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易错PCR定向进化技术提高蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10核酸酶活性的研究

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化学与生物工程 2022年第2期39卷 23-27,51页

作者：王珏吴娜张育敏闫海洋胡丽丽山西中医药大学基础医学院山西晋中030600

以分子伴侣skp修饰的蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10)全基因为模板,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,以酵母tRNA为底物建立高通量筛选方法,获得了核酸酶活性提高的AmPR-1... 详细信息

以分子伴侣skp修饰的蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10)全基因为模板,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,以酵母tRNA为底物建立高通量筛选方法,获得了核酸酶活性提高的AmPR-10突变体。经一轮定向进化后,突变体A4的核酸酶活性比野生型提高45%;测序结果显示,突变体A4基因序列在465位增加了1个碱基A,进而由移码突变引起了多肽序列的提前终止,使得突变体A4 C末端缺失了3个氨基酸;从空间上看,AmPR-10基因的突变减小了其C末端α螺旋对空腔的遮蔽作用,有利于目的蛋白与配体或底物的结合。该研究结果对AmPR-10核酸酶活性机制的探讨具有重要意义,为抗病抗逆黄芪植株的培育奠定了理论基础。

关键词：易错PCR 定向进化 AmPR-10 核酸酶活性

草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟

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化学与生物工程 2023年第7期40卷 34-39,44页

作者：郭小雷福州科宏生物技术开发有限责任公司福建福州350108

以来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的酪氨酸酚裂解酶(Eh-TPL)为目的基因,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体S20C和E202R,再通过定点突变得到突变体S20C/E202R/N161S。经摇瓶发... 详细信息

以来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的酪氨酸酚裂解酶(Eh-TPL)为目的基因,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体S20C和E202R,再通过定点突变得到突变体S20C/E202R/N161S。经摇瓶发酵培养发现,突变体S20C/E202R/N161S比野生型Eh-TPL的比酶活提高了30.61%;酶学性质研究结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的最适温度仍为37℃,最适pH值从8.2升至8.5,热稳定性、pH稳定性均得到明显提高;结构模拟结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的三维结构无明显变化,突变位点附近氢键和表面电势有所变化。体外定向进化技术能有效提高Eh-TPL的催化效率,对酶法生产L-酪氨酸具有重要应用价值。

关键词：易错PCR 定向进化草生欧文氏菌酪氨酸酚裂解酶 L-酪氨酸

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β-琼胶酶AgaB催化活性的定向进化

高技术通讯 2008年第2期18卷 206-210页

作者：马怡茗路新枝石超马翠萍于文功中国海洋大学医药学院青岛266003

用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶 AgaB 热稳定突变酶 M446的催化活性。采用易错 PCR 和化学诱变法相结合的方法,构建了 M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得... 详细信息

用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶 AgaB 热稳定突变酶 M446的催化活性。采用易错 PCR 和化学诱变法相结合的方法,构建了 M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得到酶活性得到提高且保持较高耐热性的突变酶 M117,其酶活提高为突变酶 M446的3倍。测序分析发现编码突变酶 M117的 DNA 序列中有4处点突变,其中2处为同义突变,另外2处引发氨基酸替换,分别为 R9K 和 I111V。对突变酶 M117与 M446的动力学常数进行了比较,发现 M117的 Km 值降低了93.4%,Kcat/Km 值提高了15倍,由此可以推断突变酶M117比活力提高的主要原因是酶与底物的亲和能力提高。

关键词：定向进化易错PCR 化学诱变酶活力 β-琼胶酶

基于定向进化技术提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性

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食品科学 2017年第22期38卷 8-13页

作者：邵泽香焦琳舒陆兆新别小妹赵海珍张充吕凤霞南京农业大学食品科技学院江苏南京210095

为提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性,通过定向进化技术对其进行分子改造。经过两轮易错聚合酶链式反应和一轮DNA shuffling,从19 100多个突变株中筛选到突变体S10、S16和S21,其酶比活力较野生型分别提高了106%、74%和43%,且突变酶K_(ca... 详细信息

为提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性,通过定向进化技术对其进行分子改造。经过两轮易错聚合酶链式反应和一轮DNA shuffling,从19 100多个突变株中筛选到突变体S10、S16和S21,其酶比活力较野生型分别提高了106%、74%和43%,且突变酶K_(cat)/K_m都有所增大。其中,突变体S10氨基酸序列发生3个突变,K43E、N67S和I269L。三维模拟结果显示,第43位氨基酸突变为谷氨酸、第67位氨基酸突变为丝氨酸,可能提高了底物亲和力和催化效率,从而提高酶活性。圆二色谱分析表明,相比野生酶,突变酶的α-螺旋数减少、无规则卷曲有所增加,表明其刚性略有降低,柔性有所增加。利用定向进化策略能够有效地提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性。

