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基于毛细管凝胶电泳的寡核苷酸纯度分析方法

计量学报 2023年第3期44卷 410-414页

作者：王乐乐张晓霞刘刚上海市计量测试技术研究院国家市场监管重点实验室(生物分析计量溯源) 上海201203 SCIEX 北京100015

在寡核苷酸的化学合成过程中,会产生与全长序列相差一个(n-1)和两个核苷酸(n-2)的杂质,因为分子质量及电荷性质与主成分差异小,难以准确定量检测。毛细管凝胶电泳具有样品用量少、速度快、灵敏度高、分离效果好、自动化程度高等优势,而... 详细信息

在寡核苷酸的化学合成过程中,会产生与全长序列相差一个(n-1)和两个核苷酸(n-2)的杂质,因为分子质量及电荷性质与主成分差异小,难以准确定量检测。毛细管凝胶电泳具有样品用量少、速度快、灵敏度高、分离效果好、自动化程度高等优势,而普遍应用于核酸的分离和分析。采用毛细管凝胶电泳对寡核苷酸纯度进行分析,能有效分离寡核苷酸全长序列与n-1的杂质,在0.03~1.00 mg/L浓度范围内线性良好(R^(2)=0.998 8),检出限约为0.01 mg/L(信噪比S/N>3),该方法的建立将为寡核苷酸的纯度分析与质量控制提供有力的技术支撑。

关键词：计量学毛细管凝胶电泳寡核苷酸纯度分析单核苷酸分辨率

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桑椹来源的寡核苷酸显著改善小鼠骨质疏松症

动物营养学报 2023年

作者：穆雪萌杜芯仪王彦超金云峰张嘉中国医学科学院北京协和医学院基础学院中国医学科学院北京协和医院骨科上海弗艾柏生物科技有限公司北京优准生物科技有限公司

关键词：桑椹寡核苷酸 ASON-OP 小鼠骨质疏松症

日本药品和医疗器械管理局《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价指导原则》指南介绍

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中国临床药理学杂志 2022年第22期38卷 2788-2792页

作者：周宇王士奇孙涛王庆利叶旋国家药品监督管理局药品审评中心北京100022

随着首款寡核苷酸药物Fomivirsen在20世纪90年代末获批上市,该领域发展迅速,目前已有上百个临床试验正在世界范围内开展。对于寡核苷酸类药物,不同的药品监管机构虽然发布了一些指导原则和考虑要点文件,但尚未形成完整的指导原则体系。... 详细信息

随着首款寡核苷酸药物Fomivirsen在20世纪90年代末获批上市,该领域发展迅速,目前已有上百个临床试验正在世界范围内开展。对于寡核苷酸类药物,不同的药品监管机构虽然发布了一些指导原则和考虑要点文件,但尚未形成完整的指导原则体系。日本药品和医疗器械管理局(PMDA)于2020年3月发布了《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价指导原则》,较为系统地阐述了PMDA在寡核苷酸非临床安全性评价方面的一般考虑,并提供了寡核苷酸类产品非临床安全性评价的基本框架,对于各项安全性研究试验需要重点考虑的方面也提供了建议。本文通过对该指导原则的介绍,并与现行非临床安全性评价相关指导原则进行比较,探讨寡核苷酸药物非临床安全性评价的关注要点,为我国寡核苷酸药物的相关研发和监管工作提供参考。

关键词：寡核苷酸指导原则非临床安全性评价

寡核苷酸探针进行DNA指纹分析在法医学上应用的评价

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Acta Genetica Sinica 1993年第5期20卷 404-410页

作者：蓝翎张小为段秉章霍振义史秀芬金河应用生物技术研究所北京医科大学中国农业科学院畜牧研究所北京刑事科学技术研究所

本文用自制的寡核苷酸探针(CAC)_5/(GTG)_5,对与法医学应用有关的问题进行了研究。从室温下放置三年的血痕得到不完全的DNA指纹图;从同一个体不同组织的DNA得到完全一致的结果;从混合斑中分离出精子DNA进行DNA指纹检验,并与同一供体的血... 详细信息

