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家蚕几丁质去乙酰化酶BmCDA2的基因表达和免疫定位

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生物工程学报 2023年第4期39卷 1655-1669页

作者：何允陈怡菲王清浪张自钰董浩南申太霞侯勇龚竞西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400715 西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院重庆400715 西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心重庆400715

几丁质的去乙酰化修饰与昆虫的发育变态密切相关,几丁质去乙酰化酶(chitin deacetylase,CDA)是这个过程中的关键酶。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的代表性昆虫,目前对家蚕CDAs的研究较少。为了更好地揭示BmCDAs对家蚕变态发育的作用,... 详细信息

几丁质的去乙酰化修饰与昆虫的发育变态密切相关,几丁质去乙酰化酶(chitin deacetylase,CDA)是这个过程中的关键酶。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的代表性昆虫,目前对家蚕CDAs的研究较少。为了更好地揭示BmCDAs对家蚕变态发育的作用,本研究采用生物信息学分析、蛋白表达纯化以及免疫荧光定位等方法对表皮中高量表达的BmCDA2进行了研究。结果发现,BmCDA2有两种mRNA拼接形式BmCDA2a和BmCDA2b,分别在幼虫眠期和化蛹期表皮高量表达,两个基因均有几丁质去乙酰化酶催化结构域(catalytic domain)、几丁质结合结构域(chitin binding domain)和低密度脂蛋白受体结构域(low density lipoprotein receptor domain);Western blotting结果显示,该蛋白在表皮存在,荧光免疫定位发现BmCDA2蛋白随着幼虫新表皮的生成而逐渐增多,推测BmCDA2可能参与了幼虫新表皮的形成。该结果丰富了家蚕CDAs的生物学功能信息,也为其他昆虫CDA的研究提供一些有价值的参考。

关键词：家蚕几丁质去乙酰化酶2 原核表达免疫荧光定位

家蚕热休克蛋白HSP90相互作用蛋白的筛选与鉴定

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中国农业科学 2022年第6期55卷 1253-1262页

作者：龙艳碧吴云飞张倩陈鹏潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室西南大学农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室

【目的】HSP90 是热休克蛋白家族的成员之一，在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用，已有研究表明 HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖，但作用机制尚不清楚。本研究通过鉴定 BmHSP90... 详细信息

【目的】HSP90 是热休克蛋白家族的成员之一，在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用，已有研究表明 HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖，但作用机制尚不清楚。本研究通过鉴定 BmHSP90 的相互作用蛋白，为其促进 BmNPV 增殖的作用机制解析提供参考。【方法】构建连接在 pIZ/V5-His 的BmHSP90HA真核过表达载体，在家蚕 BmN-SWU1 细胞中转染 48 h 后，感染 BmNPV 继续培养 48 h 后收集蛋白，保留总蛋白后将这些蛋白均分两管，进行免疫共沉淀，分别用抗 HA 抗体和 IgG 抗体钓取相互作用蛋白，对蛋白胶进行硝酸银染色后，获取差异条带并做质谱分析，将质谱结果与信息分析结合进行候选互作蛋白筛选，并克隆鉴定互作蛋白。通过免疫荧光验证 HSP90 与互作蛋白的共定位情况，并进一步采用免疫共沉淀试验确定其是否存在相互作用关系。【结果】硝酸银染色结果显示，试验组与对照组在 90、70 和 60 kD 附近处存在差异条带，并验证了 90 kD 处的差异条带为诱饵蛋白；将另外两条差异带进行质谱分析，共鉴定到 7 个候选相互作用蛋白，通过分析选择其中两个候选蛋白作后续研究，分别为Tubulin-specific chaperone E(Tbce)和 Golgin subfamily A member 5(Golga5)。BmTbce 的最大开放阅读框长度为 1 728bp，编码 576 个氨基酸，BmGolga5 的最大开放阅读框长度为 1 854 bp，编码 618 个氨基酸；同源比对和系统进化树显示 BmTbce的微管结合结构域(cytoskeleton-associated protein-glycine-rich,CAP-Gly)位于 N 端且在不同物种之间保守性较高，BmGolga5 的跨膜区(transmembrane domain,TMD)位于 C 端，也较为保守；荧光共定位显示 BmHSP90 与 BmTbce 和 BmGolga5在细胞质中发生共定位，并进一步通过免疫共沉淀证明 BmHSP90HA和 BmTbceFlag、BmHSP90HA和 BmGolga5Flag具有相互作用关系。【结论】经过筛选与鉴定，在 BmNPV 感染家蚕细胞的过程中，与家蚕热休克蛋白 HSP90 发生相互作用的蛋白为 BmTbce 和BmGolga5。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒 HSP90 Tbce Golga5

