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甜椒细胞质小分子量热激蛋白基因(CaHSP18)的cDNA克隆与表达

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植物生理与分子生物学学报 2005年第4期31卷 409-416页

作者：郭尚敬陈娜郭鹏孟庆伟山东农业大学生命科学学院

用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的甜椒叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长779bp的cDNA基因序列,包含一个480bp开放阅读框,编码159个氨基酸。Southern杂交结果表明在甜椒基因组中有该基因的小的多基因家族。North... 详细信息

用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的甜椒叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长779bp的cDNA基因序列,包含一个480bp开放阅读框,编码159个氨基酸。Southern杂交结果表明在甜椒基因组中有该基因的小的多基因家族。Northern结果显示该基因在甜椒根、茎、叶中的表达受热激和低温的诱导。原核表达分析表明该基因在高温以及低温条件下可以提高大肠杆菌的生存能力。

关键词：甜椒小分子量热激蛋白基因克隆基因表达

茶树小分子量热激蛋白基因CsHSP17.2的克隆与表达分析

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南京农业大学学报 2015年第3期38卷 389-394页

作者：王明乐朱旭君王伟东王炫清林明露黎星辉南京农业大学茶叶科学研究所江苏南京210095

[目的]进一步了解茶树小分子量热激蛋白基因Cs HSP17.2在逆境胁迫条件下的分子生物学功能。[方法]利用RT-PCR技术从茶树‘迎霜’中克隆得到Cs HSP17.2基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码蛋白,通过Real-time PCR分析其表达模式。... 详细信息

[目的]进一步了解茶树小分子量热激蛋白基因Cs HSP17.2在逆境胁迫条件下的分子生物学功能。[方法]利用RT-PCR技术从茶树‘迎霜’中克隆得到Cs HSP17.2基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码蛋白,通过Real-time PCR分析其表达模式。[结果]该基因开放阅读框长度为453 bp,编码150个氨基酸,蛋白质相对分子质量为17.2×103,理论等电点5.56;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;被定位于细胞质中。系统发育树分析表明,茶树Cs HSP17.2与水稻(Gen Bank登录号:P27777)和花生(ABC41131)的进化关系较近,属于小分子量热激蛋白基因家族第Ⅰ亚族。qRT-PCR分析发现,茶树Cs HSP17.2属于组成型基因;高温(38℃)处理1 h能显著提高Cs HSP17.2 mRNA的相对表达量(P小分子量热激蛋白基因Cs HSP17.2,其在花中表达量最高,且响应高温、干旱、高盐和外源脱落酸胁迫。

关键词：茶小分子量热激蛋白 CsHSP17.2 克隆差异表达实时荧光定量PCR

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昆虫小分子量热激蛋白的研究进展

应用昆虫学报 2015年第6期52卷 1326-1332页

作者：陆明星徐静杜予州扬州大学园艺与植物保护学院扬州大学应用昆虫研究所扬州大学扬州225009

昆虫小分子量热激蛋白（Smallheatshockproteins，sHSPs）是最早被发现的热激蛋白，但是有关它们的研究相对较少。本文对昆虫小分子量热激蛋白的最新研究成果进行了总结，旨在引起人们对该类蛋白的关注，以便进一步研究其功能，探讨其... 详细信息

昆虫小分子量热激蛋白（Smallheatshockproteins，sHSPs）是最早被发现的热激蛋白，但是有关它们的研究相对较少。本文对昆虫小分子量热激蛋白的最新研究成果进行了总结，旨在引起人们对该类蛋白的关注，以便进一步研究其功能，探讨其可能的应用前景。目前研究表明：昆虫小分子量热激蛋白是其所有热激白中最不保守的家族。同时，它们通常拥有一个a-晶状体结构域；分子量范围一般在12-43ku；具有分子伴侣的活性。每种昆虫体内拥有多种sHSPs，而且其功能也各不相同。这些热激蛋白在昆虫的生长发育、生殖以及滞育等重要生命活动中起着重要的作用；同时在抵御不良环境以及适应性进化中也具有重要意义。随着研究的深入，还将会有更多的昆虫sHSPs被鉴定，它们更多的功能也将被逐渐发掘。

