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戊四氮点燃癫痫大鼠学习记忆改变及GAP-43的表达变化

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戊四氮点燃癫痫大鼠学习记忆改变及GAP-43的表达变化

作者：栗静媛河北医科大学

学位级别：硕士

目的:临床发现30%～40%的癫痫患者除癫痫反复发作症状外,常伴有记忆力减退、注意力分散、情感行为异常及社会适应能力下降等多种认知功能受损的表现,严重影响了患者的生存质量。癫痫与认知功能损害的关系已引起人们广泛重视,并已经成为... 详细信息

目的:临床发现30%～40%的癫痫患者除癫痫反复发作症状外,常伴有记忆力减退、注意力分散、情感行为异常及社会适应能力下降等多种认知功能受损的表现,严重影响了患者的生存质量。癫痫与认知功能损害的关系已引起人们广泛重视,并已经成为现代癫痫病学研究的热点之一,然而癫痫对认知功能损害的确切机制还不清楚。一般认为,基础病因和常用的抗癫痫药物的副作用是引起认知功能损害的诱因,近些年研究表明,痫性发作本身也是癫痫患者认知损害的主要原因。本实验通过腹腔注射戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)建立起稳定的慢性癫痫实验动物模型并给予NMDA受体拮抗剂美金刚(memantine,MMT)加以干预,应用Morris水迷宫观察癫痫大鼠学习记忆变化,利用免疫组化及RT-PCR方法检测GAP-43蛋白及转录水平的变化,并进一步研究美金刚对学习记忆的改善作用,探讨癫痫后认知功能障碍的分子机制。方法:选用健康雄性SD大鼠,经两次Y-迷宫筛选合格后获得110只大鼠,随机分五组,NC组(20只)大鼠每日腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,共44d。PTZ组(30只)每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44d,自给药第31天起,每日PTZ注射前30 min腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,共14 d。PTZ+MMT(5)组(20只)每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44 d,自给药第31天起,每日PTZ注射前30 min分别腹腔注射MMT 5 mg/kg,共14d。PTZ+MMT(10)组(20只)每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44 d,自给药第31天起,每日PTZ注射前30 min分别腹腔注射MMT 10 mg/kg,共14d。PTZ+MMT(15)组(20只)每日腹腔注射1% PTZ 35 mg/kg,连续44 d,自给药第31天起,每日PTZ注射前30 min分别腹腔注射MMT 15 mg/kg,共14d。造模成功后采用Morris水迷宫进行大鼠学习和记忆成绩的测试。运用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法和免疫组化方法分别测定大鼠NC组和PTZ组海马GAP-43 mRNA和蛋白的水平变化。结果:1行为学观察PTZ组大鼠在注射PTZ后第3～7天起开始出现凝视、点头、反复洗脸动作、面部及头部抽搐等,以后发作症状逐日加重,于给药第16～24天出现全身肌阵挛、双前肢抬起,跌倒,最终发生全身强直-阵挛性发作,达到RacineⅣ～Ⅴ级的点燃标准,每次强直-阵挛发作持续数分钟到数十分钟不等。大鼠连续三次RacineⅣ～Ⅴ级发作后被认为点燃成功,共有大鼠24只完全点燃。PTZ+MMT(5)组:应用PTZ 30天时大鼠表现同单纯PTZ组,共有15只大鼠完全点燃;后14天PTZ注射前给予MMT,大鼠癫痫发作Ⅳ～Ⅴ级程度基本未变,但发作持续时间和发作后缓解时间均缩短。PTZ+MMT(10)组:应用PTZ 30天时大鼠表现同单纯PTZ组,共有16只大鼠完全点燃;后14天PTZ注射前给予MMT,大鼠癫痫发作Ⅳ～Ⅴ级程度基本未变,但发作持续时间和发作后缓解时间均缩短。PTZ+MMT(15)组:应用PTZ 30天时大鼠表现同单纯PTZ组,共有14只大鼠完全点燃;后14天PTZ注射前给予MMT,大鼠癫痫发作Ⅳ～Ⅴ级程度基本未变,但发作持续时间和发作后缓解时间均缩短,但有2只死亡。NC组无癫痫发作表现。2 Morris水迷宫检测结果定位航行实验结果:每日逃避潜伏期取其平均值进行比较,结果显示(1)实验第1天,五组大鼠逃避潜伏期比较无统计学意义(P>0.05);(2)实验第2天,各组逃避潜伏期均比第一天明显缩短,与NC组的逃避潜伏期(14.36±4.09)s比较,PTZ组大鼠的逃避潜伏期(23.85±5.66)s明显延长(P0.05);PTZ+MMT(5)和PTZ+MMT(15)长于PTZ+MMT(10),有统计学意义(P<0.05)。(3)实验第3天,与NC组(8.14±1.38)s比较,PTZ组大鼠的逃避潜伏期(15.51±1.27)s延长(P<0.01),PTZ+MMT(5),PTZ+MMT(10)和PTZ(15)组分别为(12.35±1.87)s, (9.78±2.23)s,和(14.98±1.54)s比NC组延长(P<0.05),PTZ+MMT(10)与PTZ+MMT(5)和PTZ+MMT(15)相比有统计学意义(P<0.05)。

