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通过程序性坏死途径研究奎扎替尼抗CIA小鼠关节损伤的作用机制

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通过程序性坏死途径研究奎扎替尼抗CIA小鼠关节损伤的作用机制

作者：刘捷三峡大学

学位级别：硕士

研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种尚未明确发病机制的、对人类健康构成严重威胁的常见慢性自身免疫性疾病。程序性坏死(Necroptosis)途径作为具有较大的潜力的治疗类风湿关节炎的新靶点,由于目前并没有可供临床使... 详细信息

研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种尚未明确发病机制的、对人类健康构成严重威胁的常见慢性自身免疫性疾病。程序性坏死(Necroptosis)途径作为具有较大的潜力的治疗类风湿关节炎的新靶点,由于目前并没有可供临床使用抑制程序性坏死的药物,于是“老药新用”成为RA药物研发的重要策略之一。目的:研究奎扎替尼通过抑制程序性坏死途径对胶原诱导关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)小鼠关节的炎性破坏起到保护作用。方法:(1)选取DBA/1J小鼠分为1个对照组与5个模型组,在不同时间点处死小鼠,测定小鼠后爪厚度,评估小鼠关节肿胀评分,计算关节炎评分,对关节破坏程度进行伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H&E)分析,采用ELISA法检测血清中RIPK1的含量。(2)选取DBA/1J小鼠分为一个对照组和两个模型组,建立胶原诱导关节炎小鼠模型,模型组两组小鼠分别以5mg/Kg、10mg/Kg每日奎扎替尼灌胃,对照组小鼠PBS灌胃,测定小鼠后爪厚度,评估小鼠关节肿胀评分,计算关节炎评分。(3)选取DBA/1J小鼠分为对照组、模型组、治疗组,模型组与治疗组建立胶原诱导关节炎小鼠模型,治疗组给予奎扎替尼灌胃,测量小鼠后爪厚度,评估小鼠关节肿胀评分,计算关节炎评分,采用ELISA法检测血清中受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)的含量,对关节破坏程度进行H&E染色分析,采用免疫荧光检测TNF-α、IL-1β、受体相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase 3,RIPK3),最后以免疫组化检测RIPK1、RIPK3。结果:(1)CIA小鼠模型成功建立,CIA小鼠体内程序性坏死标志蛋白表达增高。(2)获得了CIA小鼠发病过程中各项指标的变化趋势,并且首次检测了不同时间段CIA小鼠血清RIPK1的表达趋势,并确定了奎扎替尼使用量。(3)使用奎扎替尼治疗的小鼠后爪厚度、关节炎评分、H&E染色病理改变、RIPK1、RIPK3水平均较模型组降低。结论:本研究证实了奎扎替尼通过抑制程序性坏死通路的激活而减少炎症因子的释放,从而对CIA小鼠关节损伤起到保护作用,有望成为RA潜在治疗药物,为临床上探索防止RA的新靶点提供了实验依据。

关键词：胶原诱导关节炎程序性坏死奎扎替尼类风湿关节炎

奎扎替尼治疗急性髓系白血病及其耐药机制研究进展

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临床血液学杂志 2020年第3期33卷 359-364页

作者：马蓉艳李莉娟郭晓嘉郝正栋刘敏杰李婷张连生兰州大学第二医院血液科兰州730030

急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一组以髓系造血干祖细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻为特点的高度异质性疾病,多种基因突变是其主要的发病基础[1]。近年来,随着二代测序技术的发展和应用,越来越多的AML相关基因突变... 详细信息

急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一组以髓系造血干祖细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻为特点的高度异质性疾病,多种基因突变是其主要的发病基础[1]。近年来,随着二代测序技术的发展和应用,越来越多的AML相关基因突变被发现,FMS样酪氨酸激酶-3(FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)突变是AML患者最常见的基因突变之一,与AML的高风险复发和不良预后相关[2],尤其是FLT3-内部串联重复(internal tandem duplications,ITD)阳性患者,其抑制剂的相关研究始终是众多学者期望改善高危AML患者的突破点。

关键词：急性髓系白血病 FLT3基因突变 FLT3抑制剂奎扎替尼

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奎扎替尼的合成

中国医药工业杂志 2020年第1期51卷 48-52页

作者：赵宽涛张立勋唐春雷江南大学药学院

对硝基苯酚(2)与4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(3)发生亲核取代反应得到4-[2-(4-硝基苯氧基)乙基]吗啉(4),4经10%钯炭氢化还原得到4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯胺(5)。5经2步环化反应得到7-[2-(4-吗啉基)乙氧基]-2-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b][1,3... 详细信息