关键词：昆虫小分子量热激蛋白生长发育温度胁迫滞育

叶绿体小分子量热激蛋白与植物光系统保护研究进展

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河南农业科学 2012年第10期41卷 10-13页

作者：郭尚敬冀芦沙聊城大学山东聊城252059

对叶绿体小分子量热激蛋白的研究进行了简要的回顾和总结。详细介绍了植物遇到冷、热胁迫时,叶绿体小分子量热激蛋白对光合系统的保护;初步分析了叶绿体小分子量热激蛋白与植物的耐热性和耐冷性关系及其潜在的作用方式。

关键词：叶绿体小分子量热激蛋白植物光系统保护

西花蓟马小分子量热激蛋白的克隆及温湿胁迫下的功能分析

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西花蓟马小分子量热激蛋白的克隆及温湿胁迫下的功能分析

作者：袁嘉雯扬州大学

学位级别：硕士

西花蓟马Frankliniella occidentalis是一种广泛分布且适应性极强的园艺害虫,目前已传播到许多国家,对农业生产构成严重威胁。西花蓟马环境适应性强,可以在不同栖息地的多种植物上生长发育和繁殖,并造成严重危害。为研究温度和湿度对西... 详细信息

西花蓟马Frankliniella occidentalis是一种广泛分布且适应性极强的园艺害虫,目前已传播到许多国家,对农业生产构成严重威胁。西花蓟马环境适应性强,可以在不同栖息地的多种植物上生长发育和繁殖,并造成严重危害。为研究温度和湿度对西花蓟马种群发展与环境适应性的关系,本研究对长期恒温饲养的西花蓟马种群进行不同高低温和湿度处理,并与前人的相关研究数据进行比较分析;从温度胁迫后的西花蓟马转录组中获得两条小分子量热激蛋白基因片段进行分子克隆,并对其在不同温湿度条件下的表达模式进行分析;同时,通过RNAi技术干扰西花蓟马体内两条小分子量热激蛋白的表达后,对其存活率、温度耐受性和湿度耐受性的相关数据进行统计及分析,并对相应基因的干扰效率进行了定量检测。主要研究结果如下:1.不同性别和龄期的西花蓟马在不同高/低温及不同湿度下的存活率试验结果表明,所有发育阶段和性别的西花蓟马在温度从41℃升到42℃以及从-15℃降至-16℃时,其存活率都降为0,说明西花蓟马存活的高温阈值约为41℃～42℃,低温阈值约为-15℃～-16℃,高温下的结果与前人的研究数据(41℃)相似,但低温下限比前人研究的-14℃扩大了 1～2℃;湿度相关研究结果显示,西花蓟马有一定的抗干旱能力,同时能适应甚至是偏好高湿度气候,其成虫在RH=100%的高湿度环境下48h后的存活率高达75%;此外,蛹比成虫表现出了更强的耐干旱能力,在RH=0%的极端干燥条件下暴露48h后仍然有20%左右个体存活并顺利羽化。2.基于温度胁迫后的西花蓟马转录组克隆得到两条西花蓟马小分子量热激蛋白基因全长序列,并分别命名为FoHSP11.6和FoHSP28.0,GenB ank登录号分别为OK310493和OK310494。这两条序列全长分别为806和1,041 bp,开放阅读框分别为330和768bp,编码110和256个氨基酸。多序列比对分析发现,FoHSP11.6和FoHSP28.0与其它昆虫的sHSP具有较高的相似性。系统进化树分析表明,两条FoHSPs被分属于不同的两支,其中FoHSP28.0与同为缨翅目的棕榈蓟马聚为一支。通过比对基因组序列和cDNA序列发现,两条FoHSPs均没有内含子。3.在获得两条西花蓟马小分子量热激蛋白全长序列的基础上,通过实时荧光定量检测的方法,对不同暴露温度、在不同温度暴露时间、不同湿度胁迫、不同发育阶段和性别下两条FoHSPs的表达模式进行了研究和分析。结果表明,FoHSP11.6在成虫和蛹中均能受到极端高温和低温胁迫的诱导表达,而FoHSP28.0在成虫和二龄若虫体内均有被温度胁迫诱导表达的现象。FoHSP11.6和FoHSP28.0在响应温度胁迫时的表达模式存在差异,FoHSP11.6在极端温度胁迫下被强烈诱导,而FoHSP28.0则是在相对温和温度胁迫下过度表达。FoHSP11.6和FoHSP28.0的时间表达模式相似,表达量均在0.5/1h的处理后达到峰值,然后下降。FoHSP11.6和FoHSP28.0在蛹中的表达水平在相对湿度较低(0-25%)时增加,当湿度接近生长的最佳水平时减少。FoHSP11.6在西花蓟马成虫中表达量较高,FoHSP28.0在蛹和成虫中表达量较高,此外,研究还发现FoHSP11.6和FoHSP28.0在雄成虫中表达显著高于雌成虫。4.采用饲喂法导入dsRNA,并选用成虫作为RNAi的试验材料,研究了干扰样本中的FoHSPs后对西花蓟马存活率、温度耐受性和湿度耐受性的影响,并对相应基因的干扰效率进行了定量检测。FoHSP11.6和FoHSP28.0的效率检测结果表明本研究中沉默效率能达40%～60%。在摄入含有目的基因dsRNA的蔗糖溶液后,西花蓟马成虫的存活率与对照相比显著下降。与dsGFP和CK相比,摄入dsFoHSP11.6和dsFoHSP28.0的西花蓟马经过高低温胁迫后,存活率降低。但在不同湿度下,沉默FoHSPs的表达对西花蓟马的耐干旱能力几乎无影响。本研究明确了目前西花蓟马种群能耐受的温度上下限,完善了湿度因素对西花蓟马的影响的基础数据,探明了西花蓟马小分子量热激蛋白基因响应温、湿度胁迫的表达模式,同时构建了西花蓟马RNAi干扰体系,并对研究中涉及的两个小分子量热激蛋白基因的功能进行了分析,为未来西花蓟马生态适应性基础数据库的建立,及西花蓟马种群爆发机制的研究和潜在适生区的预测提供了基础数据。

