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羊呼吸道病原宏病毒组学研究及羊源BRBV定量rt-pcr检测方法的建立

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羊呼吸道病原宏病毒组学研究及羊源BRBV定量RT-PCR检测方法的建立

作者：李阳内蒙古农业大学

学位级别：硕士

羊的呼吸系统疾病发生在羊的各个阶段,该病的死亡率和发病率居高不下,是阻碍养羊业发展的重要因素。为了解内蒙古乌兰察布市部分散养户健康羊呼吸道的病毒携带情况,进一步发掘潜在的新病原,本文通过宏基因组学和生物信息学技术,对羊呼... 详细信息

羊的呼吸系统疾病发生在羊的各个阶段,该病的死亡率和发病率居高不下,是阻碍养羊业发展的重要因素。为了解内蒙古乌兰察布市部分散养户健康羊呼吸道的病毒携带情况,进一步发掘潜在的新病原,本文通过宏基因组学和生物信息学技术,对羊呼吸道病毒种群进行全面分析,并对新发现的潜在病原建立荧光定量rt-pcr检测方法。结果表明,本试验6个羊鼻拭子样本经宏病毒组测序,共检测到16个病毒科和39个病毒属,其中注释到了小核糖核酸病毒、羊疱疹病毒2型、羊星状病毒、山羊星状病毒和羊源牛鼻炎B病毒,并以疱疹病毒2型和羊源牛鼻炎B病毒为主。宏基因组测序成功获得1条羊源牛鼻炎B病毒的全基因组序列,并将其上传到NCBI上,登录号为OQ547742.1。将得到的全基因组序列与牛鼻炎病毒、马鼻炎病毒和人鼻炎病毒进行遗传进化分析,同已发表的17条牛鼻炎B病毒序列核苷酸同源性在75.7%～81.5%之间,其中美国株BRBV D2(登录号为OL410605.1)和该序列的同源性最高;而已发表的4条人鼻病毒序列和8条马鼻病毒序列与该序列的核苷酸同源性较低,分别为36.3%～37.1%和35.2%～47.3%。遗传分析显示,JN022 BRBV独立形成一个分支,与澳大利亚毒株的4个毒株NSWL12、NSWL15、NSWL6和NSWL7亲缘关系较近。根据羊源BRBV的VP2基因设计合成了一对引物和探针,建立了检测羊源BRBV的Taq Man荧光定量rt-pcr方法。该方法的标准曲线呈现良好线性关系,斜率为-3.166,R值为0.999,扩增效率(E)为106.9%;敏感性高,最低可以检测到2.5copies/μL;特异性强,在其他参考菌毒株中只有羊源BRBV出现了扩增曲线;稳定性强,组内组间变异系数均小于2%。应用建立的方法对23份鼻拭子样本进行检测,羊源BRBV阳性率为56.5%,平均病毒载量为1.1×10copies/μL。本研究初步了解到乌兰察布市部分散养户羊呼吸道主要病毒携带情况,首次在羊的鼻拭子中发现牛鼻炎B病毒,并对其建立了灵敏、特异、稳定的荧光定量rt-pcr检测方法,为羊呼吸道疾病开展相关流行病学调查提供了科学依据和方法。

关键词：羊呼吸道疾病羊源牛鼻炎B病毒宏病毒组定量rt-pcr

用定量rt-pcr方法检测脑梗死半影区内凋亡相关基因的表达

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中国老年学杂志 2006年第6期26卷 790-793页

作者：刘雁高曲文彭凯润杨红军广州军区广州总医院神经内科广东广州510010

目的建立脑梗死后脑组织凋亡相关基因表达定量检测的精确、可靠的方法。方法采用SYBR Green荧光定量rt-pcr法,结合免疫组织化学,测定自发性高血压大鼠脑梗死后不同时相点几种凋亡相关基因的表达水平,包括:caspase3/CPP32、rIAP、caspase... 详细信息

