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蛹虫草子实体多糖提取工艺优化与组分分离鉴定

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蛹虫草子实体多糖提取工艺优化与组分分离鉴定

作者：林凡山西农业大学

学位级别：硕士

蛹虫草,一种用于食物和医药的珍贵真菌。由于它与冬虫夏草的代表性药理成分相似,因此已成为了冬虫夏草的良好替代品。蛹虫草多糖是蛹虫草中的主要活性物质,具有广泛的生理活性和药用价值,近年来,关于多糖构效与生物活性关系的研究已成... 详细信息

蛹虫草,一种用于食物和医药的珍贵真菌。由于它与冬虫夏草的代表性药理成分相似,因此已成为了冬虫夏草的良好替代品。蛹虫草多糖是蛹虫草中的主要活性物质,具有广泛的生理活性和药用价值,近年来,关于多糖构效与生物活性关系的研究已成为了学者们研究的重点之一。然而目前对蛹虫草子实体多糖整个体系的研究还不成熟,高效提取工艺及其组分尚不明确。为此,本研究采用响应面的方法来优化蛹虫草子实体多糖的热水浸提工艺参数,并对最优工艺提取的多糖进行体外抗氧化研究。同时,将获得的蛹虫草多糖进行进一步的分离纯化,并对其主要组分CP0-A与CP1-A进行了相应的结构鉴定研究。主要结论如下:(1)以蛹虫草子实体为研究对象,在单因素的基础上,通过响应面分析研究热水浸提蛹虫草子实体多糖工艺优化条件,得出最佳工艺条件为:浸提温度80°C,浸提取时间3.1 h,料液比41:1 mL/g,浸提次数2次,此条件下多糖实际得率为6.3328%。关于抗氧化性,来自蛹虫草子实体的多糖具有很强的DPPH自由基清除力(88.9%),与阳性对照的清除率相近,其还原力(1.133)也较强,而羟自由基清除率(53.8%)和总抗氧化性(0.807)相对较低。(2)通过热水浸提得到的粗多糖需进行进一步的纯化和组分分离得到较纯的多糖组分,使用DEAE-cellulose-52阴离子交换柱和Sephacryl S-400丙烯葡聚糖凝胶柱对热水浸提的蛹虫草子实体粗多糖进行组分分离,最终得到CP0-A、CP0-B、CP1-A和CP1-B四个多糖组分。(3)结构鉴定结果:CP0-A与CP1-A两个蛹虫草多糖的主要组分的单糖组成相似度较高,都是α-L-鼠李糖,β-1,3-D葡萄糖,α-半乳糖,及少量甘露糖组成,其摩尔比分别为15.95∶4.26∶9.60∶1.22和19.44∶4.82∶8.73∶0.30;CP0-A的Mn为3.057×10 Da,Mw为4.923×10 Da,样品构象为柔性无规线团结构,支化程度不高;CP1-A Mn和Mw分别为1.341×10 Da和2.234×10 Da,构象结果与CP0-A相同(数据不同);CP0-A和CP1-A两个多糖的的形貌存在一定的差异,CP0-A表面较为紧密、粗糙,结构规则不强,CP1-A表面较为光滑,有一定的柔顺性。这一研究结果将会为后续继续开展蛹虫草子实体多糖的生物活性与结构效应的关系、免疫作用机制及药物开发等研究提供参考依据。

关键词：蛹虫草子实体多糖分离纯化结构鉴定

淡红侧耳子实体多糖的提取、分离纯化及结构解析

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淡红侧耳子实体多糖的提取、分离纯化及结构解析

作者：田有秋南京农业大学

学位级别：硕士

淡红侧耳（Pleurotus djamor）,又名桃红侧耳、红平菇,其色鲜味美,蛋白质、粗纤维、维生素和氨基酸等营养物质含量丰富。淡红侧耳多糖（PDP）是其一种重要的活性成分,具有抗氧化、降血糖等活性。国内外对淡红侧耳研究较多的是驯化栽培... 详细信息

