塞米松分组,即正常培... 详细信息

目的:分析地塞米松对低渗诱导的人小梁细胞容积敏感性氯电流的影响,探讨容积敏感性氯通道(VACC)在激素性青光眼(GIG)发病中的可能机制。方法:人小梁细胞悬液接种于直径35mm塑料培养皿中单层生长,按培养液中是否含地塞米松分组,即正常培养液组和地塞米松培养1、3和7d组,共4组,采用全细胞膜片钳技术分别记录4组细胞在低渗状态下的氯电流密度值,比较各组数值的差异。结果:正常培养液组小梁细胞低渗刺激后,在+100和-100 mV电压钳钳制下,外向和内向电流密度值分别为(19.94±0.87)和(-6.53±0.41)pA/pF。地塞米松培养1、3和7d组的小梁细胞低渗刺激后,在+100和-100mV电压钳钳制下,外向和内向电流密度值分别为(19.39±1.40)和(-6.42±0.28)pA/pF、(17.97±2.35)和(-5.82±0.94)pA/pF、(17.16±1.16)和(-5.65±0.43)pA/pF。地塞米松培养1d组小梁细胞较正常培养液组低渗刺激后的外向和内向电流密度值减小,但差异无统计学意义(P>0.05);地塞米松培养3和7d组小梁细胞较正常培养液组小梁细胞低渗刺激后的外向和内向电流密度值明显减小(P小梁细胞容积敏感性氯电流密度值降低,进而影响小梁细胞容积调节,可能是导致GIG房水流出阻力增加的原因之一。

关键词：小梁细胞氯化物通道膜片钳术地塞米松

氯离子通道阻滞剂对人眼小梁细胞增生及凋亡的影响

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中华实验眼科杂志 2012年第1期30卷 12-16页

作者：尹元郑雅娟王霁雪梁巍吉林大学第二医院眼科长春130041

背景氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（NPPB）对家兔心肌细胞缺血-再灌注损伤时的细胞凋亡有促进作用，而小梁细胞上也存在C1C型氯离子通道及容积敏感性氯离子通道，但NPPB究竟会对小梁细胞的形态和功能产生什么影响尚不... 详细信息

背景氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（NPPB）对家兔心肌细胞缺血-再灌注损伤时的细胞凋亡有促进作用，而小梁细胞上也存在C1C型氯离子通道及容积敏感性氯离子通道，但NPPB究竟会对小梁细胞的形态和功能产生什么影响尚不清楚。目的探讨氯离子通道阻滞剂NPPB对人眼小梁细胞增生及细胞周期、细胞凋亡的影响。方法将处于对数生长期的永生株人眼小梁细胞进行培养并以1×10^6个／ml的密度接种于96孔培养板，将不同浓度（10、50、100μmol／L）的NPPB分别加入小梁细胞培养基中，通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组小梁细胞的增生情况以吸光度（A）值表示；采用流式细胞术测定小梁细胞的细胞周期。将100mg／L5-氟尿嘧啶（5-Fu）加入培养的细胞中，而另-组培养的细胞中加入100mg／L5-FU＋100μmol／LNPPB，用AnnexinV—PI法检测各组小梁细胞的凋亡情况；罗丹明123法检测细胞线粒体膜电位（Adam），分别评估各浓度NPPB对培养的人小梁细胞生长和存活的影响。结果3种不同浓度的NPPB与小梁细胞共同孵育48h后4个组小梁细胞的增生率差异有统计学意义（F=7．230，P=0．006），50Izmol／L、100Fxmol／LNPPB作用后小梁细胞的A值明显低于10μmol／LNPPB组，50μmol／LNPPB组、100μmol／LNPPB组与空白对照组比较差异均有统计学意义（t=1．610，P=0．025；t=12．270，P=0．001）。小梁细胞培养基中加入NPPB48h后，G0／G1期的细胞比例增多，S期细胞比例减少，各细胞周期小梁细胞的比例与未加NPPB的组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。用5-FU作用24h及48h后，100mg／L5-Fu组和100mg／L5-FU＋100μmol／LNPPB组的细胞凋亡率均较其各自空白对照组增加（t24h=2．130，P=0．023；t48h=4．810，P=0．011）；100mg／L5-Fu＋100μmol／LNPPB组细胞凋亡率明显高于100mg／L5-Fu组，差异均有统计学意义（t24h=1．980，P=0．037；t48h=1．290，P=0．028），小梁细胞线粒体膜电位降低，差异均有统计学意义（t24h=1．580，P=0．029；F48h=6．200，P=0．015）。结论氯离子通道阻滞剂NPPB可抑制小梁细胞增生，抑制小梁细胞通过G1／S期限制点进入s期；NPPB对5-Fu诱导的小梁细胞凋亡有促进作用，与内源性线粒体凋亡通路相关。

关键词：氯离子通道阻滞剂 5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸小梁细胞凋亡增生

外源性褪黑素在氧化应激条件下对人小梁网细胞（HTMC）纤维连接蛋白（FN）的影响

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外源性褪黑素在氧化应激条件下对人小梁网细胞（HTMC）纤维连接蛋...