目的建立脑梗死后脑组织凋亡相关基因表达定量检测的精确、可靠的方法。方法采用SYBR Green荧光定量rt-pcr法,结合免疫组织化学,测定自发性高血压大鼠脑梗死后不同时相点几种凋亡相关基因的表达水平,包括:caspase3/CPP32、rIAP、caspase2等,同时比较其与半影区凋亡细胞数的相关性。结果在脑梗死半影区,凋亡细胞数量自3h开始逐渐升高,24h达到高峰,然后保持较高水平。而caspase3/CPP32自8h才升高,12h达到高峰,3d时便迅速回落到正常水平,而rIAP,在8h升高一倍,然后迅速降至正常,caspase2表达水平在脑梗死后与假手术组比较无明显改变。结论caspase3/CPP32是影响神经元凋亡的重要因素,但非唯一的和必不可少的,在脑缺血后,caspase3/CPP32等的激活或许与神经元凋亡的加重有关。

关键词： caspase 3/CPP32 rIAP caspase 2 脑缺血定量rt-pcr

定量rt-pcr检测肝细胞P450酶基因与苦参的关系

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上海第二医科大学学报 2004年第2期24卷 91-93页

作者：陈曙霞谢龙山钱富荣钱培丽张君玮邓中平陈美芳上海第二医科大学仁济医院心内科上海200001 国家上海市新药安全评价中心

目的明确肝脏微粒体中细胞色素P450酶活性与苦参中对抗CVB病毒的有效成分抗柯注射液药物剂量及用药时间的关系。方法用定量rt-pcr法,在Begale犬长毒试验的不同时期(45、90、135 d),用不同剂量抗柯注射液(7.5、15、30 mg/kg)检测肝脏... 详细信息

目的明确肝脏微粒体中细胞色素P450酶活性与苦参中对抗CVB病毒的有效成分抗柯注射液药物剂量及用药时间的关系。方法用定量rt-pcr法,在Begale犬长毒试验的不同时期(45、90、135 d),用不同剂量抗柯注射液(7.5、15、30 mg/kg)检测肝脏微粒体中细胞色素P450酶基因(β-actin/P450)的特异mRNA。结果 P450酶基因(β-actin/P450)特异信使核糖核酸mRNA随所用抗柯注射液剂量及用药时间而增加(P<0.01)。结论 P450的比值随药物剂量及时间延长而上升,可视为机体抵抗中毒而作出的一种适应性反应,可用于有关药物的毒理研究。

关键词：定量rt-pcr 检测肝细胞 P450酶基因苦参

联用阴性和阳性免疫磁珠及定量rt-pcr检测胃癌外周血微转移

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联用阴性和阳性免疫磁珠及定量RT-PCR检测胃癌外周血微转移

作者：张新军浙江大学

学位级别：硕士

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤，每年死于胃癌的人数约有16万，其死亡率占全部恶性肿瘤死亡率的1／3，居恶性肿瘤死亡率的第一位，是我国较长时间内恶性肿瘤防治的重点。目前临床上对中晚期胃癌患者的治疗仍无明显突破，手术治疗仍然是其... 详细信息

