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山东医药 2017年第3期57卷 13-15页

作者：封全灵熊祯祯王智霆张倩雯刘弘扬胡兴韶倪凌佩郑州大学第三附属医院郑州450052

目的观察米非司酮对孕激素受体m(PR-m)阳性子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响。方法收集因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的子宫肌瘤标本,原代培养子宫肌瘤细胞成功后,采用Western blotting法筛选出PR-m阳性细胞(阳性组)和PR-m阴性细胞(阴性组... 详细信息

目的观察米非司酮对孕激素受体m(PR-m)阳性子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响。方法收集因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的子宫肌瘤标本,原代培养子宫肌瘤细胞成功后,采用Western blotting法筛选出PR-m阳性细胞(阳性组)和PR-m阴性细胞(阴性组)。取对数生长期的两组细胞,分别加入0、1×10^(-6)、1×10^(-5)、1×10^(-4)mol/L的米非司酮,培养48 h后采用mTT法观察细胞增殖抑制情况,采用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。结果米非司酮作用24 h后子宫肌瘤细胞生长明显减慢,细胞开始皱缩,48 h后细胞开始碎解。随米非司酮浓度增加,两组细胞增殖抑制率和凋亡率均逐渐增加(P均1×10-6mol/L时,阳性组细胞增殖抑制率和凋亡率低于阴性组(P均m阳性的子宫肌瘤细胞增殖受到抑制、凋亡增多,但与PR-m阴性细胞相比,增殖、凋亡变化程度较小。

关键词：米非司酮孕激素受体m 子宫肌瘤细胞细胞增殖细胞凋亡

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子宫肌瘤细胞中孕激素受体m、A/B及porin蛋白表达观察

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山东医药 2017年第15期57卷 45-47页

作者：封全灵王智霆刘慧云郑州大学第三附属医院郑州450052

目的观察子宫肌瘤细胞中孕激素受体m(PR-m)、孕激素受体A/B(PR-A/B)及porin蛋白的表达变化,并探讨其意义。方法子宫肌瘤切除术中切取子宫肌瘤组织及瘤旁正常子宫平滑肌组织后冰上尽快送实验室,原代培养子宫肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细... 详细信息

目的观察子宫肌瘤细胞中孕激素受体m(PR-m)、孕激素受体A/B(PR-A/B)及porin蛋白的表达变化,并探讨其意义。方法子宫肌瘤切除术中切取子宫肌瘤组织及瘤旁正常子宫平滑肌组织后冰上尽快送实验室,原代培养子宫肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞并鉴定。取第3代子宫肌瘤细胞(实验组)和正常平滑肌细胞(对照组),采用Western blotting法检测细胞中的PR-m、PR-A、PR-B、porin蛋白,分析PR-m、PR-A、PR-B蛋白与porin蛋白表达的相关性。结果实验组细胞中PR-m、PR-A、PR-B、porin蛋白相对表达量分别为0.130±0.012、0.432±0.052、0.456±0.045、0.525±0.082,对照组分别为0.086±0.015、0.223±0.036、0.269±0.026、0.202±0.034,实验组细胞中PR-m、PR-A、PR-B蛋白和porin蛋白相对表达量均高于对照组(P均m蛋白与porin蛋白相对表达量呈正相关关系(r=0.464,Pm、PR-A、PR-B、porin蛋白表达升高,PR-m、PR-A、PR-B、porin蛋白表达异常可能与子宫肌瘤的发病有关,且PR-m蛋白与porin蛋白可能在子宫肌瘤发病中起协同作用。

关键词：子宫肌瘤子宫肌瘤细胞孕激素受体m 孕激素受体A 孕激素受体B porin蛋白

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孕激素受体抑制剂RU-486对PR-m阳性原代子宫平滑肌瘤细胞增殖和凋亡的影响

孕激素受体抑制剂RU-486对PR-M阳性原代子宫平滑肌瘤细胞增殖和凋...