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家蚕人工饲料给料装置设计与试验

蚕业科学 2024年

作者：李林波祝诗平石洪康西南大学工程技术学院宜宾西南大学研究院四川省农业科学院蚕业研究所

为解决人工饲料养蚕过程中饲料投料问题，根据家蚕养殖要求和人工饲料特点，模拟手工刀切动作，设计了一种人工饲料养蚕给料装置。该装置采用曲柄滑块、曲柄摇杆及单向传动机构，实现刀具往复切削和单向步进送料动作协同。对该装置的传... 详细信息

为解决人工饲料养蚕过程中饲料投料问题，根据家蚕养殖要求和人工饲料特点，模拟手工刀切动作，设计了一种人工饲料养蚕给料装置。该装置采用曲柄滑块、曲柄摇杆及单向传动机构，实现刀具往复切削和单向步进送料动作协同。对该装置的传动机构展开设计与分析，确定影响其工作性能的主要影响因素为饲料含水率、饲料块高度、输送带步进距离。建立虚拟样机并进行运动仿真，获得刀具位移和摇杆摆角曲线。以投料均匀度为评价指标，利用Box-Behnken试验方法，开展3因素3水平正交试验。结果表明，该装置优化参数组合为饲料含水率62%、饲料块高度40 mm、输送带步进距离6 mm，投料均匀度为90.7%，研究结果可为人工饲料养蚕给料设备的研发提供参考。

关键词：家蚕人工饲料养蚕设备给料装置

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家蚕雌蛹及其卵巢脂肪酸丰度分析

西南大学学报（自然科学版） 2024年第2期46卷 90-100页

作者：贺逍郝丽余华献李修志申子刚陈萍西南大学蚕桑纺织与与生物质科学学院重庆400715 资源昆虫高效养殖与利用全国重点实验室重庆400715 重庆市蚕业管理总站重庆400020

研究使用气相色谱分析了家蚕雌蛹蛹体和卵巢中的脂肪酸丰度.结果显示,蛹化后的第1 d至第6 d,蛹体脂肪酸丰度的变化幅度小,第6 d至第9 d,蛹体脂肪酸丰度的变化幅度大.蛹化期间,主要脂肪酸丰度总体呈下降趋势,微量脂肪酸丰度呈上升趋势.... 详细信息

研究使用气相色谱分析了家蚕雌蛹蛹体和卵巢中的脂肪酸丰度.结果显示,蛹化后的第1 d至第6 d,蛹体脂肪酸丰度的变化幅度小,第6 d至第9 d,蛹体脂肪酸丰度的变化幅度大.蛹化期间,主要脂肪酸丰度总体呈下降趋势,微量脂肪酸丰度呈上升趋势.卵巢脂肪酸丰度的变化幅度随发育递减.不同主要脂肪酸的变化幅度和方向各异,其中不饱和脂肪酸丰度增加,饱和脂肪酸丰度下降.微量脂肪酸丰度随发育明显下降,这表明微量脂肪酸与雌性生殖关联较小.蛹体和卵巢脂肪酸丰度的差异随发育逐渐缩小,至蛹化第6 d,卵巢中绝大部分的脂肪酸丰度与刚蛹化时有很大差异,但整体上与蛹体丰度相似,说明卵巢脂肪酸的积累依赖蛹体脂肪酸.蛹化后期,卵巢中丰度最高的α-亚麻酸出现下降,丰度次高的油酸明显增加,这可能与卵壳生成和卵子成熟有关;亚油酸在蛹化第6 d丰度差异最大,其在卵巢中的丰度显著增加并明显高过蛹体,表明卵巢具有为其发育以及卵子发生积累脂肪酸的特性.研究结果可为深入研究脂肪酸在家蚕和其他昆虫雌性生殖中的作用机制提供重要线索.