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤，每年死于胃癌的人数约有16万，其死亡率占全部恶性肿瘤死亡率的1／3，居恶性肿瘤死亡率的第一位，是我国较长时间内恶性肿瘤防治的重点。目前临床上对中晚期胃癌患者的治疗仍无明显突破，手术治疗仍然是其主要手段，约90％死于复发和转移相关的并发症，而肿瘤的微转移是其复发和转移的主要原因。肿瘤的微转移一般是指恶性肿瘤在发展过程中，肿瘤细胞播散并存活于血循环、淋巴道、骨髓及各组织器官中，尚未形成转移结节，无任何临床表现，常规检查方法如影像、病理等难以发现。虽然进入血液循环的癌细胞并不一定都存活，人体内也存在多种因素制约恶性肿瘤的生长，但其自身的生物学特性将决定其发生转移的倾向。血液中瘤细胞的存在是肿瘤血行转移的物质基础，及时发现肿瘤患者血液中的微转移不仅对肿瘤转移和复发的判断有重要意义，而且对指导临床综合治疗亦有重要价值。因此，早期、有效地发现、监测和清除血液中的微量肿瘤细胞是防治肿瘤复发的重要手段。由于血液循环中肿瘤细胞数量极少，检测其存在非常不易。检测外周血中的微量肿瘤细胞，有两个问题需要解决：一是要有肿瘤特异性的生物标记;二是要有灵敏度高的检测方法。只有很好地解决了这两个问题，才能从大量的血液细胞中检测到极微量的肿瘤细胞。 20世纪80年代初期，Ugelstad等首先使用磁性微粒分离细胞，后由挪威Dynal公司生产免疫磁珠用于分离各种细胞。使用免疫磁珠筛选外周血存在的非造血系统恶性肿瘤细胞的策略有2种：阳性筛选和阴性筛选。前者用被分离物质的抗体包埋免疫磁珠，后者用混合成分中的其它物质的抗体包埋免疫磁珠。在肿瘤研究和临床领域，浙江大学硕士学位论文免疫磁珠显示出广泛的应用一前景，它不仅可以富集肿瘤细胞用于诊断，而且可以除掉血液中的癌细胞，使癌症患者自体输血成为可能。逆转录一聚合酶链反应(reverse transeript一polymerasee卜a一in reaetion，附一氏附具有敏感性高、特异性强的优点，使检测外周血中的少量癌细胞成为可能。国内外已有一用R丁一尸C尺方法检测癌细胞的报道，其灵敏度达10一弓，明显优于检测淋巴结中肿瘤细胞的方法。本研究先后采用免疫磁珠阴性筛选和阳性筛选方法富集癌细胞，然后以癌胚抗原（earcinoembryonic antigen，CEA）ml之NA 水平，以评价联合应用免疫磁珠和尺T一PC尺值。为标志分子用荧光定量rt一pcr技术检测其技术检测胃癌患者外周血微转移的应用价材料与方法入选对象为2002年8月一2003年8月在宁波大学医学院附属医院住院的经病理学检查确诊的胃癌患者，其中男26例，女巧例;年龄48岁一93岁，平均67岁;临床分期为I期7例，11期8例，111期10例，W期16例。良性胃病对照为10例胃溃疡患者，男6例，女4例:年龄50岁一82岁，平均61岁。5例正常对照为健康献血人员。首先将人胃癌MGC一803细胞以不同浓度加入到健康人外周血中，其次用淋巴细胞分离液收集单核细胞，然后等分成4份分别用4种方法处理:直接扩增（A方法）、抗人CD45阴性磁珠筛选（B方法）、抗人Ber一EP4阳性磁珠筛选（C方法）及联用阴性和阳性磁珠筛选（O方法），最后用实时定量rt一陀R检测pZ微球蛋白（pZ microglob。lin，p，MG）mRNA和癌胚抗原（CEA）mRNA并计算出相对CEAmRNA值。用上述4种方法分别测定41例胃癌、10例良性胃病患者和5例健康人外周血CEA mRNA。以SPSS10.O软件进行统计学处理:阳性率的比较采用x’检验;CEA mRNA拷贝数以丁士S表示;组间比较采用方差分析;组间两两比较采用q检验。以尸＜0.05为差异有显著性意义。结果 1.参照模型中D方法测出的相对CEA mRNA值（CEA mRNA/p:MG mRNA）均小于A、B和C方法测出的，其

关键词：免疫磁珠定量rt-pcr 胃癌微转移外周血

定量rt-pcr法对“苦参”在心肌炎模型中药效学研究

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上海第二医科大学学报 2003年第1期23卷 1-4页

作者：陈曙霞成威谢龙山钱富荣陈美芳刘晶星上海第二医科大学仁济医院心内科上海200001 上海第二医科大学微生物教研室

目的用定量rt-pcr法检测“苦参”中抗柯萨奇B病毒有效成份“抗柯注射液”,在Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型病毒血症时,对抗“柯萨奇B病毒”的药效。方法取48只雄性18-22g 8周龄的Balb/c小鼠,随机分成A-H共8组,每组6只。1.各治疗组(A-F组)... 详细信息