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作者：熊祯祯郑州大学

学位级别：硕士

孕激素受体m(mitochondrial progesterone receptor,PR-m)是一种新型的孕激素受体,在2002年由Saner,KJ等发现,其定位于核外线粒体,与传统孕激素受体PR-A、PR-B相比结构上缺乏N端的A/B结构区和DNA结合区,仅有铰链区和配体结合区,是截短... 详细信息

孕激素受体m(mitochondrial progesterone receptor,PR-m)是一种新型的孕激素受体,在2002年由Saner,KJ等发现,其定位于核外线粒体,与传统孕激素受体PR-A、PR-B相比结构上缺乏N端的A/B结构区和DNA结合区,仅有铰链区和配体结合区,是截短的新型孕激素受体。PR-m独特的线粒体定位功能可能是由于其氨基末端的16个氨基酸所组成序列中包含的线粒体定位序列(mitochondrial localization signal,mLS)的存在。目前认为,PR-m可能通过调节线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,mmP)发挥其独特的作用。研究发现孕激素可以通过剂量依赖性增加原代培养的子宫平滑肌细胞和永生化子宫平滑肌细胞的线粒体膜电位的形式发挥作用,并且这种反应的发生可以被孕激素受体拮抗剂抑制。从而说明孕激素可能通过PR-m的非基因组作用增加细胞的能量代谢,而细胞内能量的增加使得细胞发生异常增殖。孕激素可以促使PR-m使线粒体膜电位增加,抑制乳腺癌细胞、原代和永生化子宫平滑肌细胞的凋亡。子宫肌瘤(leiomyoma)是最常见的女性盆腔良性肿瘤,影响30%-50%的育龄期女性,且发病率呈逐年上升趋势,是临床子宫切除术的主要原因,临床表现有月经异常,不孕,和疼痛等,严重影响女性患者的生存质量。然而至今其病因病机仍未明确,探讨其发病机制及有效的治疗方案一直是国内外妇科方面专家研究的热点。文献报道基础和临床研究均已表明孕激素在子宫平滑肌瘤的发生中发挥着重要的作用。我们先前的研究发现肌瘤组织中孕激素受体PR-B、PR-A和PR-m的表达均明显高于它们在子宫肌瘤旁正常子宫平滑肌组织中的表达水平,提示PR-m在肌瘤生长过程中可能发挥促进作用,孕激素在肌瘤组织中可能通过基因组和非基因组途径发挥双重效应。米非司酮(mifepristone,RU 486)是一种结构类似类固醇激素的复合物。这种复合物对于孕激素受体和糖皮质激素受体具有极强的亲和力,并在较小程度上与雄激素受体结合。它通过不同的信号转导通路,发挥基因组和非基因组作用。米非司酮最初作为妊娠早期的流产药物应用,近年来也应用于治疗子宫肌瘤等疾病,米非司酮用于治疗子宫肌瘤具有效果好,副作用少,复发率低等优势,但作用机制目前尚不明确。目的在课题组之前的研究基础上收集肌瘤标本提取原代子宫肌瘤细胞作为研究材料,Western blot检测孕激素受体的表达并筛选出PR-m阳性细胞株,应用不同浓度梯度的孕激素受体抑制剂RU486干预后,分别应用CCK-8法和流式细胞仪检测PR-m阳性组和PR-m阴性组子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的变化情况,进一步研究PR-m在子宫肌瘤发生发展中的作用,探讨其可能的作用机制,从而深化对PR-m功能作用的理解,给妇产科孕激素相关疾病的诊断治疗提供新的思路和研究方向。材料和方法1研究对象随机选取2015年9月到2016年6月期间在我院(即郑州大学第三附属医院)因单纯子宫肌瘤行腹腔镜下全子宫切除术或腹式肌瘤挖除术的患者11例,年龄248岁,平均(42±4.49)岁。所有患者均不伴随其他性激素相关合并症,且手术治疗前至少半年内无类固醇激素应用史。收集的标本均同时经过腹腔镜或开腹手术诊断、术后常规病理检查证实。所有标本的收集均经过患者的知情同意并签署知情同意书,并经本院伦理委员会审核通过。术中在无菌操作下取大小1-3cm3的肌瘤组织块数块,置于冰盒内保存且含双抗(青链霉素混合液)的DmEm-F12(FD)培养液中,尽快运回实验室进行下一步处理。2试验方法(1)分离子宫肌瘤组织,提取、培养原代子宫平滑肌瘤细胞,并经倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学法(α-SmA单克隆抗体)鉴定确认为子宫平滑肌瘤细胞;(2)应用免疫印迹法(Western Blotting)检测孕激素受体PR-m、PR-A和PR-B的表达并筛选出PR-m阳性细胞株(即仅表达PR-m,不表达PR-A/B的细胞株)作为研究组,PR-m阴性细胞株(即不表达PR-m,仅表达PR-A/B的细胞株)作为对照组,T-47D乳腺癌细胞株(购自American Type Culture Collection)作为筛选细胞的阳性对照(T47D是经文献证实的同时表达PR-A/B和PR-m的细胞株,因现阶段缺乏针对PR-m的特异性抗体,故选择阳性细胞株用以确认筛选结果)(3)不同浓度RU-486(空白对照,1×10umol/ml,1×10umol/ml,1×10umol/ml)干预两组细胞后,利用CCK-8法检测细胞增殖情况并计算细胞增殖抑制率(加入CCK-8试剂后对各组细胞在波长450nm处的吸光度(A)值进行检测,每组重复三次,设置四个复孔。增殖抑制率的计算公式

