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两种分离纯化介质对虾肝肠胞虫孢子发芽率的影响

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重庆师范大学学报（自然科学版） 2020年第3期37卷 46-53页

作者：杨小娟陈洁魏春梅范晓东周泽扬重庆师范大学生命科学学院重庆401331 家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400715 微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室重庆400715

【目的】比较蔗糖和Percoll两种不同介质的密度梯度离心分离纯化虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)孢子的效果及对EHP孢子发芽活力的影响。【方法】取感染EHP的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺充分研磨,经3次差速离... 详细信息

【目的】比较蔗糖和Percoll两种不同介质的密度梯度离心分离纯化虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)孢子的效果及对EHP孢子发芽活力的影响。【方法】取感染EHP的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺充分研磨,经3次差速离心后,设置介质质量分数为30%,60%,90%的梯度,分别进行蔗糖和Percoll密度梯度离心,比较两种介质不同分层中EHP孢子的数量和纯化效果。纯化样品分别用0.1mol·L^-1的KOH溶液、0.15mol·L^-1的HCl溶液、0.15mol·L^-1的NaOH溶液、0.025mol·L^-1 pH为11.5的磷酸盐缓冲液、0.05mol·L^-1 pH为8.8的TrisHCl溶液、0.01mol·L^-1 pH为4.8的柠檬酸盐缓冲液等6种溶液于28℃孵育30min,比较EHP孢子的发芽率。【结果】蔗糖密度梯度离心后EHP孢子主要分布在蔗糖质量分数为90%层的底层,数量为1.53×108个。Percoll密度梯度离心后EHP孢子主要分布在Percoll质量分数为90%层的下层,数量为2.64×10^7个。经Percoll或蔗糖密度梯度离心分离纯化的EHP孢子再经上述6种不同溶液处理后,孢子发芽率存在差异;经0.1mol·L^-1的KOH溶液或0.05mol·L^-1pH为8.8的Tris-HCl溶液诱导时,两种介质分离纯化所得的EHP孢子发芽率之间差异具有统计学意义(p梯度对EHP孢子进行密度梯度离心,蔗糖的分离纯化效果比Percoll更好,对EHP孢子的发芽率影响更小;经蔗糖或Percoll分离纯化的EHP孢子再经0.05mol·L^-1 pH为8.8的Tris-HCl溶液或0.025mol·L^-1 pH为11.5的磷酸盐缓冲液处理,可获得较高的发芽率。

关键词：虾肝肠胞虫密度梯度离心蔗糖 Percoll 发芽

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卵巢细胞膜的制备及鉴定

华西医科大学学报 1986年第2期17卷 89-92页

作者：陈曼玲王德恭杜泽丽蓝天鹤雷幼导李光荣彭小东华西医科大学生物化学教研室华西医科大学同位素室华西医科大学电子显微镜室

作者用匀浆、超声波及蔗糖密度梯度离心法制备了卵巢细胞膜,较单纯匀浆之HCG结合率提高1750倍,四种蔗糖浓度及五种蔗糖浓度之分离效果对比,以前者为宜,离心速度为78000×g时结合率最高,且集中于33％表面层及33％～37％界面层。

关键词：细胞膜卵巢密度梯度离心

青岛浒苔完整叶绿体分离及其蛋白质提取方法的初步建立

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植物检疫 2013年第2期27卷 44-48页

作者：杜智欣邱艳红鲁洁段维军孔君朱水芳中国农业大学农学与生物技术学院北京100193 中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所宁波出入境检验检疫局

初步建立青岛海域漂浮浒苔完整叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法,为进一步研究浒苔叶绿体蛋白质组学奠定基础。本研究应用组织研磨结合Percoll密度梯度离心的方法分离出浒苔的完整叶绿体,随后以两种蛋白裂解液配方分别提取叶... 详细信息