关键词：家蚕雌蛹卵巢脂肪酸丰度

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家蚕卵滞育人工解除方法及机理研究进展

蚕业科学 2024年

作者：孙溱博刘吉平廖森泰杨琼肖阳李庆荣邢东旭华南农业大学动物科学学院广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所

卵滞育是家蚕应对周期性不利自然环境表现出的一种在胚胎形成早期发育停滞的生理现象。为满足蚕业生产需要，通常使用产后盐酸浸渍方法以快速解除滞育。由于使用盐酸存在一定的安全隐患，研究更加安全环保的新方法具有重要意义。此外，... 详细信息

卵滞育是家蚕应对周期性不利自然环境表现出的一种在胚胎形成早期发育停滞的生理现象。为满足蚕业生产需要，通常使用产后盐酸浸渍方法以快速解除滞育。由于使用盐酸存在一定的安全隐患，研究更加安全环保的新方法具有重要意义。此外，家蚕既是重要的经济昆虫，也是鳞翅目模式生物，研究其滞育解除的生理变化与分子调控机制，有望育成非滞育系家蚕新品种。本文综述分析了各种人工解除滞育方法的优势和缺陷，并总结了滞育解除的生理生化及分子机制，以期为研究人工解除蚕卵滞育提供参考。

关键词：家蚕胚胎滞育人工孵化滞育机理

家蚕BmVNCP基因表达与BmNPV感染增殖相关性的鉴定分析

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蚕业科学 2022年第4期48卷 293-301页

作者：邵露璐何小柏高娟宋秋云张业顺方瑷武康晖王学杨张国政江苏科技大学生物技术学院江苏镇江212100 中国农业科学院蚕业研究所农业农村部蚕桑遗传改良重点实验室江苏镇江212100

为解析家蚕AN品系高抗BmNPV的分子机制,采用家蚕抗性品系AN与易感品种C108杂交及多代回交,结合累代BmNPV攻毒选择,构建了高抗BmNPV的近等基因系C108_AN;在5龄起蚕经口添食BmNPV多角体1×10^(8) mL^(-1)悬浊液浸渍桑叶对C108及C108_AN攻... 详细信息

为解析家蚕AN品系高抗BmNPV的分子机制,采用家蚕抗性品系AN与易感品种C108杂交及多代回交,结合累代BmNPV攻毒选择,构建了高抗BmNPV的近等基因系C108_AN;在5龄起蚕经口添食BmNPV多角体1×10^(8) mL^(-1)悬浊液浸渍桑叶对C108及C108_AN攻毒,对感染后12、24、36、48、60 h的中肠组织进行转录组测序发现,C108_AN样本中检出BmNPV基因个数与表达量均大幅减少,病毒虽然能够侵染但不能完成复制;转录组中编码230 aa的家蚕病毒核衣壳蛋白基因(命名为BmVNCP)在C108_AN样本中显著高表达,表明与BmNPV抗性可能具有关联性。在BmN细胞中过表达BmVNCP基因可以抑制BmNPV的增殖,在BmN细胞中进行靶向BmVNCP的CRISPR/Cas9基因编辑,未能观察到BmNPV增殖和vp39基因表达的稳定增加;BmN细胞内过表达BmVNCP基因可以明显提高宿主IMD信号通路中Dredd基因的表达水平,对FADD基因转录水平无影响,PGRP-LB和PGRP-LF基因表达量极低以致qRT-PCR无法检出。综合分析上述结果认为,家蚕细胞或组织中BmVNCP基因高水平表达不能够阻止BmNPV侵染,但能够降低BmNPV侵染后病毒基因的表达以及病毒增殖,BmVNCP基因产物可能是通过IMD信号通路触发免疫机制。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒家蚕病毒核衣壳蛋白基因基因过表达病毒感染病毒增殖