对硝基苯酚(2)与4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(3)发生亲核取代反应得到4-[2-(4-硝基苯氧基)乙基]吗啉(4),4经10%钯炭氢化还原得到4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯胺(5)。5经2步环化反应得到7-[2-(4-吗啉基)乙氧基]-2-(4-硝基苯基)咪唑并[2,1-b][1,3]苯并噻唑(8)。8经铁粉和氯化铵还原得到4-[7-[2-(4-吗啉基)乙氧基]咪唑并[2,1-b][1,3]-苯并噻唑-2-基]苯胺(9)。另以3-氨基-5-叔丁基异?唑(10)和氯甲酸苯酯反应得苯基(5-叔丁基异?唑-3-基)氨基甲酸酯(11)。用9与11反应得到奎扎替尼(1),终产物纯度为99.17%,总收率为55%(以2计)。该方法所使用起始原料2价廉易得,且3的用量大大降低,反应条件相对温和,后处理操作简便,可为工业化生产提供参考。

关键词：急性髓系白血病 FLT3抑制剂奎扎替尼合成

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FLT3激酶抑制剂奎扎替尼的合成工艺改进

中国药物化学杂志 2016年第5期26卷 397-401页

作者：吴亚闯郭壮付宝林范旭旭孙晓庆刘亚婧沈阳药科大学基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室辽宁沈阳110016

目的研究FLT3激酶抑制剂奎扎替尼(quizartinib,AC220)的合成工艺。方法以对硝基苯乙酮为原料,经溴代反应得到中间体2-溴-4'-硝基苯乙酮(3);以对苯醌和硫脲为起始原料,经缩合、环合、取代和还原得到重要中间体7-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-2-... 详细信息

目的研究FLT3激酶抑制剂奎扎替尼(quizartinib,AC220)的合成工艺。方法以对硝基苯乙酮为原料,经溴代反应得到中间体2-溴-4'-硝基苯乙酮(3);以对苯醌和硫脲为起始原料,经缩合、环合、取代和还原得到重要中间体7-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-2-(4-氨基苯基)咪唑并[2,1-b]苯并噻唑(7);以氰基频那酮为起始原料,经缩合、取代反应得到重要中间体5-叔丁基异口恶唑-3-氨基甲酸苯酯(9);中间体7和中间体9经取代反应得到目标化合物奎扎替尼。结果与结论目标化合物的结构经1H-NM R、13C-NM R和M S谱确证。该合成路线总收率为52.5%(以对苯醌计),纯度为99.4%(HPLC法)。新工艺路线所用原料相对廉价易得、操作简便、收率较高,可为工业化生产提供参考。

关键词：奎扎替尼急性髓细胞白血病 FLT3抑制剂工艺改进

双sgRNA介导的miR-155基因敲除对FLT3-ITD^(+)AML细胞系的药物敏感性的影响

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中国实验血液学杂志 2022年第2期30卷 334-340页

作者：王凌燕江佩芳李佳蒸胡建达福建医科大学附属协和医院血液科福建省血液病学重点实验室福建省血液病研究所福建福州350001

目的:在CRISPR/Cas9基因编辑系统中引入两条不同结合位点的sgRNA共转染FLT3-ITD;AML细胞系MV411获得miR-155基因敲除的MV411细胞,比较单sgRNA转染与双sgRNA转染法进行的miR-155基因敲除的效率及对细胞相关表型的影响。方法:以慢病毒为... 详细信息

目的:在CRISPR/Cas9基因编辑系统中引入两条不同结合位点的sgRNA共转染FLT3-ITD;AML细胞系MV411获得miR-155基因敲除的MV411细胞,比较单sgRNA转染与双sgRNA转染法进行的miR-155基因敲除的效率及对细胞相关表型的影响。方法:以慢病毒为载体分别构建单转染与双转染的基因敲除细胞,PCR检测基因编辑效率。实时荧光定量PCR法检测miR-155-5p的表达水平。CCK-8法检测细胞增殖能力,并计算细胞对阿霉素与奎扎替尼的药物敏感性。Annexin V-APC/7-AAD双染色检测经阿霉素与奎扎替尼诱导的细胞凋亡水平。结果:CRISPR/Cas9可对miR-155的编码基因进行有效编辑,双sgRNA转染细胞可见明显DNA剪接条带。与单sgRNA转染相比,双sgRNA转染中miR-155-5p的表达水平更低,对阿霉素与奎扎替尼具有更低的IC_(50),更高的药物诱导的细胞凋亡率。结论:双sgRNA转染对miR-155的基因表达的抑制率要高于单sgRNA转染。由双转染基因敲除所引起的细胞抑制增殖、逆转耐药、诱导凋亡等表型更为显著。与单一sgRNA转染相比,双转染sgRNA是一种高效的基因编辑方案。