初步建立青岛海域漂浮浒苔完整叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法,为进一步研究浒苔叶绿体蛋白质组学奠定基础。本研究应用组织研磨结合Percoll密度梯度离心的方法分离出浒苔的完整叶绿体,随后以两种蛋白裂解液配方分别提取叶绿体总蛋白,并通过蛋白定量和两种聚丙烯酰胺凝胶电泳进行比较分析。结果表明:Percoll密度梯度离心的方法能够获得完整且较纯的浒苔细胞叶绿体;含有尿素以及CHAPS的蛋白裂解液抽提的叶绿体蛋白质数量比SDS裂解液更多;相较于普通Tris-SDS-PAGE,采用Tricine-SDS-PAGE电泳系统可以有效分离40kDa以下的小分子叶绿体蛋白质。

关键词：浒苔叶绿体蛋白质密度梯度离心提取

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组织胚胎学

中国医学文摘(基础医学) 2000年第4期17卷 201-206页

关键词：解剖学报教研室组织胚胎学组织学食管上皮大鼠海马超微结构神经干细胞卫星细胞原代培养静纤毛耳蜗迷路调亡胞间粘附分子密度梯度离心 ICAM

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贵州大河边矿煤显微组分解离规律及其分选

西安科技大学学报 2019年第6期39卷 950-956页

作者：杜美利杨敏杨瑞朱晨浩朱超任辉西安科技大学化学与化工学院陕西西安710054 国土资源部煤炭资源勘查与综合利用重点实验室陕西西安710054 陕西煤田地质化验测试有限公司陕西西安710054

以贵州大河边矿煤为研究对象,确定了其在显微光学条件下煤岩显微组分的组成、赋存状态及含量特征,同时采用XRD衍射技术分析了原煤中矿物组成。通过对原煤的破碎解离,进而研究了壳质组、镜质组和惰质组在不同粒级的解离规律,在此基础上... 详细信息

以贵州大河边矿煤为研究对象,确定了其在显微光学条件下煤岩显微组分的组成、赋存状态及含量特征,同时采用XRD衍射技术分析了原煤中矿物组成。通过对原煤的破碎解离,进而研究了壳质组、镜质组和惰质组在不同粒级的解离规律,在此基础上使用密度梯度离心的方法研究了显微组分的分选,并验证了超声辅助对分选效果的影响。结果表明:原煤中壳质组分布方式主要以片状、细脉状形式存在,与镜质组紧密连生,轮廓清晰;镜质组主要以团块状形式出现,具有明显内生裂纹;惰质组主要包括丝质体和半丝质体2大类,半丝质体单体粒度较小,部分具有鳞片状结构,丝质体细胞结构保存十分完好。各粒级显微组分单体解离度随着破碎程度的加深逐渐增大,其中破碎对镜质组和惰质组的解离效果更加明显,3种显微组分最佳解离粒度为0.125~0.074 mm。壳质组、镜质组和惰质组的最佳分选密度分别为-1.15,1.27~1.29,1.33~1.35 g·cm-3,超声辅助有利于提高壳质组的分选效果。

关键词：矿物加工工程显微组分密度梯度离心解离规律分选

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定的研究

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兔骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定的研究

作者：王卓实大连医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨体外培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells.MSCs)的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法:选择健康家兔,于胫骨行骨髓穿刺,提取动物骨髓,采用密度梯度离心法分离提取骨髓间充质干细胞,通过贴壁培养筛选、纯化获得... 详细信息

目的:探讨体外培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells.MSCs)的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法:选择健康家兔,于胫骨行骨髓穿刺,提取动物骨髓,采用密度梯度离心法分离提取骨髓间充质干细胞,通过贴壁培养筛选、纯化获得的MSCs,传代培养,对第2、3、4、5、6代MSCs应用MTT法测定生长曲线,分析MSCs的生长规律,对MSCs进行形态学观察,通过流式细胞仪,对CD34、CD45、CD105三种表面抗原进行鉴定,证明所培养的细胞为MSCs。结果:原代培养的MSCs接种12小时后开始贴壁生长,形态为均匀成梭形,生长增殖迅速,符合MSCs生长的特性,7-10天MSCs融合接近80%,传代培养生长良好。MSCs生长曲线呈S型,由生长曲线分析可知,MSCs在培养第3-7天为高速生长期,MSCs在第3-5代生长最为旺盛,并且培养的细胞经流式细胞仪鉴定,CD34(-)、CD45(-)、CD105(+),证明所培养的细胞为较纯的MSCs。结论:应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞,所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。