淡红侧耳（Pleurotus djamor）,又名桃红侧耳、红平菇,其色鲜味美,蛋白质、粗纤维、维生素和氨基酸等营养物质含量丰富。淡红侧耳多糖（PDP）是其一种重要的活性成分,具有抗氧化、降血糖等活性。国内外对淡红侧耳研究较多的是驯化栽培、营养成分分析、深层发酵、菌丝体多糖、产漆酶活性及采用原生质体技术选育优良菌株等方面,而对淡红侧耳子实体多糖的分离纯化、结构解析及生物活性研究等较少。本文优化了淡红侧耳子实体多糖的提取条件,对粗多糖进行分离纯化,并对纯化多糖的结构及抗氧化活性进行研究。首先对淡红侧耳子实体多糖的提取条件进行优化。在单因素实验中,选取液料比、提取温度、提取时间和提取次数4个因素,测定各因素水平下多糖的提取率,在此结果的基础上,设计响应曲面法优化方案,确定淡红侧耳子实体多糖的最佳提取工艺为:液料比30.6:1 mL/g,提取温度95℃,提取时间3.9 h,提取次数3次,在此条件下多糖的实际提取率为13.44%,与模型预测值13.28%仅相差1.19%,表明实验值与模型方程的预测值间存在较高的一致性,说明优化得到的提取条件是切实可行的。然后对提取的粗多糖进行分离纯化。多糖的脱色采用的是大孔树脂法,在静态脱色实验中,经正交实验优化可得最佳脱色条件为:树脂用量1.5 g,脱色温度45℃,脱色时间120min,pH 6,在此条件下,多糖脱色率和多糖保留率分别为74.15%和80.37%;动态脱色实验中,在上样流速1.5 BV/h、上样体积4 BV的条件下,脱色率和多糖保留率分别为81.37%和82.21%。采用Sevage法脱蛋白,蛋白脱除率为61.39%,多糖保留率为93.29%,此时多糖中的蛋白含量仅为2.17%。运用DEAE-纤维素-52和Sephadex G-150对脱色脱蛋白后的粗多糖进行纯化,得到三个组分:PDP-1-1,PDP-2-1 和 PDP-3-1。对淡红侧耳粗多糖及纯化多糖（PDP-1-1、PDP-2-1、PDP-3-1）的理化性质进行测定,四者的总糖含量分别为:69.65%、1.56%、11.25%、3.95%;蛋白质含量分别为:83.16%、0.48%、9.82%、1.63%;糖醛酸含量分别为:89.11%、0.79%、11.94%、1.60%;硫酸基含量分别为:84.78%、0.64%、21.08%、1.69%。与淡红侧耳粗多糖相比,纯化组分PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1的总糖含量明显增加,蛋白质含量减少;PDP-3-1的糖醛酸及硫酸基含量均高于粗多糖、PDP-1-1和PDP-2-1。结合化学法和波谱法对淡红侧耳子实体多糖的结构进行鉴定。纯化组分PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1均为单一组分,相对分子质量分别为:12.9KD、10.6 KD、2753.7 KD;PDP-1-1由5种单糖组成,甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖的摩尔百分含量分别是4.79%、28.68%、47.59%、13.37%和5.57%;PDP-2-1由6种单糖组成,甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖的摩尔百分含量分别是 6.43%、33.65%、36.17%、7.20%、9.88%和6.68%;PDP-3-1 由 4种单糖组成,甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖的摩尔百分含量分别是4.12%、87.24%、3.90%和4.74%。紫外光谱扫描结果显示,粗多糖含有少量蛋白质和核酸,而三种纯化组分的蛋白质和核酸均未被检测到。红外光谱扫描结果显示,纯化组分PDP-1-1、PDP-2-1、PDP-3-1均含有多糖类物质的特征吸收峰。刚果红实验结果表明纯化组分PDP-1-1和PDP-3-1具有三股螺旋结构,而PDP-2-1不含三股螺旋结构。经核磁共振分析可知,PDP-1-1由5种α-吡喃糖和β-吡喃糖组成,分别为-β-D-Galp-、-α-D-Glcp-、-α-L-Arap-、-α-L-Fucp-、-α-D-Manp-;PDP-2-1 主要是由-β-D-Galp-、-α-D-Glcp-、-α-L-Arap-、-α-L-Fucp-、-α-D-Manp-、-α-Xylp-组成。运用化学法分别测定了粗多糖、PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1的抗氧化活性。结果表明:粗多糖及纯化组分PDP-1-1、PDP-2-1、PDP-3-1在体外能够清除羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（.02-）及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）,且具有一定的还原力和Fe2+鳌合能力。在实验浓度范围0.2～4.0 mg/mL内,各组分的抗氧化活性随浓度增加而提高,且纯化组分PDP-2-1的抗氧化能力优于粗多糖及其他两种纯化组分。