作者：于金璐滨州医学院

学位级别：硕士

背景青光眼（Glaucoma）作为常见的后发性视神经疾病,病程进展速度较慢,视网膜神经节细胞（RGC）渐进性丧失,威胁视力,造成视力损害后无法治愈,是全球失明的主要原因。在不同类型的青光眼中,原发性开角型青光眼约占所有青光眼病例的74%... 详细信息

背景青光眼（Glaucoma）作为常见的后发性视神经疾病,病程进展速度较慢,视网膜神经节细胞（RGC）渐进性丧失,威胁视力,造成视力损害后无法治愈,是全球失明的主要原因。在不同类型的青光眼中,原发性开角型青光眼约占所有青光眼病例的74%。小梁网过度氧化应激（Oxidative stress,OS）是青光眼重要致病原因这一观点被越来越多人认可。在原发性开角型青光眼（Primary open angle glaucoma,POAG）患者眼部褪黑素（Melatonin,MLT）含量较正常人偏低,而此种变化对氧化应激造成的青光眼小梁网中细胞外基质蛋白产生了何种影响并无报道。本文就褪黑素对小梁细胞的影响探讨其对青光眼致病机理的作用。目的观察不同浓度下H2O2对细胞活力的影响,选择合适的H2O2浓度,构造氧化应激模型。探讨不同浓度的外源性褪黑素是否对氧化应激状态下人眼小梁网细胞（Human trabecular meshwork cells,HTMC）中纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）产生影响。方法用不同浓度 H2O2（0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L）干预HTMC 24h,构建合适的氧化应激体外模型。CCK-8法检测其对HTMC活力的影响,从而确定后续实验所需合适的H2O2浓度。将细胞分成5组:A组正常细胞组、B 组 H2O2 组、实验组 H2O2+MLT（C 组 H2O2+200 μmol/L,MLT、D 组 H2O2+500 μmol/L MLT、E 组 H2O2+800 μmol/L MLT）和 F 组正常细胞组+500 μmol/L MLT,以上各组分别加入H2O2和（或）不同浓度MLT后继续培养24h。实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）监测各组细胞FN mRNA的表达,免疫荧光法（immunofluorescence,IF）检测FN蛋白的相对荧光量。运用单因素方差分析以及LSD-t检验统计学方法处理数据。结果H2O2对HTMC造成氧化应激损伤,使细胞外基质FN的表达增高。RT-PCR法显示,各组FN mRNA的相对表达量分别为1.129±0.036、4.700±0.027、2.337±0.016、2.313 ± 0.037、2.282±0.063、1.193±0.032,存在统计学意义（F=3507.99,P=0.00＜0.05）。H2O2组与正常细胞组、实验C、D、E组两两比较,FN表达量明显增高,有统计学差异（P＜0.05）。实验C、D、E组与H2O2组两两相比,FN表达量明显降低,有统计学差异（P＜0.05）。实验C、D、E组两两比较,FN表达无显著变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。F组与正常细胞组比较,FN表达无显著变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论氧化应激条件可促进HIMC FN表达增加。褪黑素可抑制化应激对小梁网的损伤,并使纤连蛋白的表达减少,但仍高于正常细胞。褪黑素对正常细胞FN表达量无明显影响。褪黑素通过影响FN基因和蛋白表达使小梁细胞结构、功能改变,进而对POAG的氧化应激发病机制具有保护的作用。

关键词：褪黑素氧化应激纤维连接蛋白小梁细胞青光眼

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糖皮质激素性青光眼小梁细胞超微结构的改变

Eye Science 2010年第2期25卷 119-124页

作者：赵静张琦辽宁医学院附属第一医院眼科锦州121000

目的:制作兔糖皮质激素性青光眼动物模型,观察小梁细胞超微结构的改变,探讨激素性青光眼房水排出阻力增加的机制。方法:40只新西兰大白兔,随机分为4组,正常对照组(10只)、单独滴地塞米松组(10只)、单独注射曲安奈德组(10只)和联合用药组... 详细信息

目的:制作兔糖皮质激素性青光眼动物模型,观察小梁细胞超微结构的改变,探讨激素性青光眼房水排出阻力增加的机制。方法:40只新西兰大白兔,随机分为4组,正常对照组(10只)、单独滴地塞米松组(10只)、单独注射曲安奈德组(10只)和联合用药组(10只)。实验前连续3天于每日8、10和12am用Schitoz's眼压计测量眼压后取平均值,最后取得兔基础眼压值。实验正式开始后,正常对照组用无菌生理盐水滴兔双眼,每日3次;单独滴地塞米松组用0.5%地塞米松磷酸钠溶液滴兔双眼,每日3次,持续8周;单独注射曲安奈得组每周球结膜下注射曲安耐得1次(3mg),持续8周;联合用药组用0.5%地塞米松磷酸钠溶液滴兔双眼,每日3次,持续8周,每周球结膜下注射曲安奈得1次(3mg)。用药开始后,第4天开始每7日用Schitoz's眼压计监测一日4组眼压(分别于8、10和12am测一次眼压后取平均值),将眼内压≥21.975mmHg(1mmHg=0.133kPa)并持续1周者纳入诱发成功模型。8周后取四组兔双眼标本,做成电镜超薄切片用于电镜研究。结果:1.兔基础眼压为(18.082±2.398)mmHg(n=80),联合用药组兔2～3周眼压开始升高,第3周时升高到(24.065±1.245)mmHg,P小梁细胞核异形性增大,细胞间质微丝微管结构增多,胞浆空泡变性,粗面内质网扩张,以及细胞间无定形物质增多。结论:1.联合用药组成功地建立了兔糖皮质激素性高眼压模型,其余3组未能成功建立兔糖皮质激素性高眼压模型。2.电镜下观察到的细胞骨架所发生一系列改变,是糖皮质激素诱导眼压升高的重要环节。

关键词：糖皮质激素青光眼小梁细胞超微结构