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定向改造装拆表拉线夹技术探索与应用

科技资讯 2023年第10期21卷 47-50页

作者：刘俊马文文深圳供电局有限公司广东深圳518000

该文介绍了一种计量装表定向改造拆表拉线夹(四线),其适用于计量装表接电工作中的使用。为了安全、快捷、高效地完成表计带电拆(装)表作业,避免使用金属钳生拉硬拽导致损坏线缆绝缘层,可设计成一把夹子用于固定表计4条线缆,特别是对进... 详细信息

该文介绍了一种计量装表定向改造拆表拉线夹(四线),其适用于计量装表接电工作中的使用。为了安全、快捷、高效地完成表计带电拆(装)表作业,避免使用金属钳生拉硬拽导致损坏线缆绝缘层,可设计成一把夹子用于固定表计4条线缆,特别是对进表火线进行固定,防止带电火线接触金属表箱导致打火及人员触电事故,确保装拆表施工安全,促进电力工程事业长远发展。

关键词：装表定向改造拆表拉线应用方法

黑曲霉多聚半乳糖醛酸酶AnPGA耐热性和酶活性的定向改造

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应用与环境生物学报 2021年第5期27卷 1304-1310页

作者：颜佳超曹瑜杨丹妮吴勇徐辉乔代蓉曹毅四川大学生命科学学院微生物与代谢工程四川省重点实验室成都610065 四川大学实验室及设备管理处成都610065

果胶是一种蕴藏丰富的生物质资源,多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)是降解果胶的关键酶,在食品领域也有很广泛的应用,其酶活性和耐热性是制约果胶及其自身利用的关键.采用PoPMuSiC工具结合分子动力学模拟对Aspergillus niger SC... 详细信息

果胶是一种蕴藏丰富的生物质资源,多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)是降解果胶的关键酶,在食品领域也有很广泛的应用,其酶活性和耐热性是制约果胶及其自身利用的关键.采用PoPMuSiC工具结合分子动力学模拟对Aspergillus niger SC323来源的多聚半乳糖醛酸酶AnPGA进行改进,预测影响解折叠自由能显著的位点结合柔性位点的策略,旨在提高其耐热性或酶活性.通过重叠PCR进行定点突变,并构建突变体的表达载体,电转化Pichia pastoris GS115后,进行诱导表达,成功筛选到酶活力和热稳定性均提高的突变体D73P,其最大反应速度是野生型的2.72倍,在65℃下的半衰期t_(1/2)比野生型增加了7 min,在65℃下处理30 min后的残余酶活性为野生型的1.86倍.本研究利用PoPMuSiC结合分子动力学模拟的设计策略提高了AnPGA的酶活力和耐热性,为工业应用提供了新的酶资源,也为其他工业酶的定向改造提供了参考.

关键词：多聚半乳糖醛酸酶定向改造定点突变热稳定性酶活性

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缬氨酸生产菌株的定向改造及发酵优化

食品与发酵工业 2019年第5期45卷 19-24页

作者：石拓刘晓倩范晓光陈宁天津科技大学生物工程学院天津300457

缬氨酸是人体必需氨基酸之一,具有重要的生理生化作用。为进一步提高缬氨酸产量及优化发酵过程的温度控制,从谷氨酸棒杆菌细胞壁肽聚糖合成途径的2个关键基因murA(cgl0352)和murB(cgl0353)入手,从1株缬氨酸生产菌中敲除murA和murB基因... 详细信息

缬氨酸是人体必需氨基酸之一,具有重要的生理生化作用。为进一步提高缬氨酸产量及优化发酵过程的温度控制,从谷氨酸棒杆菌细胞壁肽聚糖合成途径的2个关键基因murA(cgl0352)和murB(cgl0353)入手,从1株缬氨酸生产菌中敲除murA和murB基因构建出重组工程菌株C.glutamicum A301。摇瓶发酵结果显示,该菌株具有温度敏感性,在变温发酵的条件下,能从生长型状态转化为产酸型状态,促进缬氨酸的积累。在5 L发酵罐中采用分段控温策略发酵,即前15 h控温33℃,15 h之后提温至39℃,重组工程菌株的缬氨酸产量达到35.5 g/L,与全程33℃发酵相比提高了55.7%。研究为缬氨酸发酵过程温度控制提供了经验,同时对于谷氨酸棒杆菌的定向改造提供了一种思路。

关键词：谷氨酸棒杆菌缬氨酸定向改造发酵优化

生物表面活性剂Surfactin生产菌株的定向改造策略

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微生物学报 2018年第10期58卷 1711-1721页

作者：胡仿香李霜南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京210009

表面活性素(Surfactin)是芽胞杆菌属(Bacillussp.)代谢产生的脂肽类生物表面活性剂,是由非核糖体肽合成酶(NRPS)催化而得的一种次级代谢产物。由于surfactin具有稳定性好、可被降解、表面活性好等理化性质以及抑菌、抗肿瘤等生物活性,... 详细信息