关键词：淡红侧耳子实体多糖分离纯化结构抗氧化活性

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红菇子实体多糖体外抗氧化活性评价

食品工业 2014年第12期35卷 181-185页

作者：李云黄荣城周银锐张津东韩山师范学院生物系潮州521041

以野生红菇子实体为材料,提取水溶性多糖,经初步纯化后,分别从自由基清除能力、还原能力、金属离子螯合能力和抑制脂质过氧化能力方面,对粗多糖和3种多糖分离组分的体外抗氧化作用进行了综合性评价。试验结果表明,红菇粗多糖表现出良好... 详细信息

以野生红菇子实体为材料,提取水溶性多糖,经初步纯化后,分别从自由基清除能力、还原能力、金属离子螯合能力和抑制脂质过氧化能力方面,对粗多糖和3种多糖分离组分的体外抗氧化作用进行了综合性评价。试验结果表明,红菇粗多糖表现出良好的自由基清除能力,对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除率分别达60.23%,86.47%和69.21%。当质量浓度为5 mg/mL时,对超氧阴离子的清除作用与1-2 mg/mL VC的清除率相当。3种多糖分离组分中R1和R3组分对自由基的清除作用较好,而R2的作用较差。多糖的还原能力测试表明,在1-5 mg/mL质量浓度范围内,粗多糖还原能力最好,组分R1次之,组分R2和R3还原力较弱。红菇粗多糖和3种分离组分表现出较好的鳌合Fe2＋的能力,对脂质过氧化也表现出一定的抑制能力。

关键词：红菇子实体多糖抗氧化

不同品种猴头菌子实体粗多糖含量及体外免疫活性比较

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食用菌学报 2014年第2期21卷 54-56,F0003页

作者：李玉李巧珍吴迪于海龙唐传红周峰李正鹏杨焱上海市农业科学院食用菌研究所农业部南方食用菌资源利用重点实验室国家食用菌工程技术研究中心国家食用菌加工技术研发分中心上海市农业遗传育种重点开放实验室上海201403

对10株猴头菌(Hericium erinaceus)菌株栽培获得的子实体多糖含量和体外免疫活性进行比较。结果表明:不同的猴头菌菌株在同样条件下栽培所获子实体在粗多糖含量和体外刺激RAW264.7产生NO的能力上有明显差异,其中H5粗多糖含量最高且体外... 详细信息

对10株猴头菌(Hericium erinaceus)菌株栽培获得的子实体多糖含量和体外免疫活性进行比较。结果表明:不同的猴头菌菌株在同样条件下栽培所获子实体在粗多糖含量和体外刺激RAW264.7产生NO的能力上有明显差异,其中H5粗多糖含量最高且体外刺激RAW264.7的活性也最强。

关键词：猴头菌菌株子实体多糖巨噬细胞

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黄伞子实体多糖的结构初探及抗肿瘤活性研究

时珍国医国药 2012年第1期23卷 139-141页

作者：姜红霞聂永心苏延友泰山医学院山东泰安271016 山东农业大学作物生物学国家重点实验室山东泰安271018

目的研究黄伞子实体多糖的抗肿瘤活性及其糖醛酸含量、单糖组成和糖苷键的类型。方法以S180为模型,检测体内抗肿瘤活性;间羟联苯法检测糖醛酸含量;HPLC-ELSD法检测单糖组成;红外光谱法分析糖苷键类型、吡喃环或呋喃环形式等结构信息。... 详细信息

