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东方蜜蜂微孢子虫一新型孢壁蛋白的基因克隆、表达及亚细胞定位

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昆虫学报 2021年第9期64卷 1070-1079页

作者：熊亮敖塘堰张真马振刚周泽扬重庆师范大学重庆市动物生物学重点实验室重庆市媒介昆虫重点实验室重庆401331

【目的】微孢子虫(Microsporidia)孢壁在孢子构成及孢子侵染宿主过程中扮演重要的角色。本研究旨在鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae新型孢壁蛋白,并进行基因克隆和原核表达,明确其亚细胞定位。【方法】通过在线软件对东方蜜... 详细信息

【目的】微孢子虫(Microsporidia)孢壁在孢子构成及孢子侵染宿主过程中扮演重要的角色。本研究旨在鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae新型孢壁蛋白,并进行基因克隆和原核表达,明确其亚细胞定位。【方法】通过在线软件对东方蜜蜂微孢子虫新型孢壁蛋白AAJ76_1400036761序列进行生物信息学分析。利用PCR法获取目的片段并将其克隆至原核表达载体pCold II中,利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。以获得的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光技术和免疫胶体金定位技术对该蛋白进行亚细胞定位分析;利用蛋白质免疫印迹法检测该蛋白与东方蜜蜂微孢子虫几丁质壳的互作。【结果】在MicrosporidiaDB数据库中获得AAJ76_1400036761基因序列,基因全长681 bp,编码226个氨基酸;预测等电点为6.84,分子量为26.19 kD。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明AAJ76_1400036761重组蛋白能够在大肠杆菌Eescherichia coli Rosetta中高量表达。Western blot结果表明,制备的多克隆抗体能够特异地识别东方蜜蜂微孢子虫总蛋白中的AAJ76_1400036761,说明其在成熟东方蜜蜂微孢子虫中有表达。亚细胞定位结果显示,AAJ76_1400036761定位于东方蜜蜂微孢子虫孢壁上。重组蛋白AAJ76_1400036761能够与蜜蜂微孢子虫的几丁质壳结合。【结论】AAJ76_1400036761蛋白在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中有表达;该蛋白定位于东方蜜蜂微孢子虫孢壁上,为东方蜜蜂微孢子虫新的孢壁蛋白。本研究为深入研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：东方蜜蜂微孢子虫孢壁蛋白原核表达多克隆抗体亚细胞定位

虾肝肠胞虫孢壁蛋白SWP7的多克隆抗体制备和定位分析

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中国渔业质量与标准 2022年第6期12卷 1-8页

作者：包杰宁梓健丰程程姜宏波沈阳农业大学动物科学与医学学院辽宁沈阳110866 东北畜禽疫病研究教育部重点实验室辽宁沈阳110866

孢壁作为微孢子虫最外层的结构,是连接微孢子虫与外界环境的桥梁。因此,研究孢壁蛋白对阐明宿主-微孢子虫相互作用的机制具有重要意义。本研究以虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)孢壁蛋白7(spore wall protein 7,SWP7)为研... 详细信息

孢壁作为微孢子虫最外层的结构,是连接微孢子虫与外界环境的桥梁。因此,研究孢壁蛋白对阐明宿主-微孢子虫相互作用的机制具有重要意义。本研究以虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)孢壁蛋白7(spore wall protein 7,SWP7)为研究对象,首先通过生物信息学分析其序列基本特征,然后合成该基因序列、构建原核表达载体、诱导蛋白表达并纯化,最后制备多克隆抗体。通过Western blotting验证该抗体的特异性后,利用间接免疫荧光技术观察和分析该蛋白在成熟孢子上的定位情况。结果表明,SWP7的N末端存在信号肽序列,且无跨膜域和GPI锚定位点,可能作为分泌蛋白发挥功能。同时,预测到SWP7有多个磷酸化修饰位点,可能参与肝肠胞虫信号转导、免疫应答、受体激活等功能。间接免疫荧光结果显示SWP7均匀地表达于成熟EHP孢壁上,且可能参与到萌发过程中。研究结果可为明确SWP7在肝肠胞虫入侵宿主中的功能及其机制提供理论基础。

关键词：虾肝肠胞虫孢壁蛋白多克隆抗体间接免疫荧光

虾肝肠胞虫生活史及孢壁蛋白EhSWP7的多克隆抗体制备研究

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虾肝肠胞虫生活史及孢壁蛋白EhSWP7的多克隆抗体制备研究