本文用自制的寡核苷酸探针(CAC)_5/(GTG)_5,对与法医学应用有关的问题进行了研究。从室温下放置三年的血痕得到不完全的DNA指纹图;从同一个体不同组织的DNA得到完全一致的结果;从混合斑中分离出精子DNA进行DNA指纹检验,并与同一供体的血液DNA指纹图进行比较;还用仅有0.25μg的DNA获得了可分辨的DNA指纹图。此外,用限制性内切酶HaeⅢ代替HinfⅠ酶切人的基因组DNA,也获得了高度多态性的杂交图谱。结果表明,(CAC)_5/(GTG)_5是一种具有实用价值的DNA指纹探针。

关键词：寡核苷酸探针法医学 DNA 肤纹

硫酸软骨素修饰聚乙烯亚胺递送寡核苷酸YW002对牙周炎治疗作用的实验研究

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硫酸软骨素修饰聚乙烯亚胺递送寡核苷酸YW002对牙周炎治疗作用的...

作者：张茜吉林大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:牙周炎是一种由细菌感染引起的疾病,微生物与宿主之间的作用在疾病过程中起到了关键的作用。寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)YW002在宿主免疫调节和抑制炎症方面有着广泛的应用。在前期研究中,我们发现ODN YW002可... 详细信息

研究背景和目的:牙周炎是一种由细菌感染引起的疾病,微生物与宿主之间的作用在疾病过程中起到了关键的作用。寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)YW002在宿主免疫调节和抑制炎症方面有着广泛的应用。在前期研究中,我们发现ODN YW002可诱导人牙周膜干细胞中早期成骨标志性因子碱性磷酸酶活性升高,下调炎症晚期RAW 264.7细胞一氧化氮的合成,为ODN YW002后续应用于牙周炎的研究奠定实验基础。然而,游离的ODN不易黏附细胞、极易被核酸酶酶解,使ODN的临床应用受到了限制。通过特定的化学修饰可增强ODN的稳定性,但有文献表明,由于其序列选择性和专一性差,化学修饰存在副作用。因此,使用纳米粒子系统是目前递送ODN常用的解决策略。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)是目前最常使用的基因载体,但是它存在着生物毒性。研究表明,对PEI进行修饰可以降低其细胞毒性。硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是细胞外基质常见成分,具有良好的生物相容性。相较于PEI,CS修饰的PEI衍生物(PEI-CS)具有低细胞毒性,可实现核酸的高效递送,是一种良好的基因载体。本研究中,我们拟制备PEI衍生物PEI-CS,构建PEI-CS/YW002纳米粒子用于YW002的递送,探究PEI-CS/YW002纳米粒子在牙周炎治疗中的新应用。研究方法:1、PEI-CS的合成和表征:采用Michael加成反应制备PEI-CS,利用H-核磁共振(H-nuclear magnetic resonance,H-NMR)对其进行表征,运用凝胶电泳实验、粒径和电位检测对PEI-CS/YW002纳米粒子进行评价。2、PEI-CS的转染效率和细胞毒性:使用共聚焦激光显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)检测ODN YW002的细胞内吞和转染效率;使用小鼠巨噬细胞系RAW 264.7作为实验细胞,CCK-8法检测了PEI-CS/YW002纳米粒子对细胞的毒性。3、PEI-CS/YW002纳米粒子在牙周炎中的应用:本研究使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建体外RAW 264.7细胞炎症模型,通过定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测PEI-CS/YW002纳米粒子对牙周炎症介质白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因和蛋白表达的影响,并与游离的YW002和硫代修饰的YW002-s进行比较。研究结果:1、H-NMR结果显示,本实验制备的PEI-CS具有与PEI和CS相似的特征峰,这证明成功合成了PEI-CS;凝胶电泳实验结果表明,当PEI-CS与YW002的质量比为≥4:1时,PEI-CS可以有效阻碍YW002迁移,这表明PEI-CS与YW002之间结合形成了纳米粒子;粒径与电位检测结果显示,当质量比为4:1时,测得PEI-CS/YW002纳米粒子粒径是240.03±0.38 nm,Zeta电位是+9.10±1.78 m V。以上实验表明PEI-CS/YW002纳米粒子最适转染效率对应的质量比例,即4:1。2、CLSM结果显示,YW002与RAW 264.7细胞共同孵育后,可发现带Cy-5荧光标记的YW002在一定时间内通过胞吞作用进入细胞内。CCK-8法结果表明,当PEI-CS与YW002的质量比为≤8:1时,PEI-CS/YW002纳米粒子作用下RAW264.7细胞的细胞存活率与对照组无显著性差异,表明在一定质量比使用范围内,PEI-CS具有良好的生物相容性。3、qRT-PCR和Western blot结果表明,RAW 264.7细胞在LPS刺激下,炎症模型成功构建,PEI-CS/YW002纳米粒子组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达与LPS刺激组相比显著下降,证明了PEI-CS/YW002纳米粒子对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症模型有良好的抗炎作用,且抗炎效果优于化学修饰的YW002-s。研究结论:PEI-CS具有良好的生物相容性,在体外未见明显毒性,可实现ODN YW002细胞内高效递送,具有良好的抗炎作用,在未来有可能成为治疗牙周炎的一种新手段。