关键词：戊四氮癫痫学习和记忆 GAP-43 美金刚

昆明小鼠和ICR小鼠年龄相关性空间学习记忆损害与不同脑区SNAP-25...

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作者：江伟安徽医科大学

学位级别：硕士

背景学习和记忆是脑的基本功能。人类和啮齿类动物学习记忆功能均随衰老而减退,尤其是空间学习记忆功能受损。但是,导致这些记忆能力减退的机制依然不明确。现在认为突触联络的完整性遭到破坏可能导致了年龄相关性学习记忆能力减退的发... 详细信息

背景学习和记忆是脑的基本功能。人类和啮齿类动物学习记忆功能均随衰老而减退,尤其是空间学习记忆功能受损。但是,导致这些记忆能力减退的机制依然不明确。现在认为突触联络的完整性遭到破坏可能导致了年龄相关性学习记忆能力减退的发生。作为SNARE复合体的主要组成成分之一SNAP-25蛋白可参与调控突触前和突触后机制,从而被公认为在突触传递过程中起着重要的作用。SNAP-25还与树突和轴突的生长以及中枢神经系统损伤后突触的可塑性有关。研究还发现海马长时程增强诱导后,SNAP-25表达量增多。这些都提示SNAP-25可能在学习和记忆中扮演某种重要角色,但目前还没有充分的实验依据。而有关脑内SNAP-25在正常衰老过程中的变化规律也不清楚,至今报道极少且结果不一致。由于直接研究人类有诸多限制,所以我们选用具有与人类基因同源性较接近且遗传背景复杂的昆明小鼠和ICR小鼠来模拟人类的衰老现象。目的①探讨年龄和性别对不同脑区SNAP-25含量的影响;②探讨空间学习记忆功能与不同脑区SNAP-25之间的关系。方法①选取三个年龄段(22月龄老年组、11月龄中年组、6月龄青年组)昆明小鼠和二个年龄段(12月龄中年组、7月龄青年组)ICR小鼠。②利用六臂辐射状水迷宫(RAWM)任务检测空间学习记忆能力。③采用免疫印迹(Western blot)技术检测SNAP-25蛋白和内参蛋白β-actin在背侧海马、腹侧海马、额叶、嗅球和顶叶中的的表达,SNAP-25灰度值与β-actin灰度值的比值作为SNAP-25的相对含量。④采用方差分析方法对六臂辐射状水迷宫实验参数和SNAP-25的相对含量进行统计学分析,并使用Spearman秩相关检测这二者之间的相关性。结果①22月龄昆明小鼠在学习期和记忆期的平均错误数和潜伏期均高于中年和青年鼠(Ps0.05);12月龄ICR小鼠在学习期和记忆期的平均错误数和潜伏期均高于青年鼠(Ps0.05);12月龄ICR小鼠在背侧海马中SANP-25的相对含量显著高于青年鼠(P学习期和记忆期的错误数和潜伏期均成正相关(Ps 学习记忆损害,其中都以雌鼠损害更明显。②昆明小鼠和ICR小鼠背侧海马SANP-25的相对含量均可出现年龄相关性升高,其中都以雌鼠升高更明显。③昆明小鼠和ICR小鼠年龄相关性空间学习记忆损害可能与背侧海马SNAP-25升高有关。

关键词：衰老小鼠学习和记忆 SNAP-25

过表达硫氧还蛋白还原酶1对卵巢去势大鼠海马神经元的保护效应

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中华行为医学与脑科学杂志 2022年第10期31卷 926-932页

