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定向进化和半理性设计改造顺式环氧琥珀酸水解酶

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微生物学通报 2023年第5期50卷 1741-1755页

作者：王国桧谢志鹏张建国浙江大学药物生物技术研究所&医学院浙江杭州310058 浙江省微生物生化与代谢工程重点实验室浙江杭州310058 杭州宝晶生物股份有限公司浙江杭州311106

【背景】D(-)-酒石酸是非天然有机酸,在保健品、食品和肿瘤药物合成等行业具有重大应用潜力,目前主要通过生物转化法生产,即顺式环氧琥珀酸水解酶[cis-epoxysuccinic acid hydrolase,CESH(D)]水解顺式环氧琥珀酸(cis-epoxysuccinic acid... 详细信息

【背景】D(-)-酒石酸是非天然有机酸,在保健品、食品和肿瘤药物合成等行业具有重大应用潜力,目前主要通过生物转化法生产,即顺式环氧琥珀酸水解酶[cis-epoxysuccinic acid hydrolase,CESH(D)]水解顺式环氧琥珀酸(cis-epoxysuccinic acid,ESH)生成D(-)-酒石酸。该法简单温和,但存在CESH(D)酶活转化效率低下的瓶颈问题。【目的】通过基因工程改造,提高CESH(D)的酶活力、温度和pH稳定性。【方法】利用定向进化和半理性设计体外改造CESH(D),高通量筛选出正向突变体;然后对其进行酶学性质研究,包括比酶活、温度和pH对酶催化效率的影响、酶的温度稳定性、pH稳定性及酶促动力学分析;最后通过分子对接等手段分析突变位点影响催化活性的初步机制。【结果】筛选获得4个正向突变体L231P/N226S、V77I、D183E和T223S。与野生型相比,4个突变体的比酶活分别提高2.2、1.6、1.5和1.4倍。其中,L231P/N226S的温度稳定性和pH稳定性较野生型均有显著提高,55℃时催化活性为野生型的1.6倍,pH 6.0时催化活性为野生型的1.2倍。动力学分析发现,突变体L231P/N226S和T223S对底物ESH的亲和力有明显提升,Km值分别为20 mmol/L和21 mmol/L,较野生型分别降低18%和16%。分子对接研究表明,突变位点主要通过改变底物结合口袋促进酶与底物的相互作用,从而影响酶活。【结论】获得了温度和pH稳定性好、催化活性明显提高的CESH(D)突变体,初步分析突变位点影响酶活的机制,为进一步研究CESH(D)的结构-功能关系及深入改造提供指导。

关键词：顺式环氧琥珀酸水解酶 D(-)-酒石酸定向进化半理性设计

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麦芽糖诱导梯度强度启动子的定向进化改造

生物工程学报 2022年第7期38卷 2606-2617页

作者：张国强滕茂放刘松周景文李江华堵国成江南大学未来食品科学中心江苏无锡214122 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

不同灵敏度与响应强度的启动子在基因表达调控与代谢工程改造中应用广泛。为筛选不同诱导表达强度的启动子元件,本研究以麦芽糖诱导启动子Pglvc为对象,通过易错PCR方法对麦芽糖诱导型启动子进行突变获得启动子突变体库,然后基于四环素... 详细信息

不同灵敏度与响应强度的启动子在基因表达调控与代谢工程改造中应用广泛。为筛选不同诱导表达强度的启动子元件,本研究以麦芽糖诱导启动子Pglvc为对象,通过易错PCR方法对麦芽糖诱导型启动子进行突变获得启动子突变体库,然后基于四环素筛选的细胞生长偶联方法对突变体进行高效筛选,获得了不同响应范围和强度的启动子突变体,最终得到的诱导型启动子突变体(MT2、MT3、MT4、MT6)对麦芽糖诱导剂的响应范围从0–3 g/L扩展至0–15 g/L,其中最高诱导表达强度菌株(MT8)较原始启动子菌株的绿色荧光蛋白表达水平提高约3.15倍,有利于进一步拓展梯度强度启动子在枯草芽孢杆菌代谢工程和合成生物学中的应用。

关键词：诱导启动子麦芽糖定向进化梯度强度枯草芽孢杆菌

定向进化提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化率的研究

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定向进化提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化率的研究

作者：张志伟齐鲁工业大学

学位级别：硕士

D-阿洛酮糖(D-allulose)是一种只微量存在于无花果、小麦和蜂蜜的稀有糖,具有低热量、甜度高(其甜度是蔗糖的70%,热量为蔗糖的0.3%)的优点,在食品、医药等行业具有广泛的应用潜力。D-阿洛酮糖常用的合成方法是以D-阿洛酮糖3-差相异构酶... 详细信息