关键词：西花蓟马温湿胁迫小分子量热激蛋白表达模式分析 RNAi

褐飞虱小分子量热激蛋白基因序列特征及其功能研究

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褐飞虱小分子量热激蛋白基因序列特征及其功能研究

作者：潘磊南京农业大学

学位级别：硕士

褐飞虱是我国主要水稻害虫之一,温度是影响其种群发展和越冬边界的重要因素。小分子量热激蛋白（sHSPs）是生物体中普遍存在的一种蛋白,在昆虫生长发育、胁迫应激保护等生理过程中具有重要作用。为了明确褐飞虱对温度胁迫的适应机制,本... 详细信息

褐飞虱是我国主要水稻害虫之一,温度是影响其种群发展和越冬边界的重要因素。小分子量热激蛋白（sHSPs）是生物体中普遍存在的一种蛋白,在昆虫生长发育、胁迫应激保护等生理过程中具有重要作用。为了明确褐飞虱对温度胁迫的适应机制,本文探索了其小分子量热激蛋白基因家族的组成、序列特征、时空表达特性、诱导表达特性以及功能,主要研究结果如下:一、褐飞虱sHsps序列特征分析根据基因同源性采用离线BLAST从转录组数据库中筛选出6个褐飞虱小分子量热激蛋白基因,然后利用NCBI ORF Finder在线工具查找这些基因的开放阅读框,发现其ORF长度为531-735bp,理论等电点为5.01-7.74,分子量为20.9-28.7kD。Pfam发现这些基因均含有HSP20保守结构域PF00011。序列比对发现褐飞虱小分子量热激蛋白基因彼此间碱基序列和氨基酸序列一致性较低。二、褐飞虱sHsps的时空表达特性采用实时荧光定量PCR技术分别检测了褐飞虱不同龄期、不同器官sHsps的相对表达量。结果表明,褐飞虱小分子量热激蛋白基因具有龄期和器官表达特异性。NlHsp28.7在3龄若虫中的表达量最高,NlHsp20.9和NlHsp21.6在5龄若虫中的表达量最高,NlHsp21.9和NlHsp23.1在雌成虫中的表达量最高,而NlHsp22.4在雄成虫中表达量最高。对成虫而言,NlHsp21.6、NlHsp21.9、NlHsp23.1、NlHsp28.7 在消化道表达量较高;NlHsp21.9和NlHsp23.1在雌虫卵巢也具有较高的表达量;NlHsp20.9和NlHsp22.4在头部具有较高的表达量。褐飞虱小分子量热激蛋白的这种发育时期和器官表达特异性说明这些基因可能在褐飞虱生长发育或器官功能行使中起重要作用。三、褐飞虱sHsps的温度诱导表达特性采用实时荧光定量PCR技术分别检测了不同温度或者同一温度不同孵育时间处理后褐飞虱sHsps的相对表达量。结果表明,褐飞虱小分子量热激蛋白基因的表达受温度和处理时间的影响。高温热激后雌成虫NlHsp21.6、NlHsp21.9、NlHsp23.1等基因的诱导表达峰值出现在42℃,3龄若虫出现在44℃,但MlHsp28.7的诱导表达峰值都出现在33℃。39℃热激处理褐飞虱雌成虫,NlHsp23.1的最佳诱导时间为1h,而NlHsp21.6为2h。在低温处理后,褐飞虱小分子量热激蛋白基因转录水平与龄期有关,在雌成虫均下降或无显著变化,14℃处理褐飞虱雌成虫不同时间后,除NlHsp21.6在24小时后略微上调外,其余基因均表现出下调的趋势。但3龄若虫中NlHsp21.9、NlHsp23.1、NlHsp21.6在0℃处理后表达量显著上升。这些结果说明褐飞虱小分子量热激蛋白可能具有功能分化,不同的基因对应不同的胁迫因子或程度。四、褐飞虱sHSPs功能研究采用原核表达和RNAi分别研究了褐飞虱小分子量热激蛋白的功能。聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot检测目标蛋白在转化的大肠杆菌上清和沉淀中表达,重组BL21（DE3）在高温热激后存活率显著上升,但随着热激时间延长,BL21（DE3）的存活率不同程度下降;RNAi抑制褐飞虱小分子量热激蛋白表达后,褐飞虱对高温抗逆性下降。这些结果说明褐飞虱小分子量热激蛋白对高温胁迫具有显著的保护作用,但是如果胁迫持续时间过长,小分子量热激蛋白不能完全消除高温的影响。

