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富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白在体外调节人平滑肌细胞动脉稳态的实验研究

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富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白在体外调节人平滑肌细胞动脉稳态的...

作者：叶耿帆山东大学

学位级别：硕士

目的:颅内动脉瘤是一个威胁生命的疾病。其是自发性蛛网膜下腔出血的首要病因,一旦动脉瘤发生破裂出血,有极高的致残率和死亡率。颅内动脉瘤的确切发病机制仍不十分明确,并且缺乏对颅内动脉瘤的发生进行筛查和对其破裂的风险进行评估特... 详细信息

目的:颅内动脉瘤是一个威胁生命的疾病。其是自发性蛛网膜下腔出血的首要病因,一旦动脉瘤发生破裂出血,有极高的致残率和死亡率。颅内动脉瘤的确切发病机制仍不十分明确,并且缺乏对颅内动脉瘤的发生进行筛查和对其破裂的风险进行评估特异的生物学标志物。通过文献回顾,本课题组提出"动脉稳态"(Arterial Homeostasis)的概念,即对于血流应力和血管退行性变所造成的损伤,动脉血管自身存在着一定修复的能力,从而形成损伤与修复的动态平衡来维持血管稳定,这种平衡的打破可能是颅内动脉瘤的发病机制。遗传学因素在颅内动脉瘤发病过程中所起的作用日益受到人们的关注。研究表明,富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)广泛地表达于颅内动脉瘤组织平滑肌细胞层,而其对平滑肌细胞的作用尚不十分清楚。本论文旨在研究SPARC对人血管平滑肌细胞的作用,以及这种作用是否影响了动脉稳态,从而探讨其在颅内动脉瘤发生、发展过程中可能起到的作用。方法:本研究采用原代人脐动脉血管平滑肌细胞(human umbilical arterial smooth muscle cells,HUASMCs)作为研究对象,将其分别暴露于含有(0、0.125、0.25、0.5、1、2和4ug/ml)SPARC的培养基培养24小时后,采用细胞计数试剂盒(CCK8)检测HUASMCs的细胞活力。将其分别暴露于含有(0、2ug/ml)SPARC的培养基2、6、12、24和48小时后,采用流式细胞术检测HUASMCs的细胞周期分布和细胞凋亡比率的变化;并用Western Blot技术检测HUASMCs中以下蛋白表达情况:细胞周期调控蛋白(P21、P53、CyclinD1),细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl2、Caspase-3、Cl eaved Caspase-3),明胶酶和金属蛋白酶组织抑制剂(MMP2、MMP9、TIMP2、TIMP1)。结果:将HUASMCs暴露于含有(2、4ug/ml)SPARC的培养基,作用24小时后,细胞活力相较对照组分别为89.30±2.00%和87.57±2.17%(P蛋白免疫印迹灰度分析结果显示,P21蛋白含量在2-12小时显著提高(P蛋白的表达量在48小时内并没有显著地改变(P>0.05 vs.对照组);同时,Bax蛋白水平显著地上调并于24小时达到高峰(P蛋白在24小时内无显著变化但在48小时出现显著地下调(P蛋白也显著上调并在24小时达到高峰(P蛋白的含量显著增加且在24小时达到高峰(P蛋白的表达水平相对保持稳定;MMP9蛋白的表达量显著增加,同时也伴随着TIMP1蛋白含量的显著上调(P蛋白的表达将HUASCMs细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期,抑制HUASMCs细胞的增殖速度,还可以促进HUASMCs进行线粒体途径的细胞凋亡,从而降低其细胞活力;SPARC也可能通过促进明胶酶(MMP2、MMP9)的分泌,导致血管壁中细胞外基质和内弹力层的退行性变。结论:实验结果提示,SPARC可能通过增加对颅内动脉中膜、内弹力层及其他细胞外基质的损伤因素,同时降低其自我修复能力,打破动脉血管损伤与修复的动态平衡,导致颅内动脉瘤的发生、发展、甚至破裂。

关键词：颅内动脉瘤富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白动脉稳态平滑肌细胞基质金属蛋白酶

富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白在病理性瘢痕中的表达及其意义

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组织工程与重建外科杂志 2010年第1期6卷 17-20页

