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小亚璃眼蜱4D8基因的克隆与原核表达

中国兽医科学 2008年第6期38卷 461-464页

作者：赵金国曾巧英殷宏刘爱红李有全罗建勋甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

根据GenBank上登录的边缘革蜱4D8基因序列设计1对引物,采用PCR技术自半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺cDNA表达文库中扩增获得了4D8基因;将其连入pMD18-T载体,构建重组克隆载体pMD18-Hyaa4D8。测序分析表明,克隆的小亚璃眼蜱4D8基因与边... 详细信息

根据GenBank上登录的边缘革蜱4D8基因序列设计1对引物,采用PCR技术自半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺cDNA表达文库中扩增获得了4D8基因;将其连入pMD18-T载体,构建重组克隆载体pMD18-Hyaa4D8。测序分析表明,克隆的小亚璃眼蜱4D8基因与边缘革蜱4D8基因的核苷酸序列的同源性为89.2%。将此片段定向亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Hyaa4D8,表达并纯化重组蛋白,通过免疫印迹试验鉴定该重组蛋白的生物学活性。结果显示,该重组蛋白是分子质量为45ku的融合蛋白,且表达产物能被半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺抗原免疫兔血清识别。

关键词：小亚璃眼蜱 4D8基因克隆原核表达

小亚璃眼蜱4D8基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性分析

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中国兽医科学 2011年第4期41卷 375-379页

作者：赵金国刘爱红殷宏罗建勋天水市动物疫病预防控制中心甘肃天水741000 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

为进行抗小亚璃眼蜱疫苗的研究,采用PCR方法从重组质粒pGEM-T-pHyaa4D8中克隆了pHyaa4D8分子的基因片段,构建了真核融合表达载体pPIC9K-pHyaa4D8,在毕赤酵母中进行表达,并对重组酵母菌的发酵条件进行了优化。结果表明,表达出约19ku的目... 详细信息

为进行抗小亚璃眼蜱疫苗的研究,采用PCR方法从重组质粒pGEM-T-pHyaa4D8中克隆了pHyaa4D8分子的基因片段,构建了真核融合表达载体pPIC9K-pHyaa4D8,在毕赤酵母中进行表达,并对重组酵母菌的发酵条件进行了优化。结果表明,表达出约19ku的目的蛋白,诱导表达的最佳时间是72h。Western-blot分析结果显示,表达产物能被半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺抗原免疫兔血清识别,在19ku左右出现目的条带,说明表达的目的蛋白具有反应活性。

关键词：小亚璃眼蜱 4D8基因片段真核表达毕赤酵母

小亚璃眼蜱对牛巴贝斯虫未定种和环形泰勒虫传播的试验研究

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畜牧兽医学报 2005年第11期36卷 1197-1201页

作者：罗建勋殷宏关贵全马米玲孙彩琴鲁炳义白启吕文顺陈溥言中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046 南京农业大学动物医学院南京210095

利用蜱传播试验确定小亚璃眼蜱对中国新分离的牛的巴贝斯虫未定种和环形泰勒虫的传播能力与传播方式,进而明确其在中国牛梨形虫病传播中的流行病学意义。试验结果表明:小亚璃眼蜱可在雌虫阶段受到巴贝斯虫未定种的感染,并可在次代若虫(2... 详细信息

利用蜱传播试验确定小亚璃眼蜱对中国新分离的牛的巴贝斯虫未定种和环形泰勒虫的传播能力与传播方式,进而明确其在中国牛梨形虫病传播中的流行病学意义。试验结果表明:小亚璃眼蜱可在雌虫阶段受到巴贝斯虫未定种的感染,并可在次代若虫(2/2)和成虫(3/3)阶段将病原传播给试验牛;小亚璃眼蜱幼虫和若虫吸入环形泰勒虫,饱血脱落的幼虫和若虫所蜕化发育的饥饿若虫(2/2)和成虫(2/2)均可将病原传递给敏感动物;感染巴贝斯虫未定种的小亚璃眼蜱饱血雌虫所孵育出的次代幼虫和若虫仍可被环形泰勒虫感染,所发育出的若虫(2/2)和成虫(2/2)可在一次传播试验中将环形泰勒虫和巴贝斯虫未定种同时传播给试验动物。