关键词： L-天冬酰胺酶定向进化酶活性

易错PCR技术定向进化褐藻胶裂解酶Alg-2的分析

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食品科学 2019年第4期40卷 146-151页

作者：李树张伟赵春梅山东大学(威海)海洋学院山东威海264209 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

为提高褐藻胶裂解酶活力,采用易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术对海洋细菌Tamlanasp.S12中具有代表性的酶组分Alg-2进行体外定向进化。经过2轮易错PCR及96孔板发酵筛选,分别获得2株正突变和2株负突变菌株,其酶比... 详细信息

为提高褐藻胶裂解酶活力,采用易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术对海洋细菌Tamlanasp.S12中具有代表性的酶组分Alg-2进行体外定向进化。经过2轮易错PCR及96孔板发酵筛选,分别获得2株正突变和2株负突变菌株,其酶比活力分别是亲本(2 675.2 U/g)的162%、241%、53%、11%。酶的动力学分析显示,正突变株P2-81的Km值比亲本降低50%,而负突变株N2-47的Km值比亲本提高106%,表明突变株对底物的亲和力有极大的上升和下降。基因测序及氨基酸序列分析结果表明,Glu、Thr、Ser、Asp和Tyr对褐藻胶裂解酶活力提高起到正面的积极作用,而Lys的突变起到负面的消极作用,后续人工合成的定点突变则进一步证实Asp和Lys的正/负作用。本研究有助于深入理解褐藻胶裂解酶的催化机制,为后续利用理性设计手段改造褐藻胶裂解酶提供理论参考。

关键词：易错PCR 定向进化褐藻胶裂解酶氨基酸序列

定向进化提高灰盖鬼伞过氧化物酶染织废水脱色效率

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微生物学通报 2017年第4期44卷 774-782页

作者：张磊张伟方金涛董冰雪黄林娜吴倩倩押玉柯张建丰张格格郑路南阳理工学院土木工程学院河南南阳473004 南阳师范学院生命科学与技术学院河南南阳473061 南阳师范学院校医院河南南阳473061 中山大学生命科学与技术学院广东广州510275

【目的】获得染织废水脱色能力增强的灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】使用基因合成及定点突变平台合成突变灰盖鬼伞过氧化物酶基因CIPmt4(I49S、V53A、M166F和M242I),并调整密码子至毕赤酵母偏好性。以CIPmt4为模板进行定向进化,经过三轮... 详细信息

【目的】获得染织废水脱色能力增强的灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】使用基因合成及定点突变平台合成突变灰盖鬼伞过氧化物酶基因CIPmt4(I49S、V53A、M166F和M242I),并调整密码子至毕赤酵母偏好性。以CIPmt4为模板进行定向进化,经过三轮易错PCR和高通量筛选得到一个酶学性质显著改善的突变体(CIPmt5)。通过3D建模和分子动力学模拟分析蛋白的结构及热稳定性,并进一步研究CIPmt5和野生型CIP对刚果红、氨基黑、甲基橙、次甲基蓝、苯胺蓝、结晶紫、溴酚蓝共7种染料的脱色能力。【结果】序列分析显示该突变体积累了I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F共5个氨基酸突变,与野生型灰盖鬼伞过氧化物酶相比,以ABTS为底物酶活性是野生型的2.01倍(24.44 U/mg),最适反应p H由5.0提高到6.5,最适反应温度由25°C提高到45°C。除次甲基蓝外对其它染料脱色的最适p H都往中、碱性方向偏移,脱色率普遍高于野生型。模型分析显示CIPmt5活性中心更开放,热稳定性增强。【结论】突变体酶CIPmt5能够更好地替代野生型灰盖鬼伞过氧化物酶应用于染织业染料脱色、化工废水和染织废水的生物修复。

关键词：灰盖鬼伞过氧化物酶定向进化酶学特性染料脱色

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萜类合成酶定向进化的新思路

微生物学报 2019年第4期59卷 591-600页

作者：胡智慧翁彦如谌柄旭于爱群肖冬光天津科技大学生物工程学院教育部工业发酵微生物重点实验室微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心天津300457

萜类化合物是天然产物中种类最多且主要存在于植物和微生物体内的一类化合物。随着越来越多具有应用价值的萜类化合物被挖掘,其应用前景引起了人们的关注,但由于含量低、提取成本高等缺点,因此制约了萜类化合物的广泛应用。合成生物学... 详细信息