D-阿洛酮糖(D-allulose)是一种只微量存在于无花果、小麦和蜂蜜的稀有糖,具有低热量、甜度高(其甜度是蔗糖的70%,热量为蔗糖的0.3%)的优点,在食品、医药等行业具有广泛的应用潜力。D-阿洛酮糖常用的合成方法是以D-阿洛酮糖3-差相异构酶转化D-果糖获取,目前转化率在28%-33%之间,生产和纯化成本较高。本研究构建了基于荧光的D-阿洛酮糖3-差相异构酶筛选体系,结合酶空间结构分析,对来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的At-DPEase基因进行定点饱和突变,筛选获得转化率提高的D-阿洛酮糖3-差相异构酶突变子,具体内容包括:(1)构建包含At-DPEase基因的重组载体pET-20b-At-DPEase,将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,获得重组工程菌E.coli BL21/pET-20b-At-DPEase,并对重组工程菌进行蛋白纯化及表达并酶学性质进行分析,测定不同温度、pH、金属离子对其酶活的影响,最终确定了其最适反应温度为60℃、最适反应pH 8、最适金属离子Mn,在不加入Mn时转化率达到了31.59%,在加入Mn时转化率达到了32.95%(2)本项目构建了一种包含D-葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶、辣根过氧化物酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的荧光显色体系,体系中通过葡萄糖氧化酶、D-葡萄糖异构酶在以D-果糖为底物生成的HO可与辣根过氧化物酶产生荧光反应,筛选方法是葡萄糖氧化酶(5000 U/L)、D-葡萄糖异构酶(5000 U/L)、D-阿洛酮糖3-差向异构酶(主要是突变酶)在反应温度60℃、pH 8.0反应2 h,随后将反应溶液稀释1000倍与辣根过氧化物酶(2500 u/L)使用酶标仪在λex/em=315/410 nm条件下测定其荧光强度,而体系中D-果糖的含量则与D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性呈负相关,由此建立了荧光强度与D-阿洛酮糖的含量的关联,为D-阿洛酮糖3-差向异构酶高转化率突变子的筛选奠定了基础。(3)使用Swiss-model软件模拟获得At-DPEase三维结构,并且对结合活性口袋及关键活性位点进行分析,选取了Leu33、Ala36、Gly65、Glu150、Glu244、Cys213、Asp256共7个突变位点进行点饱和突变,结合高通量筛选体系进行筛选,然后进行摇瓶验证,最终发现C213P和C213A反应8 h后转化率分别提高了2.9%和4.41%。其中C213A突变菌比重组酶最适反应温度由60℃提高至65℃。在C213A位点的突变情况的基础上选取了临近的G212、N214位点进行进一步的点饱和突变,结果显N214D突变子反应8h后转化率提高了2.5%。又以而以C213A为突变模板对G212、N214位点进行饱和突变,结果显示转化率均低于AT-DPEase的31.59%并未获得转化率高于At-DPEase的突变子。对At-DPE-C213A、At-DPE-C213P、At-DPE-N214D突变子的发酵培养基的碳源、氮源和无机盐离子浓度以及发酵时间、诱导温度和诱导时间进行优化,发现发酵培养基最佳配方:鱼骨蛋白胨20 g/L、糊精10 g/L、甘油4%(V/V)、无机盐浓度A(m L):B(μL):C(μL)=5:50:50在25℃下诱导48 h,E.coli/pET-20b-At-DPE-C213P酶活提高至102.30U/mL,提高幅度最大为53.99%,反应时间缩短了2 h。

关键词： D-阿洛酮糖定向进化高通量筛选 D-阿洛酮糖3-差相异构酶发酵优化

定向进化亚胺还原酶Red52应用于候选药物6-IA-PTOX的生物合成

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定向进化亚胺还原酶Red52应用于候选药物6-IA-PTOX的生物合成

作者：张春萌天津科技大学

学位级别：硕士

课题组前期通过对秋水仙素结合域周围附近的微管蛋白结合位点的研究,发现C-NH连接鬼臼毒素衍生物4β-NH-(6-氨基吲哚)-4-脱氧-鬼臼毒素(6-IA-PTOX)的抗肿瘤活性相较于已经上市的鬼臼类抗肿瘤药物依托泊苷以及替尼泊苷的抗肿瘤活性提升... 详细信息