关键词：小亚璃眼蜱巴贝斯虫未定种环形泰勒虫传播试验

小亚璃眼蜱和亚洲璃眼蜱对环形泰勒虫传播能力的研究

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中国兽医科技 2003年第2期33卷 22-23页

作者：罗建勋殷宏关贵全马米玲张其才吕文顺中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃兰州730046

将实验室培养的小亚璃眼蜱 (Hyalommaanatolicumanatolicum )和亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticumasiaticum)清洁幼虫和若虫饲喂于感染环形泰勒虫的牛体 ,收集饱血幼虫和若虫 ,用所孵化的若虫和成虫感染试验牛。结果显示 ,小亚璃眼蜱幼虫、... 详细信息

将实验室培养的小亚璃眼蜱 (Hyalommaanatolicumanatolicum )和亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticumasiaticum)清洁幼虫和若虫饲喂于感染环形泰勒虫的牛体 ,收集饱血幼虫和若虫 ,用所孵化的若虫和成虫感染试验牛。结果显示 ,小亚璃眼蜱幼虫、若虫阶段感染 ,所发育之若虫、成虫均可传播环形泰勒虫 ;而亚洲璃眼蜱各阶段的传播试验结果均为阴性。

关键词：传播能力小亚璃眼蜱亚洲璃眼蜱环形泰勒虫传播媒介牛

小亚璃眼蜱FER1基因的克隆表达及抗蜱效果

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中国兽医学报 2023年第7期43卷 1424-1433页

作者：何文文伍军刘燕李才善甘露郑会珍史倩云呼尔查巴音查汗新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 新疆农业大学兽医学博士后流动站新疆乌鲁木齐830052

为挖掘抗蜱候选疫苗抗原,对蜱虫进行安全有效的防控。本研究旨在对小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)铁蛋白1(*** ferritin1,HanFER1)基因进行生物信息学预测及分析,使用克隆技术和原核表达系统表达HanFER1,通过镍柱纯化法获... 详细信息

为挖掘抗蜱候选疫苗抗原,对蜱虫进行安全有效的防控。本研究旨在对小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)铁蛋白1(*** ferritin1,HanFER1)基因进行生物信息学预测及分析,使用克隆技术和原核表达系统表达HanFER1,通过镍柱纯化法获取高纯度HanFER1,并对其进行模式动物免疫抗蜱试验。提取小亚璃眼蜱总RNA并反转录为cDNA,构建克隆载体pMD19-T-FER1和系统进化树,通过生物信息学分析其B细胞抗原性表位、跨膜区结构、亲疏水性、蛋白理化特性、信号肽和亚细胞定位;构建表达载体pET-28a-FER1,用His-Bind亲和层析柱获得纯化蛋白;使用rHanFER1免疫家兔,制备多克隆抗体,Western blot检测其免疫原性,用ELISA检测其抗体效价,待抗体效价升高后开展攻蜱试验。本试验中的小亚璃眼蜱FER1氨基酸序列与印度的小亚璃眼蜱(序列号:AFQ98383.1)为一支,且亲缘关系最近,相似达到约99%。B细胞线性抗原表位显示有较好的抗原性,该基因编码172个氨基酸,分子式为C_(878)H_(1 357)N_(237)O_(275)S_(9),相对分子质量为19.92 ku。理论等电点(pI)为5.13,为酸性蛋白;HanFER1蛋白无跨膜区信号肽;抗原性很高,为亲水性蛋白,并且HanFER1主要存在于细胞质(56.5%),其余分布在细胞核(26.1%)、线粒体(13.0%)。使用克隆技术克隆出了HanFER1基因片段长度为509 bp,成功构建了原核表达载体pET-28a-Ha-FER1,并经His-Bind镍柱亲和层析获得纯化HanFER1蛋白,FER1蛋白大小为25 ku,并且蛋白在浓度为0.8 mmol/L、最适温度为37℃的条件下诱导7 h左右表达量最高。Western blot结果显示该蛋白具有一定的免疫原性。ELISA结果显示rHanFER1免疫家兔的抗体效价为1∶12 800,rHanFER1蛋白免疫后总的抗蜱效果为73.43%,对小亚璃眼蜱的平均饱血蜱重、平均卵重及平均卵孵化率的抑制率分别为11.7%,23.0%和55.0%。本研究通过生物信息学分析、重组蛋白表达、血清学试验及抗蜱试验,发现HanFER1具有抗蜱疫苗候选抗原潜力,为HanFER1的功能研究奠定了基础。