作者：宁梓健沈阳农业大学

学位级别：硕士

虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）是一种严格细胞内寄生的微孢子虫,属于壶孢目、肠胞虫科、肠胞虫属,可感染多种经济虾类,大多存在于虾肝胰腺小管上皮细胞。自2001年EHP被发现以来,世界上主要的凡纳滨对虾养殖地区都有虾... 详细信息

虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）是一种严格细胞内寄生的微孢子虫,属于壶孢目、肠胞虫科、肠胞虫属,可感染多种经济虾类,大多存在于虾肝胰腺小管上皮细胞。自2001年EHP被发现以来,世界上主要的凡纳滨对虾养殖地区都有虾肝肠胞虫病的报道,但目前仍然缺乏对EHP生活史和感染机制的了解。目前在微孢子虫孢壁中至少发现了7种蛋白,在EHP中已鉴定并报道了一种孢壁蛋白。本论文通过分子生物学和透射电镜对EHP的生活史进行了研究,利用真核生物分泌蛋白预测流程Eu Sec Pred2.0预测EHP全基因组中的分泌蛋白,并对分泌蛋白长度、信号肽长度、切割位点处氨基酸分布等信息及分泌蛋白的功能进行分析。随后,以预测获得的分泌蛋白之一-EhSWP7作为研究对象,分析其序列和结构等特征,然后构建了EhSWP7的原核表达载体,诱导蛋白表达,并用其免疫动物,制备获得了EhSWP7多克隆抗体。通过免疫印迹技术验证获得多克隆抗体的特异性后,利用间接免疫荧光技术对虾肝肠胞虫的EhSWP7定位特征进行研究分析。本文的研究结果总结为以下三个方面:1.虾肝肠胞虫生活史的初步研究经透射电镜观察分析,EHP的生活史可划分为感染期、裂殖增殖期和孢子形成期。本研究还表明,健康的虾可以通过食用患病的肝胰腺组织感染EHP。早期裂殖增殖细胞以独特的电子透明层状包涵体（electron-lucent lamellar inclusions,ELI）为特征,其中大部分会首先进行二分裂,然后是多次核分裂。在孢子形成期开始时,观察到电子致密盘（electron-dense disk,EDD）。孢子形成早期,EDD在细胞质中随机分布,但多次核分裂后,EDD的密度明显增加。随后,发育进入孢子形成晚期,EDD堆叠在一起,融合并拉长,形成一个弧形来包裹细胞核,这个弧形就是极管,它的一端被锚定盘固定,两者构成极管-锚定盘复合物。母孢子的质膜向内凹陷时,致密的分泌物使质膜增厚,这标志着开始凹陷分裂形成孢子母细胞。孢子母细胞包括了一个核、一个螺旋4-5圈的极管、锚定盘和ELI,这些结构重排组装,发育为成熟孢子。在一个肝胰腺细胞内可观察到不同发育阶段的EHP。一些成熟的孢子通过胞吐作用排出。基于以上结果和之前的研究,我们构建了EHP的整个生命周期,为今后EHP的预防和治疗工作提供依据。2.虾肝肠胞虫全基因组分泌蛋白的预测分析利用生物信息学方法筛选EHP全基因组中的分泌蛋白,然后对分泌蛋白和信号肽长度、切割位点处氨基酸组成等信息及分泌蛋白的功能进行统计分析。结果表明,分泌蛋白大部分由30～400个氨基酸组成,信号肽大部分由9～32个氨基酸组成,切割位点附近疏水性氨基酸所占比例最高。通过对信号肽进行基序分析,发现信号肽存在显著基序NV[VT][IK]CA[ED][SA]。对所获蛋白质进行功能注释,发现了多种与微孢子虫黏附侵染、调节细胞周期和免疫反应等相关的关键蛋白。3.EhSWP7的抗体制备及定位分析利用生物信息学方法分析EhSWP7的基因序列特征,结果显示:EhSWP7序列含有一个信号肽,且信号肽附近氨基酸疏水性较高;该蛋白序列中未发现潜在的糖基化位点,但预测到多个磷酸化位点;未预测到已知功能的结构域。通过原核蛋白表达以及纯化获得EhSWP7,免疫动物收集到相应多克隆抗体。免疫印迹实验得出,制备的抗体具有较好的特异性和较高的灵敏度。间接免疫荧光实验结果表明,整个孢壁均有蛋白荧光信号。EhSWP7表达于整个孢壁,表明其可能在黏附宿主细胞、介导入侵方面发挥重要作用。综上所述,本研究构建了EHP的生活史、预测分析了EHP的分泌蛋白并对孢壁蛋白7（EhSWP7）进行了定位分析。本论文研究结果有助于了解EHP侵染宿主细胞的过程,为EHP的预防和治疗工作提供依据。

关键词：微孢子虫虾肝肠胞虫生活史分泌蛋白孢壁蛋白

家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）垂直传播机制研究——孢壁蛋白NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30在胚传过程中的作用分析

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家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）垂直传播机制研究——孢壁蛋白N...