关键词：褐飞虱小分子量热激蛋白表达特异性功能

热休克转录因子对水稻二化螟小分子量热激蛋白的调控研究

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热休克转录因子对水稻二化螟小分子量热激蛋白的调控研究

作者：宋杰扬州大学

学位级别：硕士

水稻二化螟 Chilo suppressalis（Walker）属鳞翅目 Lepidoptera、螟蛾科 Pyralidae,是一种在我国从南到北广泛分布的重要钻蛀性害虫,严重危害水稻的安全生产。近年来在全球气候变暖的大背景下,水稻二化螟在我国一些水稻种植区有逐年加... 详细信息

水稻二化螟 Chilo suppressalis（Walker）属鳞翅目 Lepidoptera、螟蛾科 Pyralidae,是一种在我国从南到北广泛分布的重要钻蛀性害虫,严重危害水稻的安全生产。近年来在全球气候变暖的大背景下,水稻二化螟在我国一些水稻种植区有逐年加重为害的趋势。而之前我们的研究发现,水稻二化螟具有很强的温度耐受能力。因此,水稻二化螟温度耐受性机制的研究将从另一个侧面揭示其爆发成灾原因。目前对于水稻二化螟温度耐受性分子机制的研究主要集中在热激蛋白方面,但是水稻二化螟应对温度胁迫的机制仍然不清楚。因此,本研究从水稻二化螟的热休克转录因子蛋白和小分子量热激蛋白的调节机制出发,进一步揭示水稻二化螟温度耐受性的分子机制。主要研究结果如下:1.根据水稻二化螟的转录组数据,分离并克隆得到1种水稻二化螟热休克转录因子蛋白（HSF）和2种小分子量热激蛋白（sHSPs）基因的cDNA全长序列,分别命名为Cshsf,Cshsp22.9a和Cshsp23.9a。这三条基因全长分别为1532、838和840 bp,它们的开放阅读框长度分别为1014、603和627bp,分别编码337、200和208个氨基酸。基因组验证发现这三个基因均不含有内含子。CsHSF存在DBD、HR-A/B、HR-C和CTAD结构域,而CsHSP22.9a和CsHSP23.9a均拥有sHSPs家族特异性特征-α晶状体结构域。分子系统进化树分析发现:CsHSF与其他鳞翅目昆虫的HSF1亲缘性较低,表明CsHSF不属于常规的HSF1亚家族。CsHSP22.9a和CsHSP23.9a则与其他水稻二化螟的sHSPs聚为一支,表明它们具有较高的同源性。2.利用RT-qPCR技术分析了Cshsf,Cshsp22.9a和Cshsp23.9a的表达模式。结果发现:Cshsf在低温下抑制表达,在高温下随着温度的升高相对表达量先上升后下降;同时,Cshsp22.9a和Cshsp23.9a拥有相似的表达模式,都能够被高低温诱导表达,且在-11和42℃下相对表达水平最高。在42℃持续高温胁迫下,Cshsf的相对表达量从4 h开始显著上调表达,6 h后表达量最高,而Cshsp22.9a和Cshsp23.9a表现为持续地上调表达,表明这三种蛋白质的表达与温度有着密切的联系。3.利用pTYB12载体构建CsHSF重组蛋白原核表达质粒,利用Western Blot检测到重组蛋白CsHSF的存在。使用亲和几丁质结合标签介导的内含肽纯化系统体外大量分离纯化重组蛋白CsHSF,利用超滤膜浓缩后得到重组蛋白浓度为3.120mg/ml。利用GenomeWalker法分别扩增得到 Cshsp22.9a和Cshsp23.9a长度为-392-+47bp和-599-+28bp的启动子序列,利用JASPAR在线工具分析序列发现在Cshsp22.9a和Cshsp23.9a启动子序列中分别存在3个和1个HSEs。