表面活性素(Surfactin)是芽胞杆菌属(Bacillussp.)代谢产生的脂肽类生物表面活性剂,是由非核糖体肽合成酶(NRPS)催化而得的一种次级代谢产物。由于surfactin具有稳定性好、可被降解、表面活性好等理化性质以及抑菌、抗肿瘤等生物活性,在医药、农业、食品、化妆品、石油开采等方面都具有很大的应用潜力。但是,天然菌株产率低、生产成本高等特点限制了surfactin的规模化应用。本文对surfactin的合成机理进行了简要阐述,并针对目前提升surfactin产量和改变结构组分的4种定向改造策略(启动子工程、强化外排分泌、改造NRPS结构域和脂肪酸链合成酶系)进行了综述,最后对surfactin的研究方向进行了展望。

关键词： Surfactin 脂肽非核糖体肽合成酶(NRPS) 启动子工程定向改造

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定向改造棒状链霉菌青霉素扩环酶的研究进展

江苏农业科学 2013年第7期41卷 13-15页

作者：季俊杰中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院北京100083

青霉素扩环酶是实现酶法转化青霉素生产各种半合成头孢菌素的关键前体7-ADCA的关键酶。获得对青霉素G具有高催化能力的扩环酶突变体,是将其引入工业化生产需要解决的关键问题。目前利用非理性和理性的方法对改酶进行改造,取得了一些活... 详细信息

青霉素扩环酶是实现酶法转化青霉素生产各种半合成头孢菌素的关键前体7-ADCA的关键酶。获得对青霉素G具有高催化能力的扩环酶突变体,是将其引入工业化生产需要解决的关键问题。目前利用非理性和理性的方法对改酶进行改造,取得了一些活性提高的突变株。本文对改造青霉素扩环酶的研究进展进行总结,并结合其自身的工作对改酶的进一步研究提供理论基础。

关键词：定向改造棒状链霉菌青霉素扩环酶

菜豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及定向改造

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菜豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及定向改造

作者：王瑞江南大学

学位级别：硕士

手性环氧化物和邻二醇是合成手性化合物的重要中间体,在功能材料、医药和农药等的合成中有着重要的应用价值。环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs)能催化外消旋环氧化物的选择性开环生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化物... 详细信息

手性环氧化物和邻二醇是合成手性化合物的重要中间体,在功能材料、医药和农药等的合成中有着重要的应用价值。环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs)能催化外消旋环氧化物的选择性开环生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化物。区域选择性高且互补的单一EH催化外消旋环氧化物对映归一性水解是制备手性邻二醇的理想途径,但目前仅有少数EHs具有此特性。本论文从菜豆(Phaseolus vulgaris)基因组中扩增了一种编码PvEH3的基因pveh3,并将其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功实现异源表达;采用定点和迭代突变技术对PvEH3进行分子改造,以获得高活力和高区域选择性的PvEH3突变体;通过构建双相催化体系解除底物对最优突变体PvEH3的抑制作用。以菜豆总RNA为模板,采用逆转录PCR和巢式PCR技术扩增了一条新型环氧化物水解酶的编码基因pveh3,其长度为957 bp,编码318个氨基酸。一级和三维结构分析表明PvEH3属于α/β水解酶超家族,其催化三联体为D101-H297-D262,两个保守质子供体为Y150和Y232。SDS-PAGE结果显示PvEH3的表观分子量为36.1 kDa,催化特性研究表明PvEH3能催化对氯环氧苯乙烷(pCSO)的对映归一性水解,产物(R)-对氯苯乙二醇(pCPED)的对映体过量值(ee)为85.1%。PvEH3对(S)-和(R)-pCSO的区域选择性系数α和β分别为87.0%和98.0%。通过镍离子亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,PvEH3的比活力为1.36 U·mg,针对pCSO的动力学参数K和k/K分别为6.60mM和0.583 mM·s。基于PvEH3与(R)-pCSO的分子对接模拟分析和与植物EHs的氨基酸序列比对结果对PvEH3的7个非保守氨基酸位点进行定点突变。其中突变体PvEH3全细胞比活力最高为12.86 U·g wcw,是PvEH3的3.7倍;PvEH3和PvEH3对映归一性最好,ee分别从PvEH3的85.1%提高至90.0%和91.2%。随后经组合点突变和迭代饱和突变获得最优突变体PvEH3,其全细胞比活力从3.45提高至20.31 U·gwcw,区域选择性系数α和β分别为95.0%和98.0%。纯化后PvEH3催化pCSO的K和k/K分别为4.86 mM和1.81 mM·s。在环己烷的体积比为5%、全细胞催化剂与底物的重量比为12:1(w/w)的双相催化体系中,PvEH3全细胞催化200 mM pCSO对映归一性水解5.5 h后,产物(R)-pCPED的ee和产率分别为96.1%和98.0%,时空产率STY为6.16 g·L·h。底物谱分析表明,PvEH3能催化环氧苯乙烷(SO)及其4种衍生物的水解,取代基的类型和位置均影响其活力和对映归一性,PvEH3对5种底物的催化活力较PvEH3均有提高,是PvEH3的2.1.9倍。