作者：裴柏琰西南大学

学位级别：硕士

家蚕微粒子虫(Nosema bombycis)可以经卵垂直传播造成子代带毒,是其对蚕业危害巨大的主要原因,但其胚传的分子机理尚待阐明。本课题组前期对家蚕微粒子虫重庆分离株(NbCQ1)的胚传机制进行研究发现,孢子表面与家蚕卵黄原蛋白(Bm Vg)的结... 详细信息

家蚕微粒子虫(Nosema bombycis)可以经卵垂直传播造成子代带毒,是其对蚕业危害巨大的主要原因,但其胚传的分子机理尚待阐明。本课题组前期对家蚕微粒子虫重庆分离株(NbCQ1)的胚传机制进行研究发现,孢子表面与家蚕卵黄原蛋白(Bm Vg)的结合对其胚传具有重要作用,而且孢子表面蛋白NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30可以与Bm Vg的VWD结构域结合,但对NbCQ1的胚传是否起到关键作用尚不清楚。同时,NbCQ1可自然感染斜纹夜蛾(Spodoptera litura,Sl)和棉铃虫(Helicoverpa armigera,Ha)等多种鳞翅目昆虫,但能否在这些昆虫中胚传,以及上述三个孢壁蛋白又具有怎样的作用,也尚无相关研究报道。本研究进一步明确了NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30与Bm Vg-VWD的结合作用,并以此为基础分析了孢壁蛋白对NbCQ1胚传的作用,以及NbCQ1在斜纹夜蛾和棉铃虫中的胚传性和孢壁蛋白的介导作用。主要结果如下:1.NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30与Bm Vg-VWD的结合作用利用孢壁蛋白抗体和Bm Vg的抗体对分离自家蚕雌蛹中的孢子进行IFA分析发现,NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30能够结合Bm Vg。其次,通过原核表达获得了NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30及Bm Vg-VWD可溶性重组蛋白,利用IFA对分离自雄蛹的NbCQ1孢子进行蛋白孵育检测发现,NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30与Bm Vg-VWD具有结合作用,并利用Forte Bio Octet进一步明确了这些结合作用。此结果为分析孢壁蛋白对NbCQ1胚传的作用奠定了基础。2.NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30对NbCQ1在家蚕中胚传的作用分析利用NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30重组蛋白在体外和体内竞争性结合Bm Vg-VWD,检测NbCQ1对家蚕卵巢管的感染,发现卵巢管的感染量显著降低。进一步,利用NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30的抗体,在体外和体内对NbCQ1孢子表面进行封闭,检测病原的感染,发现卵巢管和子代蚕卵中的感染量均显著降低。此结果表明,NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30对NbCQ1在家蚕中的胚传发挥着重要作用。3.NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30对NbCQ1在斜纹夜蛾和棉铃虫中胚传的作用分析对斜纹夜蛾和棉铃虫的幼虫添毒NbCQ1,取羽化后雌虫的卵巢管、所产的卵以及子代幼虫进行石蜡切片观察分析,结果发现均有感染,表明NbCQ1在这两种昆虫中均可胚传。利用制备的Sl Vg-VWD和Ha Vg-VWD的多克隆抗体对分离自雌蛹的孢子进行IFA分析,发现孢子表面结合有Sl Vg和Ha Vg。进一步,利用IFA和Western blotting对分离自雄蛹的孢子进行蛋白孵育检测,发现孢子表面能够结合Sl Vg-VWD和Ha Vg-VWD。继而利用孢壁蛋白抗体、Sl Vg-VWD和Ha Vg-VWD的抗体对上述处理后的材料进行IFA分析,发现NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30与Sl Vg-VWD和Ha Vg-VWD均具有结合作用。最后,利用孢壁蛋白抗体封闭孢子表面的结合位点后,显著降低了NbCQ1对斜纹夜蛾和棉铃虫卵巢管的感染。此结果表明,NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30对NbCQ1在斜纹夜蛾和棉铃虫中的胚传亦起到重要作用。综上,本研究明确了NbSWP12、NbSWP26和NbSWP30对NbCQ1在家蚕、斜纹夜蛾和棉铃虫中胚传的重要作用,以及NbCQ1在斜纹夜蛾和棉铃虫中的胚传性,为深入解析微孢子虫的胚传机制提供了参考,并为家蚕微粒子病抗性素材的创建研究提供了候选靶标。