作者：刘自华李晓娟赵贵玲王芳兰州大学第二医院输血科兰州730030 兰州大学第二医院神经内科兰州730030 甘肃省妇幼保健院中西医结合妇科兰州730050

目的探讨过表达硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1,TR1)对卵巢去势大鼠海马神经元的影响。方法根据随机数字表法将54只雌性SD大鼠分为正常组、卵巢去势组和卵巢去势过表达TR1组(卵巢去势-TR1组),每组18只。用慢病毒构建过表达... 详细信息

目的探讨过表达硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1,TR1)对卵巢去势大鼠海马神经元的影响。方法根据随机数字表法将54只雌性SD大鼠分为正常组、卵巢去势组和卵巢去势过表达TR1组(卵巢去势-TR1组),每组18只。用慢病毒构建过表达TR1载体,脑立体定位仪海马定位进行注射慢病毒重组体,通过qRT-PCR和Western blot检测大鼠海马组织TR1、Bcl-2,p53和p21的mRNA和蛋白水平;用Western blot检测海马Caspase-3的表达;用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂法检测海马超氧化物歧化酶(super oxide dimutase,SOD)活性、用微板法测定谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量、用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;通过旷场实验和水迷宫实验检测大鼠行为学变化。用GraphPad Prism 9.0进行统计学处理,三组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验;两组间比较采用独立样本t检验。结果(1)卵巢去势组大鼠海马组织TR1的mRNA及其蛋白水平均低于正常组大鼠(t=3.125,4.402,均P<0.05),卵巢去势-TR1组大鼠海马组织TR1的mRNA及其蛋白水平均高于卵巢去势组(t=4.945,4.845,均P<0.05)。(2)三组大鼠在水迷宫实验中的逃避潜伏期和旷场实验中的运动距离和中央区停留时间均差异有统计学意义(F=44.73,33.67,6.51,均P<0.05)。在旷场实验中,卵巢去势大鼠运动距离多于正常组[(4700±141)mm,(3967±163)mm],中央区停留的时间长于正常组[(87.33±3.93)s,(80.83±2.48)s],卵巢去势-TR1组的运动距离[(4267±150)mm]和中央区停留时间[(82.17±3.43)s]均低于卵巢去势组(均P<0.05)。在水迷宫实验中,卵巢去势组大鼠的逃避潜伏期高于对照组[(28.67±2.50)s,(19.50±2.59)s,P<0.05],而卵巢去势-TR1组逃避潜伏期低于卵巢去势组[(25.00±1.67)s,P<0.05]。(3)三组大鼠海马组织氧化应激损伤指标MDA、SOD和GSH的水平均差异有统计学意义(F=87.41,91.38,28.69,均P<0.01)。卵巢去势组大鼠海马组织的MDA水平高于正常组(P<0.05),卵巢去势-TR1组低于卵巢去势组(P<0.05);卵巢去势组SOD和GSH水平则低于正常组,而卵巢去势-TR1组SOD和GSH水平高于卵巢去势组(均P<0.05)。(4)Western blot和RT-PCR结果均显示,卵巢去势组大鼠海马组织老化相关蛋白p21和p53水平高于正常组(均P<0.05),卵巢去势-TR1组p21和p53水平则显著低于卵巢去势组(均P<0.05)。卵巢去势组大鼠海马组织凋亡蛋白Caspase-3水平高于正常组(P<0.05),卵巢去势-TR1组Caspase-3水平则显著低于卵巢去势组(P<0.05)。卵巢去势组大鼠海马组织抗凋亡蛋白Bcl-2水平低于正常组(P<0.05),卵巢去势-TR1组Bcl-2水平则显著高于卵巢去势组(P<0.05)。结论过表达硫氧还蛋白还原酶1(TR1)通过调节海马组织氧化损伤、减少细胞老化,从而减少海马部位神经元的凋亡。

关键词：卵巢去势硫氧还蛋白还原酶1 学习和记忆凋亡大鼠

3×Tg-AD小鼠的行为学和病理特征研究进展

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中国药理学与毒理学杂志 2023年第S1期37卷 64-65页

作者：田升叶田园程肖蕊山东中医药大学中医药创新研究院山东济南250355

目前阿尔茨海默病(AD)小鼠模型是利用与家族性相关的APP或PS1基因的人类突变产生的。尽管大部分AD小鼠出现细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积、神经元丢失以及认知障碍,但是在大脑皮层中并没有出现神经元纤维缠结(NFT)和细胞内Aβ沉积。3×T... 详细信息