关键词：小亚璃眼蜱 FER1蛋白原核表达生物信息学分析多克隆抗体的制备抗蜱效果评价

小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定

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中国畜牧兽医 2013年第6期40卷 7-14页

作者：吕继洲吴绍强张永宁王振宝冯春燕王彩霞邓俊花袁向芬林祥梅中国检验检疫科学研究院北京100029 新疆伊犁出入境检验检疫局新疆伊犁835000

本研究旨在建立小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定方法,并探讨它们的系统发生关系。在新疆、内蒙古从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定后,PCR扩增测序获得3种璃眼蜱的16SrRNA及线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome o... 详细信息

本研究旨在建立小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定方法,并探讨它们的系统发生关系。在新疆、内蒙古从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定后,PCR扩增测序获得3种璃眼蜱的16SrRNA及线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome oxidaseⅠ,COⅠ)序列后进行同源性分析。用Mega 5.0和Mrbayes 3.2软件分别构建系统进化树,亚洲璃眼蜱、小亚璃眼蜱样本16SrRNA序列与GenBank中已知相应蜱虫16SrRNA序列聚类,而残缘璃眼蜱COⅠ序列与GenBank中已知残缘璃眼蜱COⅠ序列聚类,与形态学鉴定结果一致。在传统形态学分类的基础上,结合分子生物学鉴定方法能简易、准确鉴定小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。

关键词：线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ基因 16S rRNA 小亚璃眼蜱亚洲璃眼蜱残缘璃眼蜱分子鉴定

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小亚璃眼蜱CPL截短基因的多克隆抗体制备及其应用研究

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中国预防兽医学报 2022年第6期44卷 655-660页

作者：翟雪洁郝蕴伟阿力木江·加帕尔宋瑞其诺明达来蒋倩何文文郑会珍巴音查汗新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 石河子大学医学院基础医学系新疆石河子832003

组织蛋白酶L(CPL)是半胱氨酸蛋白水解酶,属于木瓜蛋白酶家族,参与蜱对血红蛋白降解与消化,是一种潜在的抗蜱疫苗候选抗原。为了制备小亚璃眼蜱(***)CPL多克隆抗体,并对其初步应用,本研究利用PCR方法扩增CPL截短基因(HanCPL)后构建pET-28... 详细信息