最后利用凝胶迁移实验EMSA验证CsHSF与Cshsp22.9a和Cshsp23.9a启动子序列的体外结合情况,综合分析显示,CsHSF均能够与Cshsp22.9a和Cshsp23.9a的启动子序列结合。4.利用RNAi技术成功沉默了水稻二化螟Cshsf基因的表达,同时检测了干扰Cshsf后Cshsp22.9a和Cshsp23.9a在适温（27℃）和高温胁迫（42℃）下的表达情况。结果显示:在27℃和42℃下,Cshsf表达量的沉默效率分别为77.42%和63.42%。干扰Cshsf后,Cshsp22.9a在27℃条件下的相对表达量显著上调,Cshsp23.9a的表达量无显著变化,而在高温胁迫下,Cshsp22.9a的表达与对照相比没有显著差异,Cshsp23.9a的表达水平却显著下调。此外,还发现干扰后的水稻二化螟在高温下的存活率显著低于对照组,为63.3%。结果表明,Cshsf与水稻二化螟的温度耐受性有关,同时CsHSF功能的缺失会对Cshsps的表达产生显著的影响。

关键词：水稻二化螟热休克转录因子小分子量热激蛋白温度表达模式调控

四纹豆象小分子量热激蛋白基因的鉴定与表达分析

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江汉大学学报（自然科学版） 2016年第6期44卷 490-495页

作者：刘琴陈伟达高志鹏张雨辰陈禅友江汉大学生命科学学院湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心湖北武汉430056

本研究利用生物信息学方法对NCBI数据库中四纹豆象(Callosobruchus maculatus)全部热激蛋白进行分析,从中鉴定出一种中央区具有典型α-晶体蛋白质结构域的小分子量热激蛋白基因,shsp27(Gen Bank编号FK669241.1)。采用实时荧光定量PCR(RT... 详细信息

本研究利用生物信息学方法对NCBI数据库中四纹豆象(Callosobruchus maculatus)全部热激蛋白进行分析,从中鉴定出一种中央区具有典型α-晶体蛋白质结构域的小分子量热激蛋白基因,shsp27(Gen Bank编号FK669241.1)。采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测了四纹豆象4龄幼虫经不同温度(4、15、30、37℃以及4℃低温处理24 h后回复30℃)胁迫处理24 h后,shsp27 m RNA的相对表达量。分析结果表明,在4龄四纹豆象幼虫中,低温(4、15℃)与高温(37℃)胁迫处理后shsp27的相对表达量相对于对照组(30℃恒温培养组)均有上调响应,但对高温胁迫的响应程度略强,低温回复处理组的相对表达量也略高于对照组,但上升不显著,初步认为shsp27基因表达与四纹豆象耐寒热的适应性无直接相关性。

关键词：四纹豆象小分子量热激蛋白温度胁迫 mRNA相对表达量实时荧光定量PCR

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

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北京林业大学学报 2009年第1期31卷 106-112页

作者：杨娟戴伟民强胜南京农业大学杂草研究室

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中... 详细信息

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。

关键词：紫茎泽兰小分子量热激蛋白基因克隆基因表达