目前阿尔茨海默病(AD)小鼠模型是利用与家族性相关的APP或PS1基因的人类突变产生的。尽管大部分AD小鼠出现细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积、神经元丢失以及认知障碍,但是在大脑皮层中并没有出现神经元纤维缠结(NFT)和细胞内Aβ沉积。3×Tg-AD小鼠是利用显微注射技术分别把两种突变基因APPSwe和tauP301L注射入单转纯合子小鼠PS1M146V的胚胎干细胞,培育出的小鼠AD模型。与同月龄的对照小鼠相比,3×Tg-AD小鼠3月龄便可在皮层神经元中发现Aβ,6月龄时可观察到小鼠空间学习记忆能力明显减弱、海马CA1区出现Aβ斑块,并开始伴有突触可塑性损伤,11月龄时出现明显的神经元丢失和细胞内Aβ斑块增加的情况,在12月龄时大脑细胞外出现明显的NFT。该模型脑内逐渐出现细胞内沉积、细胞外沉积形成的Aβ斑块和高度磷酸化的微管相关蛋白及随后由它形成的NFT,更符合临床AD患者的病理表现,相较于其他AD动物模型,在研究AD发病机制与开发治疗药物方面具有更大优势。

关键词：阿尔茨海默病 3×Tg-AD小鼠认知学习和记忆 β-淀粉样蛋白沉积神经元纤维缠结

TDCPP对小鼠海马-内侧前额叶回路突触可塑性的影响及机制研究

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TDCPP对小鼠海马-内侧前额叶回路突触可塑性的影响及机制研究

作者：张一鸣山东师范大学

学位级别：硕士

磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)作为工业材料中广泛添加的新型有机磷酸酯类阻燃剂,已在各类环境介质及生物体内广泛检出,其环境生态破坏效应及潜在生物毒性备受关注,尤以代表性神经毒性研究,已成为生态毒理学及环境健康热点科学问题... 详细信息

磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)作为工业材料中广泛添加的新型有机磷酸酯类阻燃剂,已在各类环境介质及生物体内广泛检出,其环境生态破坏效应及潜在生物毒性备受关注,尤以代表性神经毒性研究,已成为生态毒理学及环境健康热点科学问题。海马(hippocampus,HP)和内侧前额叶(medial prefrontal cortex,m PFC)均是参与学习记忆及情绪控制的两个主要脑区,二者之间大量直接或间接的纤维投射构成了HP-m PFC回路,与学习记忆、情感认知等脑高级认知功能密切相关。而突触可塑性则一直以来被认为是上述脑高级功能的神经基础,可呈现出结构及功能可塑性的变化。当前关于TDCPP的神经毒性研究多集中于鱼类及离体细胞,尚缺乏哺乳动物在体环境毒理相关文献积累及毒性机制的多水平联合分析。将HP-m PFC回路与反映脑高级功能的行为表征相结合,可更加全面、深入的了解整个神经系统的功能状态。基于此,本研究以雄性ICR小鼠为研究对象,结合动物行为学表征分析,明确TDCPP亚慢性暴露所致小鼠神经毒性效应及其特点;以HP-m PFC回路的突触可塑性为指标(包括突触数量及结构、突触相关蛋白表达情况、突触超微结构变化情况等),借助电生理学及细胞生物学、分子生物学技术,探究整个回路中参与反应的突触部位,明确其毒性效应的神经机制。结果如下:1)行为学的研究发现,随着TDCPP暴露剂量的升高,各实验组小鼠自发活动行为均降低。如反映其活动意愿的跨格次数在各实验组小鼠均显著降低,反映其主动探究意识的直立次数在中高浓度组小鼠出现极显著降低。同时,研究还发现,与对照组相比,各浓度组小鼠对新物体的探索明显减少,认知指数略有降低。提示TDCPP的亚慢性暴露可致小鼠认知、情感的水平降低及学习记忆能力的下降;2)进一步的机制探究发现,TDCPP可对小鼠HP-m PFC回路的突触结构可塑性产生影响,包括改变该回路树突棘密度,降低两脑区突触数量,减小突触后致密物厚度,破坏线粒体的正常结构等;3)研究同时还发现,TDCPP增加小鼠HP锥体神经元的平均放电频率,增强神经元放电活动的规律性,改变m PFC锥体神经元的电活动,降低乙酰胆碱含量、提高乙酰胆碱酯酶活性,导致两脑区突触功能可塑性的改变。结论:本研究结果初步证实TDCPP亚慢性暴露可降低小鼠的学习记忆能力及认知情感表达水平,其主要作用途径是通过影响HP-m PFC回路中突触结构和功能的可塑性所致。

关键词：磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯海马内侧前额叶突触可塑性学习和记忆

Physical Exercise Improves Memory,Learning,and Motor Activity by Suppressing Mitochondrial Mediated Apoptosis in the Brain of Hypoxic Ischemic Encephalopathy Rat Model

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Physical Exercise Improves Memory,Learning,and Motor Activit...

