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天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表达

食品与生物技术学报 2015年第5期34卷 554-559页

作者：韦素真张会姚杨岳苗苗李杰东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030

根据NCBI中的黑曲霉天门冬酰胺酶基因asp序列（GI：145231287）设计特异性引物,从黑曲霉CICC2462基因组中扩增asp基因编码区,构建其黑曲霉表达载体p SZHG-Asp。通过农杆菌介导法转化黑曲霉,筛选以asp基因置换糖化酶基因gla A的同源重组... 详细信息

根据NCBI中的黑曲霉天门冬酰胺酶基因asp序列（GI：145231287）设计特异性引物,从黑曲霉CICC2462基因组中扩增asp基因编码区,构建其黑曲霉表达载体p SZHG-Asp。通过农杆菌介导法转化黑曲霉,筛选以asp基因置换糖化酶基因gla A的同源重组转化子。对转化子的表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活检测。获得8株在gla A位点发生基因置换的同源重组转化子,并对其中4株的上清液进行检测。SDS-PAGE结果显示,在42 000处有目的蛋白质条带,重组菌株的目的蛋白质表达量为185~417μg/m L,发酵液最高酶活为21 111 U/m L。

关键词：天门冬酰胺酶黑曲霉基因置换 Berthelot显色反应

乙二胺羟丙基壳聚糖固定化天门冬酰胺酶的研究

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华东理工大学学报（自然科学版） 2001年第4期27卷 341-343,348页

作者：方波王任远宋道云周纪宁江体乾陈鸿雁华东理工大学化学工程研究所上海200237

研制了新型壳聚糖胺基衍生物——乙二胺羟丙基壳聚糖 ( EDA- HPCS) ,并将其用于固定天门冬酰胺酶。分别考察了甲醛活化载体和戊二醛活化载体对固定化酶活力的影响。结果表明 ,在适当的固定化条件下 ,甲醛活化 EDA- HPCS的固定化酶活力约... 详细信息

研制了新型壳聚糖胺基衍生物——乙二胺羟丙基壳聚糖 ( EDA- HPCS) ,并将其用于固定天门冬酰胺酶。分别考察了甲醛活化载体和戊二醛活化载体对固定化酶活力的影响。结果表明 ,在适当的固定化条件下 ,甲醛活化 EDA- HPCS的固定化酶活力约为 30 U/g载体 ,而戊二醛活化EDA- HPCS固定化酶活力约为 1

关键词：天门冬酰胺酶固定化酶壳聚糖胺基衍生物乙二胺羟丙基壳聚糖活化载体蛋白质合成

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天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表达

天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表达

作者：韦素真东北农业大学

学位级别：硕士

天门冬酰胺酶(asparaginase)别称天冬酰胺酶、门冬酰胺酶等,它的主要功能是水解天门冬酰胺为天门冬氨酸与氨,在动物、微生物、植物组织中广泛存在。动物体内的天门冬酰胺酶主要存在于哺乳动物和鸟类的肝、胰、肾、胃和脾中。黑曲霉中的... 详细信息