课题组前期通过对秋水仙素结合域周围附近的微管蛋白结合位点的研究,发现C-NH连接鬼臼毒素衍生物4β-NH-(6-氨基吲哚)-4-脱氧-鬼臼毒素(6-IA-PTOX)的抗肿瘤活性相较于已经上市的鬼臼类抗肿瘤药物依托泊苷以及替尼泊苷的抗肿瘤活性提升了一个数量级,由之前的微摩尔级提升至纳摩尔级,因此6-IA-PTOX具有很大的成药潜力。到目前为止,6-IA-PTOX仅能通过化学合成来制备,但此过程中会涉及到有毒试剂的使用,如三氟化硼乙醚和三乙胺等;同时收率不足30%。基于化学合成的缺陷,我们尝试采用酶法合成6-IA-PTOX。通过分析6-IA-PTOX的分子结构特征,我们设计醇脱氢酶-亚胺还原酶两步级联合成路线。实验室之前已经成功建立了第一步反应,即以商业化的鬼臼毒素作为底物,采用桃儿七植物来源的醇脱氢酶实现了C环4位的氧化,形成鬼臼毒酮。本论文的研究目的是以鬼臼毒酮和6-氨基吲哚作为底物,挖掘合适的亚胺还原酶元件催化还原胺化反应以合成6-IA-PTOX。通过对实验室现有的200个亚胺还原酶进行筛选,并未筛选能够直接催化鬼臼毒酮和6-氨基吲哚的亚胺还原酶。基于亚胺还原酶更倾向催化亚胺中间体还原,所以通过化学合成了6-IA-PTOX亚胺中间体,以其为底物对现有的亚胺还原酶进行筛选,最终发现有Red52、IR45等20个亚胺还原酶能够催化6-IA-PTOX中间体生成最终产物6-IA-PTOX。以转化率最高的亚胺还原酶Red52为改造亲本进行定向进化,以实现高效催化。通过晶体培养和X-ray衍射获得了一套分辨率较好的亚胺还原酶Red52和辅因子NADPH的复合物晶体数据,通过分子置换法解析了该复合物晶体结构。通过晶体结构指导的四轮半理性设计,Red52-M4突变体对6-IA-PTOX中间体的转化率从最初的3.0%提升至88.3%。

关键词：候选药物6-IA-PTOX 亚胺还原酶生物催化定向进化

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定向进化在蛋白质工程中的应用研究进展

合成生物学 2022年第6期3卷 1081-1108页

作者：祁延萍朱晋张凯刘彤王雅婕西湖大学工学院浙江杭州310024 西湖大学合成生物学与生物智造中心浙江杭州331712

定向进化旨在通过基因多样化和突变体库筛选的迭代循环,加速实现在胞内或胞外进行的自然进化过程。近年来,因其强大的功能而被广泛应用于酶工程当中。本文概述了近十年助力定向进化发展的最新技术,包括胞外和胞内高效构建基因突变体库... 详细信息

定向进化旨在通过基因多样化和突变体库筛选的迭代循环,加速实现在胞内或胞外进行的自然进化过程。近年来,因其强大的功能而被广泛应用于酶工程当中。本文概述了近十年助力定向进化发展的最新技术,包括胞外和胞内高效构建基因突变体库的方法、高通量筛选突变体库的方法、连续定向进化策略、自动化生物合成平台助力定向进化的策略、计算机技术辅助定向进化的应用实例。为了阐述定向进化在酶工程中的应用价值,本文着重讨论了利用定向进化技术对酶进行改造的代表性案例,其中包括改善酶在有机溶剂中的耐受性、提高酶的热稳定性、增强天然酶对非天然底物的催化能力、提高酶催化化学反应的选择性(包括区域选择性、立体选择性和对映选择性)以及拓展酶催化的反应类型。最后,本文对定向进化在未来可能遇到的挑战及应用前景进行了归纳总结。

关键词：定向进化蛋白质工程酶工程生物催化

高酶活性β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖

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精细化工 2023年第11期40卷 2454-2462页

作者：陈赟高伟强梁琪周晓雷王丽丽张春晓河北科技大学食品与生物学院河北石家庄050018

为了提高β-甘露聚糖酶的活性,采用易错PCR将来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)KD-1的β-甘露聚糖酶基因manBl进行定向进化,并在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中进行表达,以筛选酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体。筛选得到的突变... 详细信息