作者： Fred Gendi 郑州大学

学位级别：硕士

背景缺氧缺血性脑病(Hypoxic Ischemic Encephalopathy,HIE)是围产期由于缺氧引起的新生儿严重中枢神经系统损害疾病。它是造成早产和足月新生儿死亡的主要原因,也容易引发严重的神经发育问题,包括脑瘫、神经感觉异常和认知缺陷。据统计... 详细信息

背景缺氧缺血性脑病(Hypoxic Ischemic Encephalopathy,HIE)是围产期由于缺氧引起的新生儿严重中枢神经系统损害疾病。它是造成早产和足月新生儿死亡的主要原因,也容易引发严重的神经发育问题,包括脑瘫、神经感觉异常和认知缺陷。据统计,在发达国家每1000名出生的婴儿中有1至8名出现HIE的症状,而在发展中国家其发病率更是高达26‰,并且该疾病占到了全球婴儿死亡总数的23%。目前针对新生儿缺血缺氧性脑病的治疗方法,例如低温治疗和促红细胞生成素治疗,已经用于围产期缺氧缺血性脑损伤后的常规临床操作。但是,由于病情所适用的治疗时间窗口较短以及对促红细胞生成素治疗的窗口期不明确,这些临床治疗方式的效果有待进一步研究。因此,为有效预防、管理和治疗缺氧缺血性脑病及其相关后遗症(出现学习、记忆和运动功能缺陷甚至脑性瘫痪等状态),本研究通过探寻线粒体相关蛋白的变化,掌握细胞死亡的机制,从而为制定新的治疗策略提供思路。由于大脑维持正常功能时对能量代谢的高要求,我们可通过研究在HIE后相关能量代谢的改变来揭示其潜在的分子机制,使科学家能够利用现代化分子学技术来解决问题。因为线粒体在参与能量代谢的过程中发挥了举足轻重的作用,所以本研究的重点在线粒体上。同时,也有研究表明体育锻炼可以改善认知和运动功能,促进神经生长与发育,这些实验从某一层面上证明了运动训练对神经退行性疾病的治疗益处。因此,我们提出科学假设:游泳运动可以改善大鼠HIE模型动物中大脑的线粒体功能,降低缺氧缺血所诱导的线粒体凋亡蛋白从细胞质到细胞核的转移,抑制线粒体的病变,减轻大脑内神经细胞的死亡,从而增强与HIE表现所相关的运动功能、记忆和学习功能。本研究的相关指标包括:凋亡诱导因子(Apoptosis Inducing Factor,AIF)、细胞色素C(Cytochrome C,Cyto.C)、线粒体衍生半胱天冬酶激活剂(Second mitochondria-derived activator of caspases,Smac)、视神经萎缩蛋白1(Optic atrophy1,OPA1)、以及细胞质裂解的Cleaved-Caspase-3。据报道,它们以复杂的方式相互作用,在一定程度上决定了线粒体在细胞中所发挥的功能与作用。因此在缺氧缺血损伤的情况下去研究它们的变化,并且给予一定运动干预,可能让我们深入了解运动训练改善大脑功能的机制。目的该实验通过建立HIE大鼠模型,对比HIE模型组和假手术组中相关线粒体蛋白之间的改变,验证线粒体的内在凋亡级联是否参与缺氧缺血性脑组织损伤的病理机制。并通过运动康复的手段,探究运动训练是否可以通过改变线粒体相关蛋白的表达,影响线粒体的凋亡机制,从而改善缺血缺氧性脑病的损伤,为缺氧缺血性脑病的治疗提供新靶点。方法(1)HIE模型大鼠的建立及运动训练:选择出生后第7-10天的幼鼠,异氟醚麻醉,取仰卧位,固定四肢,在颈部正中线做纵向切口,定位并结扎左侧颈总动脉。待幼鼠恢复后,将其置于氧分压为8%的缺氧环境中培育90分钟,完成建模。假手术组只在相应区域做切口并缝合,无后续处理。最后将所有参与实验的幼鼠随机分为四组:假手术无运动训练组(Sham-NT);假手术运动训练组(Sham-T);缺氧缺血性脑病无运动训练组(HIE-NT);缺氧缺血性脑病运动训练组(HIE-T)。其中运动训练组进行为期4周的游泳训练(90min/天,5天/周)。(2)行为测试1爬杆直立测试将各组动物正面朝上放在布带包裹的杆子(直径约3.0cm,长约150cm)上,保持水平位置,然后逐渐将杆子一端抬起至垂直位置,记录大鼠所坚持的时间(以秒为单位)。该实验主要评估其运动平衡能力。2 Morris水迷宫测试训练阶段将6周龄的大鼠每天从4个不同的象限逐次放入水中,观察实验动物搜寻平台所用时间。该实验状态共持续5天。休息一天后于第7天进行空间探索测试。撤去原有浮台,按照既定的程序参数进行检测。记录每只大鼠在设定的60秒时间内越过平台的次数,从而分析其学习记忆功能,也可以通过分析大鼠的运动路径、游泳速度和总距离,评估实验动物的运动功能。(3)蛋白质检测:1蛋白质印迹试验采用Western blot技术检测大鼠海马和大脑皮层AIF、Cyto.C.、Smac、OPA1和Cleaved caspase-3的表达变化。通过比较分析不同组中的蛋白质表达差异,观察其变化规律。2免疫荧光实验采用免疫荧光技术,检测不同组动物大脑运动皮层中相应蛋白的荧光表达差异。通过比较分析蛋白质表达情况,观察组间的变化。结果(1)与Sham组相比,HIE模型大鼠表现出可观察到的发育异常。在Morris水迷宫和爬杆直立测试中,认知能力和运动功能存在显著差异(P<0.01)。HIE模型组表现出与临床病患相似的行为