作者：刘超华李小静宁金龙王春安徽医科大学第一附属医院整形外科安徽省合肥市230022

目的观察富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(Secreted protein,acidic and rich in cysteine,SPARC)在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表达规律及其意义。方法瘢痕患者的瘢痕疙瘩和3～12个月增生性瘢痕组织各26例;另取手术剩余的正常成人皮肤组织5... 详细信息

目的观察富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(Secreted protein,acidic and rich in cysteine,SPARC)在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表达规律及其意义。方法瘢痕患者的瘢痕疙瘩和3～12个月增生性瘢痕组织各26例;另取手术剩余的正常成人皮肤组织5例;所有标本用40 g/L甲醛固定,行连续切片,厚4μm,应用链菌素生物素-过氧化物酶标记物免疫组织染色法染色。同时设正常对照(正常皮肤)、阳性对照(胃癌癌变组织)、阴性对照(磷酸盐缓冲液代替一抗)。鼠抗人SPARC单克隆一抗浓度为1:200。结果正常成人皮肤中SPARC表达稀少,局限在真皮-表皮交界的乳头真皮,部分靠近基底膜血管和皮肤附件。SPARC在增生性瘢痕的真皮瘢痕组织、皮肤附件中低表达,且早期增生性瘢痕中表达无明显强于晚期增生性瘢痕(P>0.05)。在真皮中SPARC呈弥散性散在分布(同增生性瘢痕),阳性信号表达较低。增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的SPARC较正常皮肤表达无差异(P>0.05)。结论SPARC在3～12个月增生性瘢痕中呈低表达,在瘢痕疙瘩中低表达。

关键词：瘢痕疙瘩富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白增生性瘢痕表达

富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白对瘢痕疙瘩成纤维细胞β1转化生长因子和Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响

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中华医学美学美容杂志 2011年第5期17卷 377-380页

作者：王春李小静刘超华翁晓娟郝冬月安徽医科大学第一附属医院整形美容外科浙江省桐乡市第一人民医院骨科

目的探讨实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(secreted protein,acidicand rich in cysteine,SPARC)对瘢痕疙瘩成纤维细胞β1转化生长因子(TGF-β1)、Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响。方法用不同... 详细信息

目的探讨实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(secreted protein,acidicand rich in cysteine,SPARC)对瘢痕疙瘩成纤维细胞β1转化生长因子(TGF-β1)、Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响。方法用不同浓度重组人SPARC作用于体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,并以空白组为对照,实时荧光定量RT-PCR法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达。结果与空白对照组相比,实验组TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显增高(P蛋白基因的表达。

关键词：瘢痕疙瘩富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 β1转化生长因子 Ⅰ型胶原蛋白

富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白对瘢痕疙瘩成纤维细胞β1转化生长因子和I型胶原蛋白基因表达的影响

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中华医学美学美容杂志 2011年第5期17卷 377-380页

作者：王春李小静刘超华翁晓娟郝冬月安徽医科大学第一附属医院整形美容外科合肥230032

目的探讨实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白（secreted protein，acidic and rich in cysteine，SPARC）对瘢痕疙瘩成纤维细胞β1转化生长因子（TGF-β1）、I型胶原蛋白基因表达的影响。... 详细信息

目的探讨实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白（secreted protein，acidic and rich in cysteine，SPARC）对瘢痕疙瘩成纤维细胞β1转化生长因子（TGF-β1）、I型胶原蛋白基因表达的影响。方法用不同浓度重组人SPARC作用于体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞，并以空白组为对照，实时荧光定量RT-PCR法检测TGF-βI、I型胶原蛋白mRNA的表达。结果与空白对照组相比，实验组TGF-βI、I型胶原蛋白mRNA表达明显增高（P〈0．05）。结论SPARC能显著促进瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β1、I型胶原蛋白基因的表达。

关键词：瘢痕疙瘩富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 β1转化生长因子 I型胶原蛋白

富含半胱氨酸酸性分泌糖蛋白及其肽段对人系膜细胞增殖和凋亡的作用

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中华肾脏病杂志 2006年第4期22卷 215-220页

作者：邬碧波张黎明付莉莉王文靖梅长林第二军医大学长征医院闸北分院肾内科上海200070 长征医院肾内科解放军肾脏病中心

目的研究富含半胱氨酸酸性分泌糖蛋白(SPARC)的全长蛋白及其2．1肽段对人肾小球系膜细胞(HMC)增殖、凋亡及细胞周期的影响,初步探讨SPARC全长蛋白及其肽段对 HMC作用的可能机制。方法采用体外传代培养的HMC,用不同浓度的SPARC全长蛋白... 详细信息