家蚕C型溶菌酶的真核表达及其抗BmNPV活性

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蚕业科学 2024年

作者：郭意瑶费世港黄一桂梁玲瑛孔逸冰冯敏华南农业大学动物科学学院

溶菌酶(lysozyme)是一种能选择性地使微生物细胞壁溶解，从而对生物体本身有保护作用的酶类。目前研究表明，溶菌酶有抗菌消炎、抗病毒和增强免疫力等作用，尤其是溶菌酶的抗病毒作用近年备受关注。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuc... 详细信息

溶菌酶(lysozyme)是一种能选择性地使微生物细胞壁溶解，从而对生物体本身有保护作用的酶类。目前研究表明，溶菌酶有抗菌消炎、抗病毒和增强免疫力等作用，尤其是溶菌酶的抗病毒作用近年备受关注。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是一类典型的环状双链DNA杆状病毒，对蚕业生产造成严重危害。前期的研究已经发现家蚕溶菌酶基因（Bombyx mori C-lysozyme，BmC-LZM）的干扰和过表达均能影响BmNPV的复制。然而，BmC-LZM重组蛋白是否能抑制BmNPV的增殖复制，目前尚未见报道。本研究利用哺乳动物细胞CHO系统表达了BmC-LZM重组蛋白，通过SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定，经Ni-TED纯化，与BmNPV共同孵育后，处理BmN细胞和注射家蚕幼虫，检测BmC-LZM重组蛋白对BmNPV增殖的影响。实验结果显示，BmC-LZM重组蛋白与BV孵育作用后，处理过的BV在BmN细胞和家蚕幼虫的增殖都受到显著抑制。本研究结果可为溶菌酶作为抗病毒因子的研究和应用提供借鉴。

关键词：家蚕溶菌酶家蚕核型多角体病毒真核表达

家蚕RNAi效率相关核酸酶基因对RNAi效率的影响

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昆虫学报 2023年第3期66卷 303-311页

作者：陈咏琪尹延萍冯嘉伟白新宇李庆荣钟仰进杨婉莹华南农业大学动物科学学院广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室广州510642 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所广州510610

【目的】鳞翅目(Lepidoptera)昆虫消化系统存在的核酸酶是导致RNAi低效的主要原因之一,本研究旨在探索家蚕Bombyx mori RNAi效率相关核酸酶(RNAi efficiency-related nuclease, REase)BmREase对家蚕RNAi低效的影响。【方法】利用RT-PCR... 详细信息

【目的】鳞翅目(Lepidoptera)昆虫消化系统存在的核酸酶是导致RNAi低效的主要原因之一,本研究旨在探索家蚕Bombyx mori RNAi效率相关核酸酶(RNAi efficiency-related nuclease, REase)BmREase对家蚕RNAi低效的影响。【方法】利用RT-PCR对家蚕BmREase cDNA全长序列进行同源克隆和生物信息学分析,并采用最大似然法进行系统发育分析;利用qRT-PCR检测BmREase在游走期家蚕不同组织(头、表皮、脂肪体、中肠、气管、马氏管和丝腺)中的特异性表达。通过向游走期家蚕注射BmREase,家蚕蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)基因BmEcR,超气门蛋白(ultraspiracle, USP)基因BmUSP和细胞因子sp?tzle1(BmSpz1)基因BmSpz1的dsRNA进行RNAi,分析干扰BmREase表达后是否可以提高靶基因dsRNAs的干扰效率。【结果】RT-PCR扩增得到家蚕BmREase(GenBank登录号:XM_021350017.2)全长cDNA序列,其ORF长2 241 bp,编码746个氨基酸残基;生物信息学分析发现,BmREase与人核酸外切酶I 3qe9.1具有极其相似的结构,其Thr7, His33, Ala37, Arg93, Lys97, Tyr159, Asp160, Ser161和Asn174组成的活性结构域能够与核苷酸序列结合,暗示BmREase具有核酸酶活性。qRT-PCR结果显示,BmREase在家蚕游走期的中肠和马氏管中高表达,说明BmREase主要在家蚕消化系统中表达。在家蚕游走期注射dsRNA,BmREase的表达量比空白对照组的高,RNAi干扰BmREase提高了dsBmEcR, dsBmUSP和dsBmSpz1的干扰效率。【结论】家蚕体内存在与人类核酸外切酶相似功能的酶BmREase,其存在可能影响dsRNA在家蚕体内的干扰效果。本研究为利用RNAi进行家蚕基因功能的研究以及进一步开发RNAi防治害虫具有指导性意义。