关键词：孕激素受体m 原代培养子宫肌瘤细胞增殖细胞凋亡

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孕激素受体拮抗剂对原代子宫肌瘤PR-m阳性细胞中增殖与凋亡的影响

孕激素受体拮抗剂对原代子宫肌瘤PR-M阳性细胞中增殖与凋亡的影响

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作者：王智霆郑州大学

学位级别：硕士

孕激素m受体(progesterone receptor mitochondrial,PR-m)是近些年发现的存在于线粒体外膜的一种新型孕激素受体,其独特线粒体定位特征决定其功能,研究发现孕激素可以通过孕激素m受体上调线粒体膜电位促进子宫平滑肌细胞的异常增殖。我... 详细信息

孕激素m受体(progesterone receptor mitochondrial,PR-m)是近些年发现的存在于线粒体外膜的一种新型孕激素受体,其独特线粒体定位特征决定其功能,研究发现孕激素可以通过孕激素m受体上调线粒体膜电位促进子宫平滑肌细胞的异常增殖。我们前期研究发现孕激素m受体在子宫平滑肌瘤与正常瘤旁组织相比,肌瘤组织中孕激素m受体明显高表达。通过剂量依赖的形式诱导原代培养和永生化子宫平滑肌细胞线粒体膜电位的增加,证明PR-m受体使细胞能量代谢增加、增值的非基因组作用。但具体作用机制尚未完全明确。本研究提出的假说是:孕激素通过PR-m上调促凋亡蛋白Caspase3及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2,促进肌瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡,从而参与子宫平滑肌瘤的发生发展,这种作用可以被孕激素受体拮抗剂所抑制。子宫肌瘤是女性生殖道肿瘤中发生的最常见的类型,并从单一的肌层平滑肌细胞克隆性增殖的发展,最初由细胞的遗传变化引起的。在复杂的信号转导通路,如激素、生长因子等因素的改变,转化生长因子(TGF-β),(WNT)/β-连环蛋白,视黄酸(RA)为子宫肌瘤的发展的重要作用。此外,这些信号因子可能通过共同的因素调节,如丝裂原活化蛋白激酶(mAPK)和蛋白kinase B(也称为Akt)的多个途径。增进肿瘤成长的首要原因包含遗传、激素、免疫和环境等原因。目前,除了外科手术如子宫切除术、子宫肌瘤剔除术、子宫动脉栓塞(UAE)和磁共振成像引导聚焦超声手术(mRgFUS),子宫肌瘤聚焦在缓解症状,减慢或阻止肿瘤发展的药物的策略。治疗三类主要用于减轻症状,抑制肌瘤细胞增殖,即非甾体类抗炎药(NSAIDs)、促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)和拮抗孕激素活性合成类固醇,包括米非司酮和所有。作为一种治疗策略,外科手术与手术死亡率和发病率有关,药物治疗也因其副作用而受到限制。促性腺激素释放激素激动剂可以减轻出血和大量相关的症状,但也可能造成重大的更年期的副作用。米非司酮(mifepristone,mIF)被称为妇科药物的中流砥柱。作为孕激素拮抗剂和其他激素治疗改变雌激素和孕激素的生产或功能可能会影响生育能力。mIF可缩小肌瘤体积,安全、有效、经济的子宫肌瘤的术前辅助药物。通过手术中收集患者子宫平滑肌瘤手术标本提炼原代培养的细胞作为基础,使用免疫组织化学法进行平滑肌细胞鉴定,使用免疫蛋白印迹法作用于原代培养细胞株筛选表达孕激素m受体阳性并孕激素A/B阴性的细胞株,使用mIF干预在不同时间、不同浓度梯度的浓度后,通过使用mTT比色法与流式细胞法检测阳性实验组和阴性对照组组原代培养肌瘤增殖与凋亡的相关研究。使用Western blot检测Caspase3和Bcl-2的表达水平。探讨与对于指导临床孕激素的合理应用有重要意义,同时为肌瘤的预防和治疗提供理论依据,甚至开辟新的治疗思路,具有广阔的社会和经济应用前景。材料与方法1研究对象于郑州大学第三附属医院妇科住院病人中随机选择2016年8月至2017年1月中因单纯子宫肌瘤行开腹子宫肌瘤挖除术的患者10例,年龄327岁,平均(41±3.36)岁。术前至少6个月内未使用类固醇激素,同时没有合并性激素相关疾病。标本均经病理证实,手术中肌瘤细胞的采集均经患者知情同意,并通过郑州大学第三附属医院伦理委员会审核。术中无菌条件下切除2-3块1立方厘米的平滑肌瘤组织,放入4℃含双抗的DmEm试管内,置入冷藏箱到细胞间处理,用无菌培养皿浸泡于PBS液3-5min,使用高压灭菌眼科剪将肌瘤组织剪碎。2试验方法(1)培养皿中细胞培养24h贴壁后进行第一次换液,以后2-3天左右进行一次换液,当培养皿中细胞融合后用配好的试剂胰蛋白酶进行消化传代。利用显微镜高倍镜下观察培养瓶中细胞形态。并经免疫组化确定子宫平滑肌瘤细胞。(2)首先使用蛋白免疫印迹法分别测出高表达孕激素受体m、孕激素受体A和孕激素受体B的的细胞株,从中筛选出PR-m阳性细胞株作为实验组,PR-m(-)阴性细胞株作为对照组,阳性对照T47D乳腺癌细胞株是同时表达孕激素受体m、A、B细胞特异性抗体。(3)实验分为高浓度组、中浓度组、低浓度组、对照组,其中孕激素受体拮抗剂(mIF)浓度分别为10,10,10mol/L,空白对照。处理时,对照组加入相同剂量的培养基。(4)通过mTT法分别检测孕激素受体m阳性组与阴性组高浓度组、中浓度组、低浓度组和空白组细胞增殖抑制率,每孔90μl,每组6个复孔。待细胞贴壁后,按上述分组加药处理,培养48小时后在96孔板内加入20μl混合液,在450nm酶标仪下测吸光度,重复三次。增殖抑制率=(对照组OD450nm-实验组OD450nm)/(对照组OD450nm-空白组OD450nm)×100%。(5)通过取对数生长期的子宫肌瘤细胞,在6孔板内以1.0×