关键词：骨髓间充质干细胞密度梯度离心细胞培养

利用母血中胎儿有核红细胞进行无创性产前诊断的研究

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利用母血中胎儿有核红细胞进行无创性产前诊断的研究

作者：水丽君华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分妊娠妇女外周血中胎儿有核红细胞的富集实验一密度梯度离心结合显微分离富集母血中胎儿有核红细胞及PEP-PCR鉴定胎源性目的探讨单纯密度梯度离心结合显微操作富集母血中胎儿有核红细胞(FNRBCs)的可行性。方法采集40例妊娠妇... 详细信息

第一部分妊娠妇女外周血中胎儿有核红细胞的富集实验一密度梯度离心结合显微分离富集母血中胎儿有核红细胞及PEP-PCR鉴定胎源性目的探讨单纯密度梯度离心结合显微操作富集母血中胎儿有核红细胞(FNRBCs)的可行性。方法采集40例妊娠妇女外周血,密度梯度离心法初步富集母血中胎儿有核红细胞并涂片,瑞氏染色后镜下观察,寻找阳性细胞并计数。以显微操作法挑取细胞,利用引物延伸预扩增( primer extension preamplification, PEP )及聚合酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR )检测Y染色体性别决定区( sex-determining region of Y-chromosome, SRY )。结果FNRBCs有典型形态特征,胞体较大,核圆,核仁消失,染色质成块状,胞浆丰富,清透。40例孕妇外周血中有31例可见阳性细胞,检出率77.5%。每例检出细胞1～8个,阳性细胞样本中平均检出3.55±1.73个/6 ml血样。PEP-PCR检测所获FNRBCs的SRY基因,阳性符合率76.5%(13/17),阴性符合率100%(14/14),性别总符合率87.1%(27/31)。结论母血中存在胎儿有核红细胞,其具有比较特殊的形态特点,利于辨认识别,无创性获取胎儿细胞的技术完全可行,同时为后续富集提供形态学依据。根据存在漏检和鉴定符合率不足分析,单纯密度梯度离心结合显微操作,存在很大主观性,对试验人员技术要求较高,技术上尚达不到理想推广程度。实验二流式细胞分选术富集母血中胎儿有核红细胞及PEP-PCR鉴定细胞胎源性目的探讨引入流式细胞术富集母血中胎儿有核红细胞(FNRBCs)的可行性,寻找富集FNRBCs的最适方法。方法采集15例正常妊娠妇女外周血,密度梯度离心后,采用FITC-CD71、PE-GPA两种单克隆抗体流式分选FNRBCs,PEP-PCR检测所得细胞SRY基因。结果分选后阳性细胞悬液滴片,荧光显微镜下观察荧光细胞,蓝色激发光下呈现绿色荧光,绿色激发光下可见同一位置FNRBC呈现红色荧光,瑞氏染色后符合FNRBCs形态学特点,细胞检出率100%(15/15),每例检出细胞3个,平均检出阳性细胞5.13±1.68个/6 ml血样。PEP-PCR检测所获FNRBCs的SRY基因,性别符合率100%。结论密度梯度离心结合流式分选可提高母血中胎儿有核红细胞检出率和显微操作成功率,为富集母血中胎儿细胞进行无创性产前诊断的有效方法。第二部分多重PRINS技术检测胎儿有核红细胞染色体目的探讨引物原位杂交PRINS作为快速检测胎儿细胞染色体方法的可行性。方法对分选阳性细胞滴片,采用FITC-12-dUTP、Texas red-12-dUTP标记,应用多重引物原位杂交(Primed in situ labeling, PRINS)技术检测细胞染色体:1.PRINS技术同时检测细胞X、Y染色体;2.PRINS技术同时检测细胞21号、Y染色体。结果1.女胎胎儿有核红细胞可观察到两个红色荧光信号(两个X染色体),男胎胎儿有核红细胞可观察到红色和绿色荧光信号各一个(代表一条X染色体和一条Y染色体;2.女胎胎儿有核红细胞可观察到两个绿色荧光信号(代表两个21染色体)而没有红色荧光信号(代表Y染色体),男胎胎儿有核红细胞可观察到两个绿色荧光信号和一个红色荧光信号(代表两个21染色体和一个Y染色体);6例标本检测结果和实际胎儿核型符合,敏感性和特异性均为100%。结论PRINS技术可有效、准确的检测细胞染色体,经济,快速,结果直观;多重PRINS可同时检测不同染色体,可以作为产前诊断染色体异常的一种比较理想的方法第三部分快速无创性产前诊断唐氏综合征模式拟建及验证目的建立快速无创性产前诊断唐氏综合征有效诊断模式方法拟建模式图,并进行具体实施验证:早中孕妇90名,采取血清三联筛查结合B超和病史选取唐氏高危孕妇8名,当日密度梯度离心结合流式分选富集母血中FNRBCs,次日多重PRINS技术检测细胞21号及Y染色体。结果均可在两日内得到诊断结论:7例正常胎儿,包括男胎2例、女胎5例;诊断男性唐氏患儿一例,PRINS结果可在细胞里观察到三条21染色体和一条Y染色体。8例标本检测结果和实际胎儿核型符合。结论密度梯度离心结合流式分选母血中胎儿细胞,PRINS检测细胞染色体,可作为快速无创性产前诊断胎儿唐氏综合征的有效模式,并可为其他胎儿染色体基因异常或者宫内感染的无创性产前诊断提供参考。