关键词：牙周炎寡核苷酸硫酸软骨素聚乙烯亚胺抗炎

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寡核苷酸诺西那生钠氨解工艺研究

合成化学 2023年

作者：杨国涛王星彭朋张思婷熊志刚李金亮吴晶晶上海应用技术大学化学与环境工程学院上海奥锐特生物科技有限公司

诺西那生钠是首个批准用于治疗脊髓性肌肉萎缩症的靶向寡核苷酸药物，由于其独特的基因治疗方式备受青睐。现有的诺西那生钠氨解工艺存在纯度低、收率低等缺点。以不同的2’-MOE亚磷酰胺单体为原料，NittoPhase树脂为固相载体，采用固... 详细信息

诺西那生钠是首个批准用于治疗脊髓性肌肉萎缩症的靶向寡核苷酸药物，由于其独特的基因治疗方式备受青睐。现有的诺西那生钠氨解工艺存在纯度低、收率低等缺点。以不同的2’-MOE亚磷酰胺单体为原料，NittoPhase树脂为固相载体，采用固相合成技术合成得到附着在树脂上的诺西那生钠中间体，通过对氨解试剂、时间及温度的考察，结果表明：以80 mL/mmol的氨水/正丙胺/水（2/1/1， V/V/V）作为氨解试剂，于45 ℃条件下反应1 h，可得到纯度97.0%（MS）以上的目标核苷酸链。相比文献报道的工艺，该氨解工艺提高了中间体转化效率和产品纯度，降低了后续纯化的难度和成本，使合成工艺更加高效便捷，且适用于商业化生产。

关键词：诺西那生钠寡核苷酸反义寡核苷酸固相合成氨解反应工艺优化

混合离子对试剂体系下寡核苷酸的IP-RPLC保留行为

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高等学校化学学报 2018年第9期39卷 1893-1903页

作者：乔俊琴梁超曹兆明练鸿振生命分析化学国家重点实验室南京大学化学化工学院和现代分析中心南京210023

利用离子对反相液相色谱(IP-RPLC)对寡核苷酸在混合离子对试剂三乙胺/丙胺-乙酸盐(TEA/PAAA)体系下的保留行为进行了研究,并与经典离子对试剂三乙胺乙酸盐(TEAA)体系下的保留行为进行了对比.实验结果表明,相同离子对试剂浓度下,寡核苷酸... 详细信息