关键词：缺氧缺血性脑病凋亡诱导因子运动线粒体学习和记忆

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杜仲花粉总黄酮的制备及抗衰老作用

杜仲花粉总黄酮的制备及抗衰老作用

作者：高梦珂河南大学

学位级别：硕士

目的:探讨杜仲花粉总黄酮的制备工艺,建立杜仲花粉总黄酮的质量控制方法,初步探究杜仲花粉总黄酮的抗衰老作用。方法:筛选提取杜仲花粉总黄酮的合适方法;利用大孔吸附树脂对黄酮粗提物进行纯化,对上样浓度、上样体积、吸附时间、洗脱速... 详细信息

目的:探讨杜仲花粉总黄酮的制备工艺,建立杜仲花粉总黄酮的质量控制方法,初步探究杜仲花粉总黄酮的抗衰老作用。方法:筛选提取杜仲花粉总黄酮的合适方法;利用大孔吸附树脂对黄酮粗提物进行纯化,对上样浓度、上样体积、吸附时间、洗脱速度、洗脱液、洗脱体积进行考察,优化纯化工艺;检测纯化前后杜仲花粉总黄酮含量,以及纯化后芦丁、异槲皮素含量,并对15批杜仲花粉总黄酮进行薄层色谱、指纹图谱等方法进行综合定性鉴别研究,制定杜仲花粉总黄酮的质量标准(草案);杜仲花粉总黄酮对衰老小鼠的影响:雄性昆明小鼠,体重14～16g,60只,随机分为6组,每组10只,分别为正常组、模型组、维生素C组(100mg/kg/d)、杜仲花粉总黄酮高剂量组(320mg/kg/d)、中剂量组(160mg/kg/d)、低剂量组(80mg/kg/d),除正常组外,采用颈背部皮下注射D-半乳糖溶液(D-galactose,D-gal,400mg/kg/d)诱导小鼠衰老,每周称一次体重,灌胃6周后,采用Morris水迷宫进行动物行为学测试,行为学测试结束后,将所有实验动物处死,收集样本待检;采用HE染色观察脑和肝脏的病理变化;采用试剂盒检测实验小鼠血清、脑组织和肝脏中的超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和MDA活力及含量的变化;采用免疫组化(Immunohistochemical,IHC)技术检测小鼠海马区核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、血红素加氧酶-1(HO-1)的表达;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠脑组织中Nrf2、Keap1的表达水平;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小鼠脑组织中Nrf2、Keap1、HO-1的基因表达水平。结果:(1)杜仲花粉总黄酮的最佳制备工艺为:杜仲花粉采用超声提取法,用70%乙醇溶液按料液比1:20,浸泡1h,超声提取3次,每次40min,合并滤液,滤液浓缩后采用HPD100大孔树脂吸附,上样浓度0.50mg/ml,上样体积1BV,吸附时间6h,吸附完成后,以蒸馏水洗至洗脱液无色后,用50%的乙醇溶液以1ml/min的洗脱流速洗脱,洗脱体积3BV,得到杜仲花粉总黄酮含量达50.4%,再经过聚酰胺进一步纯化后,总黄酮含量达到70.8%。(2)建立了杜仲花粉总黄酮薄层色谱鉴定、指纹图谱鉴定方法,制订了杜仲花粉总黄酮的质量标准草案。(3)经杜仲花粉总黄酮干预后,行为学实验中小鼠的潜伏期、穿越原平台次数、平台象限游泳时间、平台象限路程百分比均大于模型组,其中杜仲花粉总黄酮中剂量组小鼠的潜伏期、平台所在象限运动时间、穿越平台次数与模型组相比具有统计学意义(P学习和记忆能力,提高小鼠抗氧化水平,并且能够激活Keap1-Nrf2信号通路,调节小鼠体内氧化应激水平,发挥抗衰老作用。