目的用定量rt-pcr法检测“苦参”中抗柯萨奇B病毒有效成份“抗柯注射液”,在Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型病毒血症时,对抗“柯萨奇B病毒”的药效。方法取48只雄性18-22g 8周龄的Balb/c小鼠,随机分成A-H共8组,每组6只。1.各治疗组(A-F组),每只小鼠从腹腔接种0.1ml l04TCID50 CVB3m病毒2h后,每天从尾静脉分别注射抗柯注射液,5、10、15、20、25、30mg/kg,2次/d,连续用药3d。2.病毒组(G组),注射病毒同上法,2h后从尾静脉注入0.3ml无菌生理盐水,2次/d,连续3d。3.空白对照组(H组),腹腔内注射无小牛血清的RPMI-1640培养液,2h后从尾静脉注入0.3ml无菌生理盐水,2次/d,连续3d。结果空白组CVB-RNA(-)对接种CVB3m感染后用不同剂量“抗柯注射液”治疗的各小组血液中CVB3m-RNA含量与病毒组相比明显下降,其抑制率(％)与所用抗柯注射液的剂量呈正比,即“抗柯”剂量增加,CVB3m-RNA含量下降的幅度亦增加,每天5-30mg,/kg中的各剂量都有明显抑制病毒增殖的作用。结论用定量rt-pcr法检测到“抗柯注射液”对Balb/c小鼠病毒性心肌炎病毒血症时效果明显,最小有效剂量为5mg·kg-1·d-1。

关键词：苦参抗柯注射液柯萨奇B病毒定量rt-pcr 病毒性心肌炎动物模型

牛轮状病毒定量rt-pcr检测方法的建立及VP6基因的遗传性分析

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牛轮状病毒定量RT-PCR检测方法的建立及VP6基因的遗传性分析

作者：丽平内蒙古农业大学

学位级别：硕士

牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）又称犊牛腹泻病毒（Calf diarrhea virus）,主要感染1月龄以内的犊牛,其中一周龄以内的犊牛最容易感染。该病发病迅速,传播范围广,容易形成大面积流行。为了快速准确的诊断BRV,本研究参考GenBank上... 详细信息

牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）又称犊牛腹泻病毒（Calf diarrhea virus）,主要感染1月龄以内的犊牛,其中一周龄以内的犊牛最容易感染。该病发病迅速,传播范围广,容易形成大面积流行。为了快速准确的诊断BRV,本研究参考GenBank上的牛轮状病毒 Sun9 分离株（AB-374146.1）、KJ9-1 分离株（HM-988974.1）、KJ19-2分离株（MF-940662）、KV0418 分离株（EU873011.1）、KV0426 分离株（EU873012.1）和M-1分离株（HM235508.1）的VP6全基因序列,在VP6基因保守序列上设计一对特异性引物和一个探针,建立BRV定量rt-pcr检测方法。另外再设计一对牛轮状病毒VP6基因特异性引物,并克隆VP6全基因,测定序列并进行遗传分析,通过遗传分析,可发现本地流行毒株的情况。试验结果显示,本研究建立的牛轮状病毒定量rt-pcr检测方法,最佳引物浓度为400 nmoL/L,探针浓度为350 nmoL/L,退火和延伸温度均为60℃。可以检测出的最低样品浓度为10 copies/μL,能有效区分牛病毒性腹泻病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、牛传染性鼻气管炎病毒和牛呼吸道合胞体病毒。组内、组间的Ct值变异系数均小于2%,建立的标准曲线线性关系良好,相关系数（R2）为0.995,扩增效率（E）为93.5%。该方法具有敏感性高、特异性强和稳定等特点,可用于BRV的诊断和分子流行病学调查,为养牛业防控牛轮状病毒引起的犊牛腹泻病提供了可靠的方法。对牛轮状病毒VP6全基因的克隆测序发现,其基因全长为1194 bp。与国内外23个A群轮状病毒（RVA）毒株VP6基因的核苷酸序列进行同源性比较,其同源性在78.8%-96.6%之间,核苷酸系统发育进化树结果表明,内蒙古本地毒株（NM-BRV株）与美国的RVAWC3毒株亲缘关系较近,为同一个进化群。