目的研究富含半胱氨酸酸性分泌糖蛋白(SPARC)的全长蛋白及其2．1肽段对人肾小球系膜细胞(HMC)增殖、凋亡及细胞周期的影响,初步探讨SPARC全长蛋白及其肽段对 HMC作用的可能机制。方法采用体外传代培养的HMC,用不同浓度的SPARC全长蛋白及其肽段分别作用不同时间。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡;应用Western印迹检测SPARC全长蛋白及肽段对HMC细胞周期调控蛋白cyclinD1、p21Wafl 表达的影响。结果 (1)与对照组比较,不同浓度(12．5、25、50μαg／ml)SPARC全长蛋白及其肽段作用48 h都能明显抑制HMC的增殖,并呈剂量和时间依赖性,96 h达到高峰。(2)12．5μg／ml SPARC全长蛋白及其肽段作用96 h,能明显影响细胞周期,使G0／G1期细胞增加,S期细胞减少,可使HMC的细胞周期阻滞在G0／G1期。(3)SPARC全长蛋白及其肽段可在体外诱导HMC 细胞凋亡。(4)cyclinD1的表达明显减弱、而p21Wafl的表达明显增强。结论 SPARC全长蛋白及其肽段可剂量依赖性地抑制HMC的增殖,其作用可能通过抑制cyclinD1的表达、上调p21Wafl的表达,使细胞周期阻滞在G0／G1期。这为临床治疗原发性、继发性系膜增生性肾小球肾炎提供了线索。

关键词：糖蛋白类肽类系膜细胞富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白

富含半胱氨酸酸性分泌糖蛋白及其肽段对人系膜细胞增殖和凋亡作用的研究

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富含半胱氨酸酸性分泌糖蛋白及其肽段对人系膜细胞增殖和凋亡作用...

作者：邬碧波第二军医大学

学位级别：硕士

目的研究富含半胱氨酸酸性分泌糖蛋白(SPARC)的全长蛋白及其2.1肽段对人肾小球系膜细胞(HMC)增殖、凋亡和细胞周期调控蛋白表达以及细胞外基质mRNA表达的影响。方法应用的技术包括噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期、W... 详细信息

目的研究富含半胱氨酸酸性分泌糖蛋白(SPARC)的全长蛋白及其2.1肽段对人肾小球系膜细胞(HMC)增殖、凋亡和细胞周期调控蛋白表达以及细胞外基质mRNA表达的影响。方法应用的技术包括噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期、Western blot检测细胞周期调控蛋白CyclinD1和P21的表达、透射电镜观察细胞形态学的变化、Annexin V/PI双染色方法检测细胞凋亡指数、实时荧光定量RT-PCR法检测细胞外基质(Col I、Col IV、LN、FN)mRNA的水平、夹心ELISA法对IgAN患者和正常人血液和尿液中SPARC和细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6进行定量检测、免疫组织化学检测SPARC在IgAN患者及正常人肾组织中的表达及分布等。结果(1)SPARC及其肽段能够抑制HMC增殖,呈良好的时效与量效关系;(2)SPARC及其肽段可使HMC的细胞周期阻滞在G0/G1期,并诱导细胞凋亡,电镜下可见典型的凋亡小体;(3)SPARC及其肽段对HMC细胞周期调控蛋白的表达有影响,使CyclinD1的表达明显减弱、P21Wafl的表达明显增强;(4)SPARC及其肽段可使细胞外基质Col I、Col IV、FN mRNA的表达明显下调;(5)SPARC在IgA肾病小管上皮细胞中表达明显增强;(6)IgAN患者血液和尿液中的SPARC含量显著高于正常人;IgAN患者血液中的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均显著高于正常人,而IgAN患者尿液中的TNF-α、IL-6的含量亦显著高于正常人。结论SPARC及其肽段能抑制HMC增殖、诱导细胞凋亡及减少细胞外基质合成,为临床治疗原发性和继发性系膜增生性肾小球肾炎提供了实验基础和理论依据。

关键词：富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白肽段系膜细胞增殖凋亡细胞外基质

SPARC对增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响

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山东医药 2009年第50期49卷 110-111页

作者：王春李小静刘超华朱飞张林翁晓娟郝冬月安徽医科大学第一附属医院合肥230032

目的观察富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)对增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法用不同浓度重组人SPARC作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞(实验组),并与空白组作对照。用实时荧光定量RT-PCR法检测其Ⅰ型胶原蛋白... 详细信息