利用离子对反相液相色谱(IP-RPLC)对寡核苷酸在混合离子对试剂三乙胺/丙胺-乙酸盐(TEA/PAAA)体系下的保留行为进行了研究,并与经典离子对试剂三乙胺乙酸盐(TEAA)体系下的保留行为进行了对比.实验结果表明,相同离子对试剂浓度下,寡核苷酸在TEA/PA-AA体系下的保留均弱于TEAA体系下的保留,且寡核苷酸的保留均随着离子对试剂浓度(20~120 mmol/L)的增加而增强.同型寡核苷酸(dC)_n作为特例,当n>10时,保留基本趋于稳定,这是由于(dC)_n随着离子对试剂浓度的增加保留增长较快,在较低的离子对试剂浓度下即可达到最大保留.同时发现,短链同型寡核苷酸(dT)_n和异型寡核苷酸在TEA/PA-AA体系下的分离均优于TEAA体系,而同型寡核苷酸(dA)_n和(dC)_n的分离则在TEAA体系下更优.通过研究流动相中离子对试剂总浓度c_p与寡核苷酸保留因子k之间的关系,推断出2种体系下寡核苷酸的保留机理均以离子对模型占主导地位.总体而言,分离相同长度的异型寡核苷酸时,TEA/PA-AA混合离子对体系尤其在中等离子对浓度下比TEAA体系具有明显优势,低的离子对试剂浓度可增加与后续电喷雾质谱(ESIMS)的兼容性,有利于寡核苷酸的定性分析.

关键词：离子对反相液相色谱(IP-RPLC) 寡核苷酸混合离子对试剂保留行为保留机理

烯丙基作为保护基在修饰寡核苷酸合成中的应用

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化学学报 2001年第10期59卷 1691-1696页

作者：周英张亮仁张礼和北京大学

研究了烯丙基作为核苷糖环羟基保护基在寡核苷酸及其类似物的合成中应用的可能性.烯丙基保护基可用PdCl2在温和的条件下脱除,适合应用于对碱不稳定的寡核苷酸的合成应用烯丙基保护基成功地合成了三胸苷二碳酸酯和二胸苷亚硫酸酯.

关键词：烯丙基 PdCl2 三胸苷二碳酸酯二胸苷亚硫酸酯寡核苷酸保护基药物合成

低pH毛细管区带电泳法分离寡核苷酸和硫代反义寡核苷酸

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色谱 2007年第1期25卷 101-106页

作者：李茜陈蓉孙毓庆胡育筑中国药科大学分析化学教研室江苏南京210038 沈阳药科大学药学院辽宁沈阳110016

在低pH条件下采用毛细管区带电泳法对寡核苷酸（PO-ODNs）及具有药用价值的硫代反义寡核苷酸（PS-ODNs）药物“癌泰得”系列样品（18～20mers）进行分离，并系统考察优化了缓冲溶液的pH、缓冲溶液的种类及浓度、添加剂的种类及浓度、电... 详细信息

在低pH条件下采用毛细管区带电泳法对寡核苷酸（PO-ODNs）及具有药用价值的硫代反义寡核苷酸（PS-ODNs）药物“癌泰得”系列样品（18～20mers）进行分离，并系统考察优化了缓冲溶液的pH、缓冲溶液的种类及浓度、添加剂的种类及浓度、电压、温度等因素对样品单碱基分离的影响。其中缓冲溶液的pH对分离起决定性的作用，而添加剂尿素的加入显著提高了PS-ODNs样品的分离度。结果表明，采用末涂层弹性石英毛细管（50μm，总长49．0cm，有效长度40．7cm），以50mmol／L磷酸二氢钠-磷酸（pH2．24）-7 mol／L尿素为缓冲溶液，压力进样（2kPa×10s），负极进样，正极检测，在分离电压-20kV、柱温25℃、检测波长260nm条件下，可实现寡核岢酸及硫代反义寡核苷酸混合样品的单碱基分离。PO—ODNs的18～19mers及19～20mers样品的平均分离度分别为4．68，3．20；PS—ODNs的18～19mers及19～20mers样品的平均分离度分别为1．23及0．81．该法操作简单，重现性好，可为反义寡核苷酸药物的分析提供借鉴．

关键词：低pH 毛细管区带电泳法寡核苷酸硫代反义寡核苷酸