关键词：牛轮状病毒 VP6基因克隆定量rt-pcr 序列分析

免疫磁珠联合定量rt-pcr检测胃癌外周血微转移的临床意义

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浙江医学 2005年第8期27卷 573-575页

作者：张新军季峰秦丽君宁波大学医学院附属医院消化内科 315020 浙江大学医学院附属第一医院消化内科

目的研究免疫磁珠联合定量rt-pcr检测胃癌患者外周血微转移的临床意义。方法提取41例胃癌患者外周血有核细胞RNA,先后加入抗人CD45免疫磁珠和抗人Ber-EP4免疫磁珠,再用定量rt-pcr检测癌胚抗原(CEA)mRNA和β2微球蛋白(MG)mRNA,计算出相对... 详细信息

目的研究免疫磁珠联合定量rt-pcr检测胃癌患者外周血微转移的临床意义。方法提取41例胃癌患者外周血有核细胞RNA,先后加入抗人CD45免疫磁珠和抗人Ber-EP4免疫磁珠,再用定量rt-pcr检测癌胚抗原(CEA)mRNA和β2微球蛋白(MG)mRNA,计算出相对CEAmRNA值(CEAmRNAβ2MGmR-NA)。比较CEAmRNA的检出与患者性别、年龄、病变部位、组织学类型、pTNM分期、淋巴转移以及肝转移的关系。结果良性对照组与正常对照组均未见扩增;41例胃癌患者中有27例CEAmRNA阳性,其中贲门3例/6例,胃体10例16例,胃窦14例19例;腺癌19例26例,粘液腺癌2例7例,低分化癌6例8例;Ⅰ期2例7例,Ⅱ期5例8例,Ⅲ期7例10例,Ⅳ期13例16例;淋巴转移19例29例,肝转移8例8例。结论正常人外周血中无CEAmRNA的表达;早期胃癌外周血可检测到CEAmRNA;CEAmRNA表达的差别在不同pTNM分期、组织学类型、有无肝转移时有显著性意义,与性别、年龄、肿瘤部位、淋巴转移的关系无显著性意义。

关键词：胃癌微转移临床病理外周血免疫磁珠定量rt-pcr 定量rt-pcr检测外周血微转移胃癌患者临床意义

定量rt-pcr检测穿孔素mRNA方法的建立与临床初步应用

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临床检验杂志 2001年第3期19卷 137-139页

作者：秦卫松李芳秋武建国第二军医大学研究生队上海200433 南京军区南京总医院全军医学检验中心

目的　建立检测穿孔素mRNA的定量rt pcr方法。方法　用限制性内切酶制备竞争性模板 ,建立定量rt pcr方法 ,检测正常人及部分肿瘤病人外周血的穿孔素mRNA水平。结果　 6例正常人的外周血穿孔素mRNA含量为 0 5 1± 0 40pmol/ml,消化道... 详细信息

目的　建立检测穿孔素mRNA的定量rt pcr方法。方法　用限制性内切酶制备竞争性模板 ,建立定量rt pcr方法 ,检测正常人及部分肿瘤病人外周血的穿孔素mRNA水平。结果　 6例正常人的外周血穿孔素mRNA含量为 0 5 1± 0 40pmol/ml,消化道肿瘤患者的穿孔素mRNA水平与正常相比 ,有显著差异 (P <0 .0 1) ,乳腺肿瘤及白血病患者的穿孔素mRNA水平与正常人相比 ,没有差异。结论　穿孔素mRNA水平的降低可能是肿瘤发生的一个重要原因 ;除穿孔素途径以外 ,还存在别的抗肿瘤的效应机制。

关键词：穿孔素定量rt-pcr 肿瘤 mRNA

定量rt-pcr可预测干扰素耐药的慢性期CML进行imatinib治疗时的细胞遗传学反应

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中华医学信息导报 2002年第13期17卷 10-10页