关键词：环氧化物水解酶异源表达对映归一性定向改造双相催化体系

基于理性设计的β-甘露聚糖酶底物亲和力的定向改造

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2014年第1期40卷 58-64页

作者：魏喜换王春娟赵梅李剑芳邬敏辰江南大学食品学院江苏无锡214122 江南大学无锡医学院江苏无锡214122

以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)为研究对象,对其底物亲和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数Km值较低的突变酶AuMan5AY111F.首先采用同源建模和分子对接模拟等方法预测AuMan5A... 详细信息

以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)为研究对象,对其底物亲和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数Km值较低的突变酶AuMan5AY111F.首先采用同源建模和分子对接模拟等方法预测AuMan5A与甘露二糖对接复合物的空间结构;在此结构上使用PyMol软件统计到距甘露二糖8以内的38个氨基酸位点.其次对不同来源的、与AuMan5A一级结构序列全同率大于50%的β-甘露聚糖酶进行多序列比对;排除21个保守氨基酸位点,依据17个非保守位点上的氨基酸性质及其所处空间位置,选择AuMan5A中的Tyr111、Phe206和Tyr243作为拟突变氨基酸,将它们分别替换为性质相似的或在其他β-甘露聚糖酶序列中出现频率高的氨基酸,形成一系列拟突变酶.最后采用MM-PBSA法计算AuMan5A及其拟突变酶与甘露二糖的结合自由能(ΔGbind),其中AuMan5AY111F的ΔGbind为-237.7kJ/mol,较其他酶的ΔGbind均低.基于该理性设计采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Tyr111的密码子TAC突变为编码Phe111的TTC,构建出突变酶基因(Auman5AY111F).分别将Auman5AY111F和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,并对重组表达产物reAuMan5AY111F和reAuMan5A进行分离纯化和动力学常数测定.结果表明:reAuMan5AY111F对瓜尔豆胶的Km值由突变前的3.9mg/mL降低为2.5mg/mL;而突变前后酶的Vmax值变化不大.该研究运用多种生物信息学软件对提高AuMan5A底物亲和力进行了理性设计,并通过定点突变证实之,这为β-甘露聚糖酶乃至其他各种酶底物亲和力的定向改造提供了新的技术策略.

关键词： β-甘露聚糖酶底物亲和力定向改造理性设计定点突变

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小功率短波笼形天线定向改造研究

广播与电视技术 2023年第9期50卷 98-102页

作者：康晓乐冯玉梅中广电广播电影电视设计研究院有限公司北京100045 电磁环境研究与测试国家广播电视总局实验室北京100045

针对某些小功率短波发射台的定向覆盖需求,本文在原有全向天线基础上,创造性地提出了定向天线改造方案。为了尽可能维持原有场地布局,利用原有天线结构,降低改造成本,考虑通过加载反射器的方式改造原有全向小功率短波发射天线为定向天... 详细信息

针对某些小功率短波发射台的定向覆盖需求,本文在原有全向天线基础上,创造性地提出了定向天线改造方案。为了尽可能维持原有场地布局,利用原有天线结构,降低改造成本,考虑通过加载反射器的方式改造原有全向小功率短波发射天线为定向天线。对改造后的定向天线进行实地架设,并对天线驻波比和方向图进行测试,验证了仿真结果的准确性,同时对覆盖场强进行测试,验证了改造后天线的定向效果。

关键词：笼形天线定向改造天线测试

大肠杆菌中顺式-3-羟脯氨酸羟化酶的定向改造

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食品与发酵工业 2017年第1期43卷 7-11页

作者：黄建华王晓姣魏照辉张震宇孙付保江南大学工业生物技术教育部重点实验室糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

对以L-脯氨酸为底物,产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET21a-ptrp2-H3P出发,通过易错PCR随机突变和定点突变处理,利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法... 详细信息

对以L-脯氨酸为底物,产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET21a-ptrp2-H3P出发,通过易错PCR随机突变和定点突变处理,利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法筛选出2株H3P高产菌P-2-H3、P-9-D5。经基因测序后得到5个突变位点R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I,并在出发菌基础上对此5个位点进行单一定点突变,得到5个突变体TBTR58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I。发酵24 h测其产量找出3个优势突变位点。以TBT-R58C为出发菌,依次对另外2个位点进行定点突变。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突变体。发酵24 h产量达到了1125.3 mg/L。与重组菌相比,TBT-R58C-T83I-H89Y的产量提高了53.6%。

关键词：重组大肠杆菌易错PCR 顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P) 脯氨酸-3-羟化酶定向改造