关键词：杜仲花粉总黄酮大孔树脂学习和记忆 Keap1-Nrf2信号通路

磷脂酰丝氨酸乳剂改善脑认知功能的机制研究及工艺参数初探

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磷脂酰丝氨酸乳剂改善脑认知功能的机制研究及工艺参数初探

作者：刘秉宜聊城大学

学位级别：硕士

磷脂酰丝氨酸(PS)是细胞膜的主要成分之一,在人体的神经系统中,它通过改变神经细胞膜的流动性和通透性来调节大脑的记忆功能和情绪的稳定。大量的研究表明磷脂酰丝氨酸在抗炎,抗抑郁,提升脑认知功能方面有很好的疗效。初代的磷脂酰丝氨... 详细信息

磷脂酰丝氨酸(PS)是细胞膜的主要成分之一,在人体的神经系统中,它通过改变神经细胞膜的流动性和通透性来调节大脑的记忆功能和情绪的稳定。大量的研究表明磷脂酰丝氨酸在抗炎,抗抑郁,提升脑认知功能方面有很好的疗效。初代的磷脂酰丝氨酸产品原料主要来源于牛脑,其安全性不能得到保证,因此限制了磷脂酰丝氨酸的应用。随着技术的进步,从大豆中提取分离的磷脂酰丝氨酸具备更安全的特性,磷脂酰丝氨酸已被世界各国纳入到功能性食品行列,在我们国家,磷脂酰丝氨酸已纳入到新食品原料名单中。市场上磷脂酰丝氨酸的终端产品主要是胶囊,粉剂和片剂等。胶囊的体积大,会造成老人和小孩吞咽困难的问题;粉剂因为其水溶性较差,生物利用度不高限制了他的应用。因此制备一款高稳定性高生物利用度的磷脂酰丝氨酸乳剂将能更好的推动磷脂酰丝氨酸产业的发展。本研究通过响应面的方法筛选出最优的乳剂配方,使用稳定性考察,粒径变化,乳析指数等物理指标评价了各组乳剂的稳定性。接下来通过行为学方法对制备的高稳定性乳剂进行生物学功能验证和比较磷脂酰丝氨酸乳剂和磷脂酰丝氨酸粉剂在生物利用度上的差异。探讨了磷脂酰丝氨酸发挥神经保护作用的相关机制研究。本论文主要分为以下四个部分:一、磷脂酰丝氨酸乳剂的制备及其稳定性研究通过响应面的方法,筛选出最优的磷脂酰丝氨酸乳剂配方。根据最优配方制备不同浓度磷脂酰丝氨酸的乳剂并通过粒径变化,乳析指数评价各组乳剂的稳定性。在稳定性考察实验中发现PS可以提高乳剂的稳定性。接下来,我们的结果表明PS提高乳剂稳定性是与乳剂外相粘度的增加和界面张力、离心稳定常数的降低相关。二、磷脂酰丝氨酸的生物学功能验证通过水迷宫的实验,验证磷脂酰丝氨酸乳剂在提升小鼠的空间记忆能力和学习能力方面效果等同于或优于磷脂酰丝氨酸粉剂,经过PS干预后,小鼠水迷宫训练阶段的逃逸时间显著低于对照组小鼠。通过旷场实验验证了额外补充磷脂酰丝氨酸粉剂/乳剂不会对小鼠的情绪造成不好的影响,验证了磷脂酰丝氨酸的安全性。ELISA的结果表明2%PS乳剂组小鼠大脑中的PS含量(12 mg/L)显著高于2%PS粉剂(8.5 mg/L)。证明磷脂酰丝氨酸乳剂在大脑中富集的程度高于磷脂酰丝氨酸粉剂。三、磷脂酰丝氨酸乳提升小鼠空间记忆能力和学习能力的机制研究通过Western Blot检测了脑神经营养因子(BDNF)及其受体Trk B和支架蛋白PSD95的蛋白表达水平,评价PS对神经细胞的保护作用。然后通过免疫组织化学染色的方法检测了髓鞘碱性蛋白的表达情况,以评价小鼠神经髓鞘的稳定性。然后通过WB和RT-PCR的方法检测了与髓鞘相关的神经调节因子(Nrg-1)及其受体Erb B4的表达情况。结果显示,磷脂酰丝氨酸提升小鼠的空间记忆和学习能力可能与BDNF/Trk B信号通路和Nrg-1/Erb B4信号通路相关。四、磷脂酰丝氨酸通过Wnt信号通路增加成熟神经元的数量首先通过RT-PCR的方法发现磷脂酰丝氨酸能够上调神经干细胞标志物Nestin的基因表达。然后,通过免疫组织化学染色的方法验证了磷脂酰丝氨酸上调成熟神经元的标志物Neu N的蛋白表达。我们的结果证明了磷脂酰丝氨酸通过激活神经干细胞,使其分化成更多的成熟神经元。最后通过RT-PCR和WB的方法验证Wnt信号通路参与神经干细胞的激活过程。