组织蛋白酶L(CPL)是半胱氨酸蛋白水解酶,属于木瓜蛋白酶家族,参与蜱对血红蛋白降解与消化,是一种潜在的抗蜱疫苗候选抗原。为了制备小亚璃眼蜱(***)CPL多克隆抗体,并对其初步应用,本研究利用PCR方法扩增CPL截短基因(HanCPL)后构建pET-28a-HanCPL和pEGFP-C3-HanCPL质粒,pET-28aHanCPL经IPTG诱导后通过SDS-PAGE检测重组HanCPL蛋白(rHanCPL)的表达,结果显示,正确构建了pET-28a-HanCPL和p EGFP-C3-HanCPL质粒;rHanCPL以包涵体形式表达,分子量大小约为27 ku,可以被兔抗His tag抗体特异性识别;利用亲和层析柱和尿素透析法纯化rHanCPL后经western blot鉴定纯化效果,并测浓度后免疫新西兰兔,制备rHanCPL多克隆抗体,经western blot检测rHanCPL的反应性,采用间接ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,rHanCPL纯化效果较好,浓度为3 mg/mL;rHanCPL可以与其多克隆抗体发生特异反应,且制备的r HanCPL多克隆抗体效价高达1:204800,可用于后续试验。利用制备的rHanCPL多克隆抗体作为一抗,通过免疫组化试验检测天然CPL在***中的定位,结果显示,天然CPL蛋白可以被rHanCPL多克隆抗体特异性识别,且其定位于***中的肠上皮细胞;另外将pEGFP-C3-HanCPL质粒转染至HEK-293T中,以制备的rHanCPL多克隆抗体作为一抗,使用western blot和IFA方法检测重组蛋白(EGFP-HanCPL)的表达及定位情况,结果显示EGFP-HanCPL蛋白也可与rHanCPL多克隆抗体特异性结合,其分子量约为46 ku,其主要定位于细胞质。本研究利用表达的rHanCPL制备了r HanCPL多克隆抗体,并初步将该多克隆抗体用于CPL的相关研究,为后续抗蜱疫苗蛋白抗原的筛选提供参考依据。

关键词：小亚璃眼蜱组织蛋白酶L 多克隆抗体免疫组化

亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱新疆地理株各发育阶段生物学特性的比较分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022年第3期40卷 369-378页

作者：宋瑞其翟雪洁李才善葛婷甘露张梦圆樊新丽李永畅张杨巴音查汗石河子大学医学院基础医学系石河子832003 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 哈密畜牧工作站哈密839200

目的分析比较亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)和小亚璃眼蜱(***)新疆地理株不同发育阶段生物学特性和形态差异。方法2019年4—5月,于新疆奇台和吐鲁番2个蜱流行地采集硬蜱,利用形态学特征鉴定蜱种,提取全蜱总DNA,PCR扩增蜱虫线粒体细胞... 详细信息