目的研究黄伞子实体多糖的抗肿瘤活性及其糖醛酸含量、单糖组成和糖苷键的类型。方法以S180为模型,检测体内抗肿瘤活性;间羟联苯法检测糖醛酸含量;HPLC-ELSD法检测单糖组成;红外光谱法分析糖苷键类型、吡喃环或呋喃环形式等结构信息。结果黄伞子实体多糖在50,100,150 mg.kg-1时,对S180的抑瘤率分别为27.97%,30.36%,38.46%;糖醛酸含量为1.26%;单糖组成主要由葡萄糖组成;同时含有α和β构型糖苷键的葡萄吡喃糖。结论黄伞子实体多糖是含有α和β构型糖苷键,由葡萄吡喃糖组成的均一中性多糖,具有一定的体内抗肿瘤活性。

关键词：黄伞子实体多糖单糖组成红外光谱抗肿瘤

桦褐孔菌子实体和发酵多糖的促生细胞因子作用及化学结构研究

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桦褐孔菌子实体和发酵多糖的促生细胞因子作用及化学结构研究

作者：李娟浙江理工大学

学位级别：硕士

桦褐孔菌(Inonotusobliquus)，又名“白桦茸”，欧洲人喜欢叫它“Chaga”。它属于担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、刺革菌科，是来自西伯利亚原始森林中的一种神秘药用真菌。桦褐孔菌寄生于桦树上，是极其耐寒的菌种，能在零下69℃的环... 详细信息