关键词：胎儿有核红细胞密度梯度离心 SRY基因 PEP-PCR 荧光激活流式分选多重PRINS 染色体检测唐氏综合征产前诊断

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多管藻藻胆体中核—膜连接多肽的分析

多管藻藻胆体中核—膜连接多肽的分析

作者：侯翠英烟台大学

学位级别：硕士

本实验以海生大型红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)为材料,利用蔗糖密度梯度离心的技术方法,在高盐条件下提取、分离、纯化藻胆体。利用亚超速蔗糖密度梯度离心,从2%(v/v)Triton X-100增溶和无Triton X-100增溶的两种多管藻藻胆体提... 详细信息

本实验以海生大型红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)为材料,利用蔗糖密度梯度离心的技术方法,在高盐条件下提取、分离、纯化藻胆体。利用亚超速蔗糖密度梯度离心,从2%(v/v)Triton X-100增溶和无Triton X-100增溶的两种多管藻藻胆体提取液中分离制备出了两种位于0.2 mol/L密度带、结构完整的藻胆体。与Trion X-100增溶后制备的藻胆体(NTM-PBSs)相比,无Trion X-100增溶的藻胆体(TM-PBSs)表现出叶绿素a-蛋白复合物的光吸收和荧光光谱特征,表明TM-PBSs是带有类囊体膜Chl a-蛋白复合物的藻胆体。在蔗糖密度梯度超速离心中,TM-PBSs和NTM-PBSs均被进一步分离成2个结构相对稳定的藻胆体组分:一个是位于0.8 mol/L梯度的含量较高、密度较小的藻胆体组分,另一个是位于1.2 mol/L梯度的含量较小、密度较大的藻胆体组分。在TM-PBSs和NTM-PBSs样品SDS-PAGE结果分析中,确定了两个符合藻胆体中核-膜连接多肽(L)结构特征的蛋白,分子质量分别为86.0 kDa和98.9 kDa。当含类囊体膜藻胆体TM-PBSs解离后,这两种蛋白表现为不同的去向:98.9 kDa的蛋白与类囊体膜的结合较强,更趋向于进入类囊体膜组分;而86.0 kDa蛋白与类囊体膜结合较弱,更趋向于分布在藻胆蛋白组分中。2-D SDS-PAGE分析结果显示,98.9kDa和86.0 kDa两个蛋白不携带藻胆蛋白有色亚基,应为两种分子质量不同的L。尿素变性等点聚焦(Urea-IEF)测得L和L的等电点(pI)分别位于pH 6.0.0和pH 7.0.5内。经2-D SDS-PAGE分析进一步确定了具有弱碱性pI(?7.25)、分子质量98.9 kDa、含有藻蓝胆素发色团的有色蛋白是最符合核-膜连接多肽L结构(碱性pI、携带PCB、具有80 kDa20 kDa分子质量)特性的蛋白,即L. 。在Urea-IEF中位于藻胆蛋白亚基区域、分子质量86.0 kDa的有色蛋白,所表现的弱酸性pI(?5.35)是否有来自弱酸性亚基的影响还需进一步研究确定。在Blue-native PAGE和hrClear-native PAGE非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中均观察到了可能为AP-L组分蛋白带,为了进一步确定所观察到的这些蛋白中是否含有L和L及AP亚基α和β,还需进行2-D SDS-PAGE予以确定。