天门冬酰胺酶(asparaginase)别称天冬酰胺酶、门冬酰胺酶等,它的主要功能是水解天门冬酰胺为天门冬氨酸与氨,在动物、微生物、植物组织中广泛存在。动物体内的天门冬酰胺酶主要存在于哺乳动物和鸟类的肝、胰、肾、胃和脾中。黑曲霉中的天门冬酰胺酶有两种状态：一种是褐色或浅黄色的液体,一种是淡或深黄色的粉末。能溶于水,但在氯仿、丙酮等有机溶剂中不溶。贮存在水溶液20℃、7天或5℃、14天酶均有活性。黑曲霉CICC2462作为本实验的受体菌,该菌株具有的优势：高表达的蛋白能力、及强的分泌能力、较低的胞外蛋白酶活性、对筛选标记潮霉素及其的敏感。通过基因置换技术把目的基因定点整合到内源高表达的糖化酶基因(glaA)位点,该位点是转录的活跃区,基因调控简单,通过基因置换技术可以消除内源高表达糖化酶基因对外源基因的竞争效应,可实现外源基因的高效表达、工程菌的发酵条件可以进一步得到简化。构建黑曲霉表达载体pSZHG-Asp,采用农杆菌介导黑曲霉遗传转化,该方法具有转化效率高、同源重组率高、遗传稳定性好等特点。利用hph基因表达框两侧的序列,在后续实验中进一步删除潮霉素筛选标记基因,获得食品级天门冬酰胺酶工程菌。此研究思路为国内构建天门冬酰胺酶工程菌提供了新的途径,为高效安全生产酶制剂提供了新的表达系统。主要的研究结果如下：1.天门冬酰胺酶基因的克隆采用CTAB法提取黑曲霉基因组,从提取的基因组中PCR克隆得到天门冬酰胺酶基因,克隆到T-载体,测序正确。2.天门冬酰胺酶基因表达载体的构建将测序正确T-Asp载体、pSZHG载体用相同的酶进行酶切,然后进行连接,构建天门冬酰胺酶表达载体pSZHG-Asp。3.根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化采用农杆菌介导法对黑曲霉进行遗传转化,通过菌落PCR进行筛选,阳性转化率为56.14%。然后农杆菌转化子与黑曲霉共培养,提取的基因组DNA,利用P3、P4引物进行PCR检测,筛选阳性转化子,得到的阳性转化率为30.16%。用P5、P6引物对鉴定正确的转化子进行PCR验证,对是否是同源重组转化子进行鉴定,得到同源重组转化子率为92.45%。将其中4个菌株在含一定浓度的hphB的土豆液体或固体培养基中连续培养、然后进行筛选鉴定,分别用P3、P4,P5、P6引物对20个菌落做PCR鉴定,结果表明3个菌落为纯合的同源重组菌株。4.天门冬酰胺酶在黑曲霉中的表达用发酵培养基对天门冬酰胺酶进行发酵,利用Berthelot显色反应测定天门冬酰胺酶的酶活,发酵时间为21天酶活达到20000U。通过SDS-PAGE电泳,在约40kD处有目的蛋白带,由此知,天门冬酰胺酶在黑曲霉中已得到分泌表达。重组菌株的目的蛋白表达量为185μg/mL～417μg/mL。

关键词：黑曲霉天门冬酰胺酶 Berthelot显色反应基因置换分泌表达

天门冬酰胺酶聚乙二醇-透明质酸/磺丁基-β-环糊精纳米粒体外稳定性的初步研究

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华西药学杂志 2016年第2期31卷 124-127页

作者：谢江川何丹晏子俊周云莉张景勍重庆医科大学药物高校工程研究中心重庆400016

目的制备含载天门冬酰胺酶(Asp)的自组装聚乙二醇-透明质酸/磺丁基-β-环糊精纳米粒(THSCD),并初步研究两者在体外的活性以及稳定性。方法采用自组装法制备THSCD;分别从最适温度、最适p H、酸碱稳定性、热稳定性、贮存稳定性、血浆稳定... 详细信息

目的制备含载天门冬酰胺酶(Asp)的自组装聚乙二醇-透明质酸/磺丁基-β-环糊精纳米粒(THSCD),并初步研究两者在体外的活性以及稳定性。方法采用自组装法制备THSCD;分别从最适温度、最适p H、酸碱稳定性、热稳定性、贮存稳定性、血浆稳定性、抗胰蛋白酶水解能力、部分金属离子及有机化合物影响来考察THSCD中Asp和游离Asp的差异。结果THSCD的最适温度为50℃,游离Asp最适温度为60℃。THSCD的最适p H为6.5,游离Asp的最适p H为7.5。THSCD的热稳定性、贮存稳定性、酸碱稳定性、血浆稳定性测定、抗胰蛋白酶水解能力和抗部分金属离子和有机化合物能力均比游离Asp好。结论 THSCD在提高了Asp在体外活性的同时,也明显地增强了游离Asp在体外的稳定性。

关键词：天门冬酰胺酶自组装聚乙二醇-透明质酸/磺丁基-β-环糊精纳米粒最适温度最适p H 稳定性

琥珀酸弧菌L—天门冬酰胺酶高纯度IgG的制备和应用

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生物工程学报 1989年第1期5卷 30-34页

作者：关颖谦彭