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按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因torso-like在疟原虫感染按蚊过程中的作用研究

按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因torso-like在疟原虫感染按蚊过程...

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作者：朱凌倩中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

目的:探讨按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因torso-like（tsl）对疟原虫感染按蚊的调控作用。按蚊体内的miR-2944a-3p在疟原虫感染后显著下调,而tsl基因在控制果蝇细胞免疫系统发育中起重要作用。通过实验验证按蚊miR-2944a-3p及其预测靶... 详细信息

目的:探讨按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因torso-like（tsl）对疟原虫感染按蚊的调控作用。按蚊体内的miR-2944a-3p在疟原虫感染后显著下调,而tsl基因在控制果蝇细胞免疫系统发育中起重要作用。通过实验验证按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因tsl在按蚊组织的分布及二者的靶向关系,并进一步探索其对疟原虫感染按蚊过程中的作用,了解两者之间互相作用的分子机制,开发新的疟疾控制策略,为推进我国疟疾消除计划及全球无疟疾愿景提供理论研究基础。方法:根据黑腹果蝇和冈比亚按蚊tsl编码基因,检索大劣按蚊全基因组并鉴别大劣按蚊tsl基因,设计多种特异性引物,采用PCR和qRT-PCR扩增目的基因。利用多种生物信息学软件分析其所编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构、蛋白质二级结构和三级结构等。在MEGA6软件中用Clustal W法对所选蛋白序列进行序列比对,并基于最大似然法（ML）、最大简约（MP）和邻接法（NJ）构建系统发育进化分析（Bootstrap检测值为1000次）。使用实时荧光定量PCR方法检测该基因在头、胸、腹、足的表达特异性。利用生物信息学方法预测miR-2944a-3p靶向作用于tsl基因的3’UTR区,先进行oligo转染及质粒转染验证,以293T细胞基因组DNA为模板,设计tsl基因的野生型和突变型载体序列,并设置对照组PC:即adi-miR-2944a-3p inhibitor两重复序列建入pmirGLO载体组;pmirGlO:即空载体组。并将其分别克隆到pmirGLO载体中,构建双荧光素酶基因报告载体。将miR2944a-3p mimics、mimics NC同野生型载体、突变型载体、PC载体,空载分别转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。采用qRT-PCR的方法了解miR-2944a-3p及tsl的存在和表达,检测雌性按蚊在头、胸、腹及剩余部位的表达水平。一方面鉴定miR-2944a-3p对疟原虫感染的影响:根据miR-2944a-3p的碱基序列,由生工公司合成miRNA模拟物（mimics）、miRNA阴性对照模拟物（negative control,NC）。挑选羽化后3-5日龄的雌性按蚊分别进行两种模拟物的显微注射,注射后两天进行过表达效率检测。同时用伯氏疟原虫感染的BALB/c小鼠（感染率为4%～6%）感染两组蚊媒,感染后8 d解剖中肠,通过荧光显微镜镜检计算两组肠道中疟原虫卵囊数,用Mann-Whitney test进行统计学检验。另一方面鉴定tsl基因对疟原虫感染的影响:利用RNAi技术,根据斯氏按蚊tsl基因及GFP基因的序列,进行扩增纯化,再通过T载体连接及DH5α感受态细胞转化,经过菌落PCR验证后提取质粒,构建体外表达载体,分别制备实验组dstsl和对照组dsGFP。挑选羽化后3-5日龄的雌性按蚊分别进行两种dsRNA的显微注射,注射后两天进行敲低效率检测。注射后四天用伯氏疟原虫感染的BALB/c小鼠（感染率为4%～6%）感染两组蚊媒,感染后8d解剖中肠,通过荧光显微镜镜检计算两组肠道中疟原虫卵囊数,用Mann-Whitneytest进行统计学检验。以此,来验证miR-2944a-3p及预测靶基因tsl对疟原虫感染的影响。结果:Tsl基因全长16751 bp,CDS区1134bp,编码377个氨基酸。TSL蛋白属于亲水性稳定蛋白。经预测TSL蛋白位于膜外的分泌蛋白并且包含信号肽。其二级结构含α-螺旋（51.72%）、延伸链（12.2%）、β-折叠（4.77%）和无规则卷曲（31.30%）,且能以5cj9.1.A为模板进行3D同源建模。系统发育进化分析发现大劣按蚊TSL与法老按蚊TSL亲缘关系较近。组织表达分析显示,该基因在大劣按蚊头、胸、腹、足中均有表达,且在头部表达最高,足部表达量较低。实验组中 adi-miR-2944a-3p mimics 与pmirGLO-ADIR006646-RA 野生型质粒共转48h,与共转mimicsNC组相比荧光素酶表达有统计学差异（P=0.0365）;将ADIR006646-RA的3’UTR序列中adi-miR-2944a-3p结合的位点突变后与adi-miR-2944a-3p mimics共转时,荧光素酶表达量与共转mimics NC组相比无显著差异（P=0.7360）。这一结果表明转染48h,此次实验中构建入载体的ADIR006646-RA 3’UTR序列能与adi-miR-2944a-3p结合,但是结合效果较弱。在斯氏按蚊头、胸、腹、余部中miR-2944a-3p和tsl基因均有表达。并且miR-2944a-3p在胸部表达较高,tsl基因在头部表达较高。鉴定miR-2944a-3p对疟原虫感染的影响:mimics组相对于

关键词： miR-2944a-3p torso-like 按蚊疟原虫媒介-寄生虫相互关系

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