目的观察富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)对增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法用不同浓度重组人SPARC作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞(实验组),并与空白组作对照。用实时荧光定量RT-PCR法检测其Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达情况。结果与空白对照组相比,实验组Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显增高(P蛋白基因的表达。

关键词：富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白增生性瘢痕 Ⅰ型胶原蛋白

病理性瘢痕组织中SPARC的表达变化及意义

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山东医药 2010年第14期50卷 30-31页

作者：刘超华李小静宁金龙王春安徽医科大学第一附属医院合肥230022

目的观察富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表达变化及其意义。方法病理性瘢痕患者52例,其中瘢痕疙瘩(瘢痕组)和增生性瘢痕组织(增生组)各26例,另取正常皮肤组织5例为对照(对照组)。采用免疫组化SP法检测... 详细信息

目的观察富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表达变化及其意义。方法病理性瘢痕患者52例,其中瘢痕疙瘩(瘢痕组)和增生性瘢痕组织(增生组)各26例,另取正常皮肤组织5例为对照(对照组)。采用免疫组化SP法检测三组SPARC。将三组组织中的成纤维细胞传代培养(4～6代),采用Western blot法检测其SPARC。结果瘢痕组、增生组中SPARC表达较弱,虽比对照组高,但P>0.05;在早期增生性瘢痕(3～6个月)中的表达与晚期(9～12个月)近似(P>0.05)。瘢痕组、增生组成纤维细胞中SPARC表达均高于对照组(P均<0.05)。结论病理性瘢痕组织中的SPARC均呈低表达,其成纤维细胞中的SPARC呈高表达,这可能与病理性瘢痕的发生有关。

关键词：瘢痕疙瘩增生性瘢痕富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白

SPARC在病理性瘢痕中表达及意义的初步研究

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SPARC在病理性瘢痕中表达及意义的初步研究

作者：刘超华安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:病理性瘢痕包括增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)和瘢痕疙瘩(keloid,K),其发病机制尚未完全清楚。目前,国内外学者普遍认为,病理性瘢痕的形成与成纤维细胞(fibroblast,Fb)过度增殖、分化以及其分泌产物——胶原为主的细胞外基质... 详细信息

目的:病理性瘢痕包括增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)和瘢痕疙瘩(keloid,K),其发病机制尚未完全清楚。目前,国内外学者普遍认为,病理性瘢痕的形成与成纤维细胞(fibroblast,Fb)过度增殖、分化以及其分泌产物——胶原为主的细胞外基质在创伤处过度沉积有关。其发病机制是医学领域的重要课题。本研究通过比较病理性瘢痕与正常皮肤组织中SPARC是否存在差异,来探讨SPARC在病理性瘢痕形成过程中所起的生物学作用及意义。方法:(1)病理性瘢痕患者63例,其中瘢痕疙瘩(瘢痕组)和增生性瘢痕组织(增生组)分别为31例、32例,另取正常皮肤组织10例为对照(对照组)。采用免疫组化SP法检测三组组织中SPARC表达变化。(2)手术取病理性瘢痕和正常皮肤组织,按文献方法进行成纤维细胞原代培养,待细胞融合后传代。取4～6代传代细胞,应用蛋白印迹法(Western-blot)检测病理性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞中SPARC的变化。结果:1. Western blot法检测发现病理性瘢痕和正常皮肤均有SPARC表达。2、利用凝胶图象处理系统分析,病理性瘢痕SPARC蛋白条带和内参照(β-actin)灰度值比值与正常皮肤SPARC蛋白条带和内参照(β-actin)灰度值比值存在差异。前者比值更大。所得数据经统计学分析,利用t检验发现(P0. 05)。结论:1、SPARC可能参与了病理性瘢痕和正常皮肤的发展过程。2、病理性瘢痕中胶原纤维、平滑肌细胞、皮肤附件、浸润的炎性细胞和微血管内皮细胞增殖可能与SPARC表达有关。3、在病理性瘢痕组织成纤维细胞中,SPARC的表达明显高于正常皮肤成纤维细胞(western blotting检测结果)。

关键词：病理性瘢痕富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白正常皮肤免疫蛋白印迹免疫组化