桦褐孔菌(Inonotusobliquus)，又名“白桦茸”，欧洲人喜欢叫它“Chaga”。它属于担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、刺革菌科，是来自西伯利亚原始森林中的一种神秘药用真菌。桦褐孔菌寄生于桦树上，是极其耐寒的菌种，能在零下69℃的环境下生长，生长期达15年。野生的桦褐孔菌成年菌会吸干桦树的精华，导致树木干枯，故而其自然资源十分稀缺，其价格在国际市场上远胜于珍贵药用真菌桑黄。因此，人工培养桦褐孔菌子实体或菌丝体非常必要，运用液体深层发酵生产桦褐孔菌菌丝体是一条有效的途径，这为研究和开发桦褐孔菌提供了充足的原材料。近年来，人们不断加大对桦褐孔菌液体培养和菌丝体基础培养方面的研究广度和深度，以求能缩短生长周期和增进其产量。同时，随着对药用真菌多糖等活性物质的深入研究，多糖作为桦褐孔菌主要成分，其营养价值和药用价值逐渐引起人们的关注，成为医药工业和保健品工业的热门开发领域。本论文主要对从野生桦褐孔菌子实体和优化后的液体深层发酵培养基的发酵液和菌丝体中分别提取分离获得的胞外、胞内多糖进行化学结构和生物学免疫活性的研究。测定和比较各不同来源的粗多糖、除蛋白多糖以及经过DEAE-52阴离子交换色谱和SephadexG-200凝胶渗透色谱柱层析分离纯化的多糖组分的总含糖量和蛋白含量。通过测试其对人外周血单个核细胞分泌细胞因子TNF-α、IFN-γ、1L-1β和1L-2的调节作用，分析各多糖提取物及组分的免疫活性。利用气相色谱法(GC)分析单糖(结构单元)组成，红外光谱(IR)和核磁共振(NMR)法分析各多糖糖苷键和异头碳的构型。实验结果表明： 1)从响应面优化培养基液体深层发酵的发酵液中获得的胞外粗多糖(EPS)、菌丝体热水浸提获得的胞内粗多糖(IPS)的总含糖量均比桦褐孔菌子实体粗多糖(FSPS)的高，EPS和IPS蛋白含量远远低于FSPS。上述三种多糖除蛋白后多糖提取物各记为DEPS、DIPS、DFSPS，糖含量以DIPS的最高，达到了80.9%。脱蛋白多糖经DEAE-52柱层析分离后的组分分别为DEPS1、DEPS2、DEPS3、DEPS4，DIPS1、DIPS2、DIPS3和DFSPS1，其中组分DIPS1组分的糖含量是所有组分中最高的，为86.1%。子实体提取处理得到的各多糖样品蛋白含量都在20%以上;2)经DEAE-52分离的各组分分别过SephadexG-200柱，进一步分离纯化得到各自单一洗脱峰，峰型对称性好，可以认为得到的是纯组分，对应记作PDEPS1、PDEPS2、PDEPS3、PDEPS4，PDIPS1、PDIPS2、PDIPS3和PDFSPS1;3)所有的多糖样品均表现出增进细胞分泌细胞因子的作用，并且随着浓度的增大，这种促生作用加强。对于粗糖提取物，发酵胞外多糖、胞内多糖、子实体多糖及各除蛋白多糖在各浓度下对TNF-α、IFN-γ、1L-1β和1L-2四种细胞因子的促生效果不是完全一致，但是各种多糖的促生活性几乎无差异;4)柱层析分离纯化后的多糖组分的细胞因子实验表明，在较低浓度下PDEPS、PDIPS和PDFSPS的组分对细胞因子调节作用几乎无差异，但是在浓度为150μg/mL时，纯化组分之间的活性差异性变大，而且此高浓度下活性最低的大多是来自子实体多糖的PDFSPS1;5)单糖组分的分析结果表明，子实体多糖单糖组成以葡萄糖占比例最高，其次是甘露糖、半乳糖和木糖。发酵产胞外多糖组成是半乳糖含量最高，而胞内多糖的各单糖所占比例相对均匀;6)IR和NMR法对纯化多糖进行结构表征，由IR图谱可知多糖结构很相似，都在3400cm-1处有强的宽峰，为O-H伸缩振动吸收峰，在3000-2800cm-1处均有尖峰，为C-H的伸缩振动吸收峰，在1200-1000cm-1处均有C-O(包括C-O-H和糖环的C-O-C)的伸缩振动吸收峰，这些是多糖经典吸收峰，是判断物质是否为糖类的根本。所有多糖在1650-1550cm-1处均有N-H变角振动所形成的吸收峰，说明多糖样品中含有蛋白成分，即所有纯化样品是糖与蛋白的复合物。所有组分在93060cm-1区域都有吸收峰，说明桦褐孔菌多糖以吡喃糖为主。870cm-1或810cm-1附近都有吸收峰，说明其都含有甘露糖组分，这与气相测得的数据一致;7)体积排阻与激光光散色法联用(sizeexclusionchromatographywithlaserlightscattering，SEC-LLS)测多糖的分子量，EPS组分分子量在288kDa，IPS的分子量在8920kDa，FSPS组分1重均分子量为32kDa，可见，发酵多糖的分子量是比较大的，尤其是菌丝体多糖，其组分分子量都很高;从以上结果我们得出，桦褐孔菌发酵产物多糖和桦褐孔菌子实体多糖在促进细胞因子分泌上的效果是差不多的，且在同浓度下，发酵多糖的活性稍微更强，由此说明液体深层发酵桦褐孔菌多糖有很好的免疫调节作用，这为桦褐孔菌

关键词：桦褐孔菌子实体多糖胞外多糖胞内多糖细胞因子

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桑黄子实体多糖提取工艺及单糖组成研究

食品工业科技 2009年第4期30卷 264-266页

作者：张艳洁秦俊哲刘华首都师范大学生命科学学院北京100048 陕西科技大学生命科学与工程学院陕西西安710021

通过单因素实验和正交实验,从提取温度、料液比、提取次数、提取时间四个方面研究多糖提取条件,得出最佳条件为:提取温度95℃,料液比1:50,提取次数2次,提取时间2h。运用薄层色谱和气相色谱分析单糖组成,日本桑黄(R)子实体多糖单糖组成... 详细信息