关键词：家蚕微粒子虫经卵垂直传播孢壁蛋白卵黄原蛋白斜纹夜蛾棉铃虫

蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因的克隆分析与原核表达

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中国病原生物学杂志 2015年第11期10卷 980-985页

作者：朱峰肖圣燕张永红唐芬芬邵榆岚陈世良白兴荣云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所云南蒙自661101

目的克隆并表达蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12。方法根据家蚕微孢子虫基因组数据库信息设计简并引物进行PCR扩增,克隆得到蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因。利用生物信息学软件对NpSWP12的基因与蛋白序列进行分析与结构功能预测。... 详细信息

目的克隆并表达蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12。方法根据家蚕微孢子虫基因组数据库信息设计简并引物进行PCR扩增,克隆得到蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因。利用生物信息学软件对NpSWP12的基因与蛋白序列进行分析与结构功能预测。将该蛋白基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,转化表达载体至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE与Western blot检测。结果蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因长687bp,编码228个氨基酸残基(基因登录号:KT287071),预测蛋白质分子质量单位为26.6ku,等电点(pI)为5.96。蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因结构为单外显子结构,编码的蛋白中α螺旋占77.19%。该编码蛋白含有1个BAR结构域(Bin/Aphiphysin/Rvs domain),属BAR结构域蛋白质超家族成员。NpSWP12与家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP12核苷酸序列序列相似性为95.2%,氨基酸序列相似性为96.9%。表达载体NpSWP12/pET-30a(+)转入BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,得到的重组蛋白rNpSWP12与理论蛋白分子质量大小(30ku)相符。Western blot鉴定。结论成功克隆了蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因,构建的NpSWP12/pET-30a(+)重组原核表达载体表达预期分子质量的融合蛋白,该蛋白能被相应抗体识别,为进一步研究NpSWP12的细胞定位和功能奠定了基础。

关键词：蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白序列分析原核表达

柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因NpSWP1的克隆及序列分析与原核表达

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蚕业科学 2014年第4期40卷 688-693页

作者：文竹姜义仁王斌赫孙影李喜升王勇秦利沈阳农业大学生物科学技术学院辽宁省昆虫资源工程技术研究中心沈阳110866 沈阳农业大学植物保护学院沈阳110866

微孢子虫孢壁蛋白在侵染宿主的过程中发挥着重要作用。从已构建的柞蚕微孢子虫cDNA文库中筛选出一条孢壁蛋白基因的EST序列,并结合柞蚕微孢子虫感染柞蚕中肠的转录组数据设计特异性引物进行RT-PCR和3'-RACE扩增,克隆得到了一个柞蚕微孢... 详细信息

微孢子虫孢壁蛋白在侵染宿主的过程中发挥着重要作用。从已构建的柞蚕微孢子虫cDNA文库中筛选出一条孢壁蛋白基因的EST序列,并结合柞蚕微孢子虫感染柞蚕中肠的转录组数据设计特异性引物进行RT-PCR和3'-RACE扩增,克隆得到了一个柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因。该基因ORF长837 bp,编码278个氨基酸,蛋白质分子质量32.02 kD,等电点(pI)7.02。通过Blast比对分析,该基因与家蚕微孢子虫孢子内壁蛋白基因NbSWP1(GenBank登录号:EOB12097.1)的序列相似度为85%,二者编码的氨基酸序列相似度达79%,将该基因命名为NpSWP1(GenBank登录号:KJ573111),初步推测NpSWP1是一种孢子内壁蛋白。将NpSWP1基因与原核表达载体pEASY-E1连接,构建原核表达重组质粒并转化Transetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导5 h后,SDS-PAGE和Western blot检测重组菌液能够产生与预期结果相近的大小约32 kD的目的融合蛋白。研究结果有利于进一步开展NpSWP1的细胞定位和功能研究。

关键词：柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因克隆原核表达免疫印迹分析

柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

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蚕业科学 2013年第5期39卷 935-939页

作者：米锐李亚洁孟楠孙永欣李学军温志新李树英辽宁省农业科学院大连生物技术研究所辽宁大连116024

柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)孢壁蛋白在侵染宿主的过程中扮演重要角色,制备柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体可为建立病害的快速诊断技术提供免疫试剂,并有利于研究孢壁蛋白的功能。采用沸水浴法提取柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为抗原免疫... 详细信息

柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)孢壁蛋白在侵染宿主的过程中扮演重要角色,制备柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体可为建立病害的快速诊断技术提供免疫试剂,并有利于研究孢壁蛋白的功能。采用沸水浴法提取柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为抗原免疫新西兰兔,收集纯化血清后得到柞蚕微孢子虫孢壁蛋白抗体。间接ELISA法检测制备的多克隆抗体效价达到1∶2.56×104。采用Western blotting方法在该多克隆抗体与柞蚕微孢子虫孢壁蛋白的免疫反应中检测到分子质量为32 kD的孢壁蛋白。该多克隆抗体对纯化后的柞蚕微孢子虫有较好的检测灵敏度,用于检测感染柞蚕微孢子虫的柞蚕蛹和蛾均呈现阳性结果。

关键词：柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体酶联免疫吸附试验免疫印迹分析

东方蜜蜂微孢子虫一新孢壁蛋白NcER_100148的鉴定与生物学功能研究

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昆虫学报 2023年第6期66卷 747-758页

作者：敖塘堰王静琳马振刚周泽扬重庆师范大学生命科学学院农业农村部长江上游传粉昆虫资源保护与利用重点实验室重庆市媒介昆虫重点实验室重庆市动物学生物学重点实验室重庆401331

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae作为蜜蜂微孢子虫病的主要病原体,对其侵染机制的相关研究鲜有报道。本研究旨在对团队前期通过质谱鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148进行原核表达,明确其亚细胞定位,并初步探... 详细信息

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae作为蜜蜂微孢子虫病的主要病原体,对其侵染机制的相关研究鲜有报道。本研究旨在对团队前期通过质谱鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148进行原核表达,明确其亚细胞定位,并初步探索其生物学功能。【方法】通过在线软件对前期鉴定的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148序列进行生物信息学分析;利用RT-PCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染后西方蜜蜂Apis mellifera成蜂中肠中NcER_100148的表达量;将NcER_100148基因片段克隆至原核表达载体pET30a中,IPTG诱导表达重组蛋白并用于制备多克隆抗体;利用Western blot检测NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的表达量;通过间接免疫荧光和免疫电镜技术分析NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的亚细胞定位;利用Western blot和免疫共沉淀法分别分析重组蛋白NcER_100148与东方蜜蜂微孢子虫几丁质孢子壳(chitin spore coats,CSCs)和极管蛋白NcPTP2和NcPTP3的相互作用关系。【结果】序列分析结果表明,东方蜜蜂微孢子虫NcER_100148预测分子量为12.169 kD,含1个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和1个糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定位点;RT-PCR检测结果表明,NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫感染后4 d时的西方蜜蜂成蜂中肠中开始表达;Western blot结果表明,NcER_100148蛋白能在成熟孢子表面表达,并且能够与东方蜜蜂微孢子虫的CSCs互作;亚细胞定位结果显示NcER_100148定位于东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上;Western blot和免疫共沉淀结果显示重组蛋白NcER_100148能够与极管蛋白NcPTP2和NcPTP3相互作用。【结论】NcER_100148是定位在东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上的一个新型孢壁蛋白,且其可能在孢子内壁的构建、极管的盘绕与固定和参与对宿主的侵染等过程中扮演重要的角色。

关键词：东方蜜蜂微孢子虫孢壁蛋白亚细胞定位几丁质孢子壳极管蛋白互作

家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究 ——家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP9与孢壁几丁质结合的分子基础

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家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究 ...

作者：彭湃西南大学

学位级别：硕士

微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核生物,几乎可以感染所有的脊椎动物和无脊椎动物,甚至包括人类。家蚕微孢子虫（Josema bombycis）是最早发现的微孢子虫,因其寄生感染家蚕而得名。其引起的家蚕微粒子病对世界养蚕各国都曾造成过毁灭... 详细信息