关键词：多管藻藻胆体核-膜连接多肽藻胆蛋白密度梯度离心凝胶电泳

一氧化氮对悬浮红细胞保存质量影响及糖酵解代谢关系的研究

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一氧化氮对悬浮红细胞保存质量影响及糖酵解代谢关系的研究

作者：张警丹北京协和医学院

学位级别：硕士

红细胞(red blood cell, RBC)输注效果与红细胞保存质量有着密切的关系。针对红细胞保存质量难以再提高的问题,有研究结果显示,给保存期长的红细胞补充一氧化氮(nitric oxide, NO)可以明显改善红细胞的变形性及输注后效果。本实验室在... 详细信息

红细胞(red blood cell, RBC)输注效果与红细胞保存质量有着密切的关系。针对红细胞保存质量难以再提高的问题,有研究结果显示,给保存期长的红细胞补充一氧化氮(nitric oxide, NO)可以明显改善红细胞的变形性及输注后效果。本实验室在前期研究的基础上,推测NO可能通过某些特定细胞群的作用来提高整体红细胞保存质量。目的：研究外源性NO药物供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)和前体L-精氨酸(L-arginie, L-arg)对红细胞不同保存时期质量的影响,且探究NO与红细胞糖酵解代谢的关系以此来阐明NO作用于红细胞的部分机理。方法：密度梯度离心法分离已孵育1h不同浓度的SNP和L-arg的红细胞,通过检测红细胞变形性和渗透脆性来分别确立SNP和L-arg的最佳添加浓度。在不同保存时期添加最佳浓度的NO的红细胞经密度梯度分离后,检测分层后各层红细胞数目比例、丙酮酸激酶、变形性、渗透脆性等指标。D.L甘油醛(D.L glyceraldehyde, DL-GA)是目前公认的最理想的糖酵解抑制剂,它能特异性抑制丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)和己糖激酶(hexokinase, HK)活性从而达到抗糖酵解的目的。将保存末期的红细胞内分为6组,1组为对照组,2组为D.L甘油醛,3组为SNP,4组为D.L甘油醛加SNP,5组为L-arg,6组为D.L甘油醛加L-arg,孵育2h后密度梯度分离后洗涤2次所得的各层红细胞及未分层红细胞,分别检测变形性、PK、HK活性。结果：保存初期和中期的红细胞在添加10l,M的SNP或L-arg后,其变形性和渗透脆性改善效果明显,末期最佳浓度则为100μM。保存末期的红细胞数目比例在加入NO后2,3层红细胞增加,各层红细胞的天龄也在加入NO后有明显降低,其他指标均发现第4层细胞和保存末期红细胞在加入NO后有明显改善,其他红细胞没有明显的改变或规律性。保存末期的SNP或L-arg能明显提高各层红细胞的变形性、PK和HK活性,在此基础上添加D.L甘油醛能够降低上述指标。结论：保存初期和中期的红细胞SNP和L-arg的最佳浓度均为10μM,末期最佳浓度为NO仅对老化或保存损伤红细胞的保存质量有明显改善,对年轻红细胞没有规律性作用。NO能通过促进红细胞的糖酵解代谢从而提高红细胞的保存质量。

关键词：硝普钠 L-精氨酸一氧化氮密度梯度离心 D.L甘油醛