通过单因素实验和正交实验,从提取温度、料液比、提取次数、提取时间四个方面研究多糖提取条件,得出最佳条件为:提取温度95℃,料液比1:50,提取次数2次,提取时间2h。运用薄层色谱和气相色谱分析单糖组成,日本桑黄(R)子实体多糖单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖;韩国桑黄(H)子实体多糖单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。

关键词：桑黄子实体多糖提取条件

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香菇子实体多糖分步酶解法提取研究

食用菌学报 2009年第2期16卷 67-71页

作者：程俊文吴学谦贺亮吴庆其付立忠魏海龙李海波浙江省林业科学研究院浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室浙江杭州310023 丽水市食用菌研究开发中心浙江益圣菌物发展有限公司浙江丽水323000

首先采用正交试验优化纤维素酶?果胶酶和木瓜蛋白酶对香菇(Lentinula edodes)子实体多糖酶解提取的工艺参数,然后在优化酶解条件下,依次采用纤维素酶?果胶酶和木瓜蛋白酶分步处理香菇子实体以提取香菇多糖,并与单一酶解提取法和传统热... 详细信息

首先采用正交试验优化纤维素酶?果胶酶和木瓜蛋白酶对香菇(Lentinula edodes)子实体多糖酶解提取的工艺参数,然后在优化酶解条件下,依次采用纤维素酶?果胶酶和木瓜蛋白酶分步处理香菇子实体以提取香菇多糖,并与单一酶解提取法和传统热水浸提法进行对比。结果表明,纤维素酶?果胶酶?木瓜蛋白酶的最佳提取工艺参数依次为加酶量0.8%、温度45℃、pH4.5、提取时间1h,加酶量1.0%、温度45℃、pH3.5、提取时间2.0h和加酶量1.0%、温度45℃、pH4.0、提取时间1.5h;在优化提取条件下,分步酶解法提取香菇粗多糖的提取率可达14.17%,比传统热水浸提法提高128.2%,比单独采用纤维素酶?果胶酶?木瓜蛋白酶酶解提取分别提高了43.71%、46.99%和23.11%。紫外光谱分析表明,分步酶解法提取的香菇多糖纯度明显高于热水浸提法提取的香菇多糖。

关键词：香菇子实体多糖分步酶解纤维素酶果胶酶木瓜蛋白酶

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大杯蕈子实体多糖提取优化及抗氧化活性分析

泰山学院学报 2014年第3期36卷 37-46页

作者：张晨赵法茂胡春龙刘正帅刘贵芬贾晓山东农业大学作物生物学国家重点实验室山东泰安271000 泰山学院生物与酿酒工程学院山东泰安271021

探析大杯蕈子实体多糖的适宜提取条件,明确其抗氧化活性.以大杯蕈子实体为材料,利用Plackett-Burman(PB)实验和响应面分析法(RSM)优化子实体多糖(FPS)的分离提取条件;以总还原力、羟基自由基、超氧阴离子自由基和二苯代苦味肼(DPPH)自... 详细信息

探析大杯蕈子实体多糖的适宜提取条件,明确其抗氧化活性.以大杯蕈子实体为材料,利用Plackett-Burman(PB)实验和响应面分析法(RSM)优化子实体多糖(FPS)的分离提取条件;以总还原力、羟基自由基、超氧阴离子自由基和二苯代苦味肼(DPPH)自由基为指标,测定FPS抗氧化活性.结果表明,FPS最佳提取条件是乙醇倍数3.55,醇沉时间28.77 h,提取次数2.57次,FPS理论得率是2.549%.为操作方便,调整为乙醇倍数3.6,醇沉时间29h,提取次数3.00,在此条件下,多糖的理论得率是2.329%,实际得率为2.015%.当FPS浓度为5000μg/mL时,大杯蕈子实体多糖的总还原力为0.629,对于羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH的清除率分别为27.19%、60.101%和69.7%.随着FPS浓度的增加,其还原力逐渐增强,对羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH的清除率也逐渐增大,证明大杯蕈子实体多糖具有潜在的抗氧化活性.

关键词：大杯蕈子实体多糖提取优化体外抗氧化活性