关键词： miR-155 CRISPR/Cas9 FLT3-ITD 阿霉素奎扎替尼

HDACi联合FLT3i对FLT3-ITD阳性白血病细胞系MV4-11、MOLM-13的作用研究以及相关机制的探讨

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HDACi联合FLT3i对FLT3-ITD阳性白血病细胞系MV4-11、MOLM-13的作...

作者：包洋西南医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究主要探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor,HDACi）联合FMS样酪氨酸激酶-3抑制剂（FMS-like tyrosine kinase 3 inhibitor,FLT3i）能否协同抑制FLT3-ITD（Internal tandem duplication,ITD）阳性的急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞增殖及其相关机制,旨在向FLT3-ITD阳性AML患者获得更加行之有效的药物治疗方式提供临床前依据。方法:将奎扎替尼（Quizartinib,AC220）和西达本胺（Chidamide）以不同浓度单药或联合作用于MV4-11、MOLM-13细胞系48小时后,进行以下检测:1.CCK8检测细胞增殖能力;Compusyn 1.0软件分析两药联合作用的协同效应;2.流式细胞计数法测定各组细胞凋亡率、周期分布。3.Western-Blotting方法测定FLT3、p-FLT3、P53、BCL-2、Bax、p-AKT蛋白表达水平。所有检测方法至少重复三次,实验结果的统计分析均采用Graphpad Prism 8.4.2软件进行。两组间比较采用t检验,结果以均数±标准差（x±s,%）表示。P＜0.05为具统计学差异,P＜0.01为具显著的统计学差异。结果:1.随奎扎替尼及西达本胺单药或联合用药浓度升高,对MV4-11及MOLM-13细胞系的48h增殖抑制率均显著升高（P＜0.05）,并且两药具有协同抑制效应（均CI值＜1）。2.在奎扎替尼1.0nmol/L+西达本胺1.0umol/L作用48h后,细胞凋亡率MV4-11细胞系为31.697%±5.648%,MOLM-13细胞系为18.500%±1.751%,细胞周期阻滞于G0/G1期的比例MV4-11细胞系为78.493%±1.285%,MOLM-13细胞系为89.850%±1.072%,两药联合较奎扎替尼1.0nmol/L或西达本胺1.0umol/L单药使用可明显促进MV4-11及MOLM-13细胞系的凋亡和周期阻滞（P＜0.05）。3.奎扎替尼1.0nmol/L联合西达本胺1.0umol/L治疗较单药能更明显上调P53、BAX促凋亡蛋白,下调抗凋亡蛋白BCL-2及PI3K/AKT信号通路关键下游因子p-AKT。结论:1.西达本胺与奎扎替尼联合应用可协同性地抑制AML细胞的增殖;2.西达本胺与奎扎替尼联合应用较单药更显著地促进AML细胞凋亡及周期阻滞;3.西达本胺与奎扎替尼联合应用是通过下调BCL-2、p-AKT蛋白表达,上调P53、Bax蛋白表达,促进FLT3-ITD阳性白血病细胞系的凋亡及周期阻滞,抑制AML细胞的增殖。

关键词： FMS样酪氨酸激酶-3 急性髓系白血病组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺奎扎替尼

miR-155表达与FLT3-ITD^(+)急性髓系白血病细胞系药物敏感性的关系及机制研究

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中国实验血液学杂志 2024年第2期32卷 395-401页

作者：王凌燕江佩芳李佳蒸陈艳欣胡建达福建医科大学附属协和医院血液科福建省血液病学重点实验室福建省血液病研究所福建福州350001 福建医科大学福建福州350001 福建医科大学附属第二医院福建泉州362000 福建医科大学精准医学研究院福建福州350001

目的:研究miR-155的表达与FLT3-ITD^(+)急性髓系白血病细胞系药物敏感性的关系及潜在的调控机制。方法:通过CRISPR/Cas9基因编辑工具在FLT3-ITD^(+)AML细胞系MV411中实现miR-155编码基因敲除,筛选单克隆细胞,PCR及Sanger测序鉴定单克隆... 详细信息