萜类化合物是天然产物中种类最多且主要存在于植物和微生物体内的一类化合物。随着越来越多具有应用价值的萜类化合物被挖掘,其应用前景引起了人们的关注,但由于含量低、提取成本高等缺点,因此制约了萜类化合物的广泛应用。合成生物学的兴起,为异源合成具有应用价值的萜类化合物提供了新思路,使构建定向、高效的微生物细胞工厂成为现实。萜类合成酶常作为萜类化合物异源合成代谢调控的靶酶,但天然的萜类合成酶存在催化效率低、底物专一性差、立体/区域选择性差、稳定性差等问题,严重影响萜类化合物的产量。萜类合成酶的定向进化可以有效地解决上述问题,为实现微生物细胞工厂异源、高效合成萜类化合物奠定基础。本文综述了近年来酶的定向进化技术的最新进展及应用,并提出了萜类合成酶定向进化的策略。

关键词：萜类化合物萜类合成酶合成生物学定向进化

应用定向进化获取受体高亲和性hEGF突变株E40V及其特性的评价

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中山大学学报（自然科学版） 2019年第2期58卷 110-120页

作者：孙宇杰杨南燕欧锦新李飞黄雪莹王庆环刘健王倩倩刘昕张擎中山大学生命科学学院生物工程中心广东广州510275 深圳市美沃西联生物科技公司广东深圳518133 中山大学深圳研究院广东深圳518057

人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)是一种由53个氨基酸构成的单体多肽。该蛋白作为有效的促有丝分裂因子,通过和细胞表面受体EGFR特异性结合来影响细胞的生长,增殖和分化。hEGF基因的失调与某些癌症的生长和发育有关... 详细信息

人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)是一种由53个氨基酸构成的单体多肽。该蛋白作为有效的促有丝分裂因子,通过和细胞表面受体EGFR特异性结合来影响细胞的生长,增殖和分化。hEGF基因的失调与某些癌症的生长和发育有关,其蛋白本身对于表皮损伤和溃疡具有良好的修复功能。但是由于其半衰期较短且会造成受体表达下调,因此有必要对其进行改良。通过StEP法对人源和猪源EGF因子进行定向化改造,通过构建噬菌体展示文库和ELISA筛选方式获得一株对于受体具有较高亲和力的突变株E40V,并使用MTT、圆二色谱和细胞划痕对该突变株的促细胞增殖,迁移能力以及温度,pH耐受性进行了探究。结果显示,E40V相较于野生型EGF,其受体亲和性显著提高,对于正常细胞的促增殖能力也有所强化,而对于温度,pH耐受情况则与野生型相差不大。本研究不仅为短肽的定向进化提供了一个范例,也为EGF的实际应用打下基础。

关键词：表皮生长因子定向进化噬菌体展示文库圆二色谱

枯草芽孢杆菌漆酶BsCotA的定向进化及其在靛蓝脱色中的应用

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生物技术 2022年第4期32卷 409-414,426页

作者：张俊雄乐琛赵丽君雷磊杨江科武汉轻工大学生命科学与技术学院湖北武汉430023

[目的]获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CotA漆酶活性及热稳定性提高的突变体并用于靛蓝脱色。[方法]利用易错PCR技术筛选获得2株酶活提高的漆酶突变体A1、A2,测定酶学性质,并进行靛蓝脱色研究。[结果]突变体A1、A2的最适pH值均为5... 详细信息

[目的]获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CotA漆酶活性及热稳定性提高的突变体并用于靛蓝脱色。[方法]利用易错PCR技术筛选获得2株酶活提高的漆酶突变体A1、A2,测定酶学性质,并进行靛蓝脱色研究。[结果]突变体A1、A2的最适pH值均为5.5,最适温度均为70℃;A1、A2在pH值2~7范围内,孵育30 min,剩余酶活均在40%以上,相比野生型(35%以下)有明显提高;A1、A2的比酶活为74.31 U/mg和80.96 U/mg,相比野生型(27.04 U/mg)分别提高了1.75倍、1.99倍;酶的三维结构分析显示,形成的4个突变位点中,1个突变位点通过氨基酸的替换,降低了主肽链的构象自由度,其余3个突变位点在漆酶的整体结构上引入了新的氢键;靛蓝染料脱色结果表明,3种漆酶对靛蓝的12 h脱色率均超过60%。[结论]筛选出来的漆酶突变体A1、A2,在pH值2~7范围内和65~80℃范围内的活性和稳定性比野生型显著提高,在靛蓝脱色等领域具有良好的应用基础。

关键词：枯草芽孢杆菌漆酶定向进化酶学性质染料脱色