关键词：家蚕 RNA干扰 dsRNA RNAi效率相关核酸酶 BmREase dsRNA外切酶

家蚕Piwi亚家族基因的克隆、表达及进化分析

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环境昆虫学报 2022年第4期44卷 838-849页

作者：刘飞玲廖珍洪喜雄彭睿智肖花美李飞宜春学院生命科学与资源环境学院江西省作物生长发育调控重点实验室江西宜春336000 浙江大学昆虫科学研究所杭州310058 南京农业大学植物保护学院南京210095

为克隆家蚕Bombyx mori Piwi亚家族蛋白基因cDNA全长序列,分析其分子特征和表达模式,探究Piwi亚家族蛋白在家蚕中的生理功能,本研究利用已知物种的Piwi亚家族蛋白搜索家蚕基因组,预测获得家蚕Piwi亚家族蛋白基因siwi1和siwi2,采用RACE... 详细信息

为克隆家蚕Bombyx mori Piwi亚家族蛋白基因cDNA全长序列,分析其分子特征和表达模式,探究Piwi亚家族蛋白在家蚕中的生理功能,本研究利用已知物种的Piwi亚家族蛋白搜索家蚕基因组,预测获得家蚕Piwi亚家族蛋白基因siwi1和siwi2,采用RACE技术克隆siwi1和siwi2的全长cDNA序列,利用ORFfinder、Gene-Explorer、InterPro等分析其分子特征;其次,利用已知的所有物种Piwi蛋白及其类似物Piwil构建系统发育树;最后,通过荧光定量PCR技术检测了siwi1和siwi2在丝腺、马氏管、中肠、头部、卵巢和精巢以及不同发育时期(卵、1~5龄幼虫、蛹、成虫)的表达水平,结果显示,克隆获得了siwi1 cDNA全长3277 bp,包含部分5′UTR、完整的开放阅读框ORF和3′UTR,获得了siwi2的部分序列,其中siwi1对应BmPiwi,siwi2对应BmAgo3。系统发育结果显示,家蚕Piwi亚家族蛋白与乳草长蝽Oncopeltus fasciatus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、橘小实蝇Bactrocera dorsalis、优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa、斯氏按蚊Anopheles stephensi、褐飞虱Nilaparvata lugens的PIWI蛋白以及东亚飞蝗Locusta migratoria的PIWI2和PIWI3蛋白亲缘关系最近,和三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的PIWI2和PIWI3同为一支。家蚕AGO3蛋白与小菜蛾Plutella xylostella的AGO3亲缘关系最近,与西方玉米根虫Diabrotica virgifera virgifera、白蜡窄吉丁Agrilus planipennis的AGO3及东亚飞蝗Locusta migratoria的PIWI1同属一支,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的AGO3同属一总支。组织表达结果表明BmPiwi在精巢表达水平显著高于其他组织,其次是卵巢及头部,而BmAgo3在头部表达水平显著高于其他组织。BmPiwi和BmAgo3在卵期表达量最高,但在初孵幼虫中表达量迅速下降,并在整个幼虫时期都维持低表达状态,直至蛹期开始表达量出现大幅回升,并维持高水平表达至成虫期。本研究发现BmPiwi和BmAgo3在家蚕中的表达具有明显的时空特异性,在生殖组织以及需要进行大量细胞活动的时期,家蚕Piwi亚家族蛋白基因的表达均发生了明显的变化,为进一步探测家蚕Piwi亚家族的生理功能提供了研究方向和理论基础。

关键词：家蚕 Piwi亚家族蛋白分子克隆进化分析表达谱