为了提高β-甘露聚糖酶的活性,采用易错PCR将来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)KD-1的β-甘露聚糖酶基因manBl进行定向进化,并在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中进行表达,以筛选酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体。筛选得到的突变体ManBl(I91N/L211I),其比酶活性为15554.7 U/mg,是野生型ManBl的4.1倍,食品级表达的胞外酶产量达17601.3U/mL。分子动力学和分子对接结果表明,β-甘露聚糖酶在2个位点(I91N/L211I)的突变,导致蛋白催化口袋柔性增加,与底物结合能力提高,进而提高了酶的催化效率。β-甘露聚糖酶ManBl(I91N/L211I)水解魔芋胶产物主要由甘露六糖、甘露三糖和甘露二糖组成。报道的I91N/L211I 2个位点联合突变能够提高β-甘露聚糖酶活性;ManBl(I91N/L211I)食品级表达为该酶的绿色安全应用奠定了基础。

关键词：甘露聚糖酶枯草芽孢杆菌定向进化食品级表达甘露寡糖制备生物工程

定向进化提高磺酰脲类除草剂脱毒酯酶SulE的活性

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应用与环境生物学报 2020年第5期26卷 1075-1080页

作者：刘斌杨洲刘军委陈乐彭乾何健南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

磺酰脲除草剂脱毒酯酶SulE对噻磺隆活性极高,但对其他磺酰脲类除草剂活性很低,这限制了在磺酰脲除草剂残留污染生物修复和抗磺酰脲除草剂作物培育中的应用价值.利用Escherichiacoli DH10B (ilvG+)对甲磺隆的敏感性为筛选标记,从sulE基... 详细信息

磺酰脲除草剂脱毒酯酶SulE对噻磺隆活性极高,但对其他磺酰脲类除草剂活性很低,这限制了在磺酰脲除草剂残留污染生物修复和抗磺酰脲除草剂作物培育中的应用价值.利用Escherichiacoli DH10B (ilvG+)对甲磺隆的敏感性为筛选标记,从sulE基因随机突变库中筛选获得了一个酶活性显著提高的突变体mSulE.与野生型相比,突变体mSulE对甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆和胺苯磺隆的比酶活分别提高了8.29、8.61、1.50和4.04倍.测序结果表明,突变体mSulE氨基酸序列发生了2处替换,分别为Y81T和S178N.三维结构模拟表明,2个突变位点都在酶活性中心附近,突变体mSulE酶活提高的原因可能是Y81突变为T增加了催化口袋的面积,以及S178突变为N增加了氨基酸残基之间的氢键作用力.综上所述,突变体mSulE对大部分磺酰脲除草剂的活性要高于野生型,在磺酰脲除草剂残留污染生物修复和抗除草剂转基因工程中具有很好的应用前景.(图6表1参30)

关键词：磺酰脲类除草剂酯酶SulE 定向进化酶活性同源建模

米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向进化、高效表达与应用

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食品与生物技术学报 2022年第7期41卷 120-129页

作者：李延啸马俊文闫巧娟武建张伟江正强中国农业大学工学院/中国轻工业食品生物工程重点实验室北京100083 北京瓜尔润科技股份有限公司北京100101 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083 南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心江苏南京210023

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶(RmMan5A)对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体(RmMan5AM2)。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65℃,较野生型甘露聚糖酶提高... 详细信息

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶(RmMan5A)对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体(RmMan5AM2)。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65℃,较野生型甘露聚糖酶提高了10℃。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖(相对峰面积>85%),总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。

关键词：米黑根毛霉甘露聚糖酶定向进化高效表达应用

米曲霉β-半乳糖苷酶的定向进化、高效表达及应用

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食品与生物技术学报 2022年第10期41卷 49-57页

作者：李晨霞向芷璇李敬江正强闫巧娟马俊文中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083 中国农业大学工学院北京100083

定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶(AoBgal35A),以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体(mAoBg... 详细信息

定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶(AoBgal35A),以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体(mAoBgal35A),经高密度发酵酶活力达4760 U/mL。纯化后,mAoBgal35A的最适pH和温度分别为5.0和55℃,比野生型AoBgal35A分别提高了0.5和降低了5℃。mAoBgal35A在室温下能高效水解牛奶中的乳糖,加酶量为2 U/mL时,水解72 h后牛奶中的乳糖质量浓度为0.38 g/dL,达到无乳糖牛奶标准。而野生型AoBgal35A的加酶量为20 U/mL时,在相同条件下水解后,乳糖质量浓度为0.6 g/dL。由此表明,定向进化明显提高了米曲霉β-半乳糖苷酶水解乳糖的效率,所得正向突变体在制备无乳糖乳品中具有很大的应用潜力。

关键词：米曲霉 β-半乳糖苷酶定向进化高效表达水解乳糖