微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核生物,几乎可以感染所有的脊椎动物和无脊椎动物,甚至包括人类。家蚕微孢子虫（Josema bombycis）是最早发现的微孢子虫,因其寄生感染家蚕而得名。其引起的家蚕微粒子病对世界养蚕各国都曾造成过毁灭性的危害,是目前蚕业唯一的法定检疫对象。由于微粒子病对养蚕业每年造成的经济损失巨大,因此对家蚕微孢子虫的研究一直是蚕病研究的重点。微孢子虫表面包裹着一层致密的孢壁结构,在微孢子虫抵御外界不利环境、维持自身形态和渗透压等方面发挥着重要的功能。也正是由于孢壁的特殊结构,使微孢子虫的防治面临着巨大的挑战,因而受到了微孢子虫研究学者的广泛关注。围绕孢壁的研究目前主要停留在对孢壁蛋白的鉴定和功能的初步探索阶段,而对孢壁构成机理的研究则略显不足。本论文以不同方法提取到的家蚕微孢子虫为材料,探究了在微孢子虫生长发育过程中作为孢壁结构的几丁质层和其中一个孢壁蛋白NbSWP9蛋白易位的过程;通过分段表达和定点突变的方法,将已证实与几丁质壳存在结合关系的孢壁蛋白NbSWP9为研究对象,开展了二者结合作用分子基础的研究。主要结果如下：1.家蚕微孢子虫在不同发育阶段中孢壁几丁质形成与孢壁蛋白NbSWP9分布情况分析以家蚕胚胎细胞（Embryonic cell line of Bombyx mori, BmE）体外培养家蚕微孢子虫、Percoll密度梯度分离纯化法以及胰酶消化感染N. bombycis的家蚕中肠组织三种方法得到的不同发育时期的家蚕微孢子虫为研究材料,采用特异荧光标记的方法,初步分析孢壁构成过程中几丁质形成和NbSWP9蛋白表达分布的过程。结果表明：家蚕微孢子虫孢壁几丁质在早期孢子母细胞时期便开始形成。NbSWP9在微孢子虫发育早期（裂殖体时期）可被检测到较强的荧光信号,该时期核物质定位信号清晰,而几丁质壳不能被相应染料着色;几丁质层的形成晚于NbSWP9的分泌,并且其荧光信号能与NbSWP9的荧光进行部分共定位,未共定位的部分显示几丁质层在内,NbSWP9在外;而当几丁质层荧光信号逐渐增强,暗示几丁质层发育完全形成时,NbSWP9的荧光减弱。由以上结果推测,可能随着孢壁结构不断堆叠增厚形成致密层的过程,NbSWP9主要与孢内壁几丁质层通过紧密结合参与孢壁的形成和稳定,导致抗原表位的不充分暴露。2. NbSWP9与孢壁几丁质结合的关键功能基序的鉴定通过对NbSWP9预测分析的功能结构域进行截短,构建了缺失几丁质结合基序的NbSWP9突变体,并以去掉信号肽的NbSWP9作为野生型对照,原核表达获得两个融合表达的蛋白;利用脱蛋白几丁质壳（Deproteinated chitin spore coats, DCSCs）验证经信息分析预测的几丁质结合基序是否在与NbSWP9和几丁质层的结合过程中发挥作用。通过免疫印迹和间接免疫荧光分析结果表明,缺失几丁质结合基序的NbSWP9不能与家蚕微孢子虫脱蛋白几丁质壳结合,进而说明NbSWP9的几丁质结合基序在该蛋白与几丁质结合的过程中发挥作用。3. NbSWP9与孢壁几丁质结合的关键氨基酸位点的鉴定通过对NbSWP9几丁质结合基序中4个保守的氨基酸位点进行定点突变,利用几丁质结合实验验证可能发挥重要功能的氨基酸位点。通过Overlapping PCR的方法成功构建4个NbSWP9的定点突变体：swp9-C206A、swp9-C206A/G229A、 swp9-C206A/N214A/G229A（?）swp9-C206A/N214A/V225A/G229A。通过原核表达载体的构建、重组表达菌的诱导表达,经亲和层析纯化获得SWP9-C206A原核表达蛋白以及SWP9-C206A/G229A原核表达蛋白。对以上蛋白利用几丁质结合实验对其与几丁质壳的结合能力进行分析,结果表明SWP9-C206A/G229A蛋白与几丁质的结合作用减弱,而SWP9-C206A蛋白与几丁质的结合作用相比对照组无差异,说明NbSWP9几丁质结合基序末位甘氨酸可能在该结合过程中发挥作用。综上所述,本研究首次通过体内和体外来源的微孢子虫材料对不同发育时期家蚕微孢子虫的几丁质形成和NbSWP9的分布情况进行了初步探索;通过分段表达的方法对孢壁形成过程中NbSWP9与几丁质层之间相互作用的分子基础进行了探究。

关键词：微孢子虫家蚕微孢子虫孢壁蛋白几丁质结合定点突变