目的分析比较亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)和小亚璃眼蜱(***)新疆地理株不同发育阶段生物学特性和形态差异。方法2019年4—5月,于新疆奇台和吐鲁番2个蜱流行地采集硬蜱,利用形态学特征鉴定蜱种,提取全蜱总DNA,PCR扩增蜱虫线粒体细胞色素氧化酶亚基1(CO1)基因保守片段,使用pEASY R-T1载体系统对目的基因进行克隆,挑取单菌落无菌扩大培养,培养后的菌液进行测序。采用NCBI中Blast在线分析软件,对测序后的靶基因序列与其他序列的同源性进行比对,分析CO1基因序列并进行系统进化树分析。将12只新西兰大白兔随机均分为2组,每组6只,分别供血饲喂不同发育阶段的亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱,分别为幼蜱(200只)、若蜱(150只)和成蜱(50只),每个发育期分别取2只大白兔进行供血饲喂。采用饲蜱装置将蜱接种于兔子耳部饲血,每天对吸血蜱进行观察,直至各发育期蜱饱血脱落,记录各个阶段的发育时间,观察各蜱种不同发育期的生物学特性。结果于奇台和吐鲁番两地共采集317和291只硬蜱,分别为亚洲璃眼蜱(317只)和小亚璃眼蜱(291只)。经生物学特性的比较发现,亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱完成一个生活史分别平均需要131.5和112.5 d。在卵期,亚洲璃眼蜱的产卵和卵孵化周期(27.5 d和31.5 d)长于小亚璃眼蜱(12.0 d和20.5 d);在幼蜱期,亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱吸血、蜕皮分别需要5.5、18.5 d和9、18.5 d;在若蜱期,亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱吸血、蜕皮分别需要10.5、19.0 d和4.5、30.0 d;在成蜱期,亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱雌蜱吸血、产卵前期分别需要8.5、10.5 d和13.0、5.0 d。经形态学比较发现,除亚洲璃眼蜱卵期出现“卵斑”(后期发育成肛门)的时间(19 d)晚于小亚璃眼蜱(14 d),两蜱种间幼蜱和若蜱的差异不明显;成蜱间差异主要体现在颈沟(亚洲璃眼蜱雄蜱:长且深,向后延伸超出盾板中部;小亚璃眼蜱雄蜱:短而浅)、肛侧板与肛下板(亚洲璃眼蜱雄蜱:肛侧板窄长,前尖窄后钝圆,内缘凸角较宽呈尖三角型,副肛侧板中等大小,肛下板略小,呈乳头状;小亚璃眼蜱雄蜱:肛侧板中部稍宽,前端尖窄,后缘略圆钝,内缘突角宽短,肛下板不明显)、气门板(亚洲璃眼蜱雄蜱:呈曲颈瓶形,前端似卵圆形,背突稍窄且长;小亚璃眼蜱雄蜱:类似勺形,背突稍宽且长,末端至背板边缘。亚洲璃眼蜱雌蜱:似长椭圆形,背突稍宽且长,呈直角向背部,末端至背板边缘;小亚璃眼蜱雌蜱:似长矩形,背突稍宽且长,向前近直角弯曲)、足基节(亚洲璃眼蜱雌蜱:足Ⅰ基节外距稍长于内距,基节外距粗短,按节序渐小;小亚璃眼蜱雌蜱:足Ⅰ基节外距大于内距,足Ⅱ~Ⅳ基节没有内距,外距短小)及足上的淡黄色环带及纵带(亚洲璃眼蜱雄蜱:明显;小亚璃眼蜱雄蜱:不明显)等,其中雄蜱之间主要鉴别要点为肛侧板、肛下板和气门板;雌蜱间的主要鉴别要点为足和气门板。基于CO1基因的系统进化树分析,本研究获得的新疆奇台株亚洲璃眼蜱(GenBank登录号MW217459)与内蒙古(GenBank登录号JX051135)、哈萨克斯坦(GenBank登录号KU364324)、甘肃武威(GenBank登录号MK292004)、新疆尉犁(GenBank登录号KF527441)的基因序列聚为一簇,新疆吐鲁番株小亚璃眼蜱(GenBank登录号MW221948)与哈萨克斯坦(GenBank登录号MN853167)、甘肃(GenBank登录号JQ737067)、新疆其他株(GenBank登录号MN268557、KF583576)的基因序列聚为另一簇,亚洲璃眼蜱奇台株和小亚璃眼蜱吐鲁番株亲缘关系存在明显差异。结论亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱新疆地理株在生活周期、形态特征和分子生物学等3个方面均存在差异。

关键词：亚洲璃眼蜱小亚璃眼蜱生物学特性新疆

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小亚璃眼蜱的鉴定及其生物学特性研究

新疆农业大学学报 2009年第2期32卷 63-66页

作者：王振宝吾仁其米克巴音查汗王常汉杨帆李向梅新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

经过一循环的饲蜱试验观察和形态学鉴定：蜱种为小亚璃眼蜱，在22-28℃，60％-85％相对湿度下室内人工饲养，证明该种蜱为三宿主蜱，完成一代需要138d，成蜱吸血期、产卵前期、产卵期分别为8.5，10.5，27.5d；卵孵化期为31.5d，孵化率... 详细信息

经过一循环的饲蜱试验观察和形态学鉴定：蜱种为小亚璃眼蜱，在22-28℃，60％-85％相对湿度下室内人工饲养，证明该种蜱为三宿主蜱，完成一代需要138d，成蜱吸血期、产卵前期、产卵期分别为8.5，10.5，27.5d；卵孵化期为31.5d，孵化率为80％；幼虫吸血前期、吸血期、蜕化期分别为3.0，5.5，18.5d；若虫吸血前期、吸血期、蜕化期分别为4，10，19d；成蜱在4℃冰箱、室外模拟鼠洞保种试验成活率为80％。小亚璃眼蜱完全可以在实验室条件下大量繁殖和4℃冰箱保存。

关键词：小亚璃眼蜱生物学特性鉴定研究