目的:研究miR-155的表达与FLT3-ITD^(+)急性髓系白血病细胞系药物敏感性的关系及潜在的调控机制。方法:通过CRISPR/Cas9基因编辑工具在FLT3-ITD^(+)AML细胞系MV411中实现miR-155编码基因敲除,筛选单克隆细胞,PCR及Sanger测序鉴定单克隆细胞的基因型,实时荧光定量逆转录PCR鉴定成熟miRNA的表达水平。MTT法计算半数抑制率,比较MV411细胞对多柔比星、奎扎替尼以及米哚妥林的药物敏感性。转录组测序分析miR-155敲除后MV411细胞mRNA水平的变化,基因集富集分析获得miR-155敲除后的信号通路的变化水平,Western blot验证信号通路关键分子的表达。结果:通过PCR初筛和Sanger测序获得了4个基因敲除的杂合子和1个基因插入的杂合子。实时荧光定量逆转录PCR结果显示,这些单克隆细胞中成熟miR-155的表达显著低于野生型克隆。MTT结果显示,与野生型相比,miR-155基因敲除后MV411细胞对多种抗FLT3-ITD^(+)AML的药物敏感性有了显著增加。RNA测序显示miR-155敲除后mTOR信号通路和Wnt信号通路受到抑制。Western blot结果显示,信号通路关键分子p-mTOR、Wnt5α、β-catenin的表达下调。结论:miR-155敲除后能显著提升MV411细胞对多柔比星、奎扎替尼和米哚妥林的药物敏感性,这与包括mTOR及Wnt信号通路在内的多条信号通路的抑制有关。

关键词： miR-155 FLT3-ITD+急性髓系白血病多柔比星米哚妥林奎扎替尼

组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合FMS样酪氨酸激酶-3抑制剂对FLT3-ITD突变白血病细胞增殖、凋亡和周期的影响

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安徽医药 2023年第5期27卷 894-900页

作者：包洋李晓明陈燕夏纪毅贾之锓吴鹏强西南医科大学附属医院血液内科四川泸州646000

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)联合FMS样酪氨酸激酶-3(FLT3)抑制剂对FLT3-ITD突变的急性髓系白血病(AML)细胞系增殖抑制作用及其相关机制。方法将西达本胺(Chidamide)和奎扎替尼(Quizartinib,AC220)以不同浓度单药或联合作用... 详细信息

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)联合FMS样酪氨酸激酶-3(FLT3)抑制剂对FLT3-ITD突变的急性髓系白血病(AML)细胞系增殖抑制作用及其相关机制。方法将西达本胺(Chidamide)和奎扎替尼(Quizartinib,AC220)以不同浓度单药或联合作用于MV4-11、MOLM-13细胞系48 h后,CCK8检测细胞增殖能力;Compusyn 1.0软件分析两药联合作用的协同效应;流式细胞计数法测定各组细胞凋亡率、增殖周期;蛋白质印迹法测定P53、Bcl-2、Bax、FLT3、磷酸化FLT3(p-FLT3)及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达水平。结果随西达本胺及奎扎替尼单药或联合作用浓度升高,对MV4-11及MOLM-13细胞系的48h增殖抑制率均显著升高(P奎扎替尼1.0 nmol/L+西达本胺1.0μmol/L作用48 h后,细胞凋亡率MV4-11细胞株为31.697%±5.648%,MOLM-13细胞株为18.500%±1.751%,细胞周期阻滞于G0/G1期的比例MV4-11细胞株为78.493%±1.285%,MOLM-13细胞株为89.850%±1.072%,两药联合较奎扎替尼1.0 nmol/L或西达本胺1.0μmol/L单药使用可明显促进MV4-11及MOLM-13细胞系的凋亡和周期阻滞(P奎扎替尼1.0 nmol/L联合西达本胺1.0μmol/L治疗较单药能更明显上调P53、BAX促凋亡蛋白,下调p-FLT3、抗凋亡蛋白BCL-2及PI3K/AKT信号通路关键下游因子p-AKT。结论西达本胺与奎扎替尼联合应用可通过下调p-FLT3、p-AKT、Bcl-2蛋白表达,上调P53、Bax蛋白表达,促进FLT3-ITD突变白血病细胞系的凋亡及周期阻滞,抑制AML细胞的增殖活性。

关键词：白血病,髓样,急性 FMS样酪氨酸激酶-3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺奎扎替尼