关键词：磷脂酰丝氨酸乳剂学习和记忆神经保护髓鞘

参芪益智颗粒对5XFAD转基因小鼠学习记忆能力和脑内β淀粉样蛋白_(1-42)含量的影响

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中国中医药信息杂志 2016年第5期23卷 51-56页

作者：钱燕静甄军丽卫东锋郑焱王晓民首都医科大学基础医学院神经生物学系教育部神经变性病重点实验室北京100069 北京脑重大疾病研究院北京100069 中国中医科学院中医临床基础医学研究所北京100700

目的观察参芪益智颗粒对阿尔茨海默病5XFAD转基因小鼠行为学和脑组织β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)含量的影响,探讨其改善5XFAD小鼠学习记忆能力的作用机制。方法将4月龄C57BL?6野生型小鼠随机分为生理盐水对照组和中药对照组,同时将同月龄... 详细信息

目的观察参芪益智颗粒对阿尔茨海默病5XFAD转基因小鼠行为学和脑组织β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)含量的影响,探讨其改善5XFAD小鼠学习记忆能力的作用机制。方法将4月龄C57BL?6野生型小鼠随机分为生理盐水对照组和中药对照组,同时将同月龄5XFAD小鼠随机分为模型组、参芪益智颗粒组和石杉碱甲组,每组15只,各给药组给予相应药物灌胃,连续60 d。给药结束后,采用筑巢实验、避暗实验和Morris水迷宫实验评价各组小鼠学习和记忆能力;免疫组化和免疫荧光方法观察各组小鼠皮层和海马组织老年斑块、Aβ1-42、小胶质细胞激活的标记物小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白1及星形胶质细胞激活标记物胶质纤维酸性蛋白含量的变化。结果与生理盐水对照组比较,模型组小鼠筑巢实验得分明显降低,避暗实验步入潜入期明显缩短,水迷宫实验逃避潜伏期明显延长,脑内老年斑块明显增多,Aβ1-42含量明显升高,胶质细胞激活明显增强。参芪益智颗粒组小鼠上述指标均恢复或接近至野生型小鼠水平,与模型组小鼠比较差异有统计学意义(P学习和记忆能力的机制与减少脑内老年斑数量、抑制胶质细胞过度激活、减少脑内Aβ1-42的含量有关。

关键词：参芪益智颗粒阿尔茨海默病 5XFAD转基因小鼠学习和记忆 β淀粉样蛋白神经胶质细胞