关键词：孕激素受体m 原代培养子宫肌瘤细胞增殖细胞凋亡

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孕激素受体和线粒体porin蛋白在子宫肌瘤组织中的表达

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现代妇产科进展 2013年第11期22卷 897-899页

作者：封全灵刘弘扬郑州大学第三附属医院妇产科郑州450052

目的:检测新型孕激素受体m(PR-m)、PR-A、PR-B和线粒体porin蛋白在子宫肌瘤组织及肌瘤旁正常子宫平滑肌组织中的表达,并探讨3种孕激素受体与porin表达的相关性。方法:采用RT-PCR、Western blot法检测PR-m、PR-A、PR-B和porin在20例子宫... 详细信息

目的:检测新型孕激素受体m(PR-m)、PR-A、PR-B和线粒体porin蛋白在子宫肌瘤组织及肌瘤旁正常子宫平滑肌组织中的表达,并探讨3种孕激素受体与porin表达的相关性。方法:采用RT-PCR、Western blot法检测PR-m、PR-A、PR-B和porin在20例子宫肌瘤组织和肌瘤旁正常子宫平滑肌组织中的表达。结果:子宫肌瘤组织中PR-m、PR-A、PR-B和porin的表达水平均显著高于正常子宫平滑肌组织(Pm与porin表达呈正相关(mRNA:r=0.562,P=0.010;蛋白:r=0.467,P=0.038),PR-A、PR-B与porin表达无关(P>0.05)。正常子宫平滑肌组织中PR-m、PRA、PR-B与porin均无相关性(P>0.05)。结论:子宫肌瘤的发生和发展可能与核外PR-m的作用有关,孕激素可能通过基因组和非基因组两种途径参与子宫肌瘤的形成和生长。

关键词：孕激素受体m 孕激素受体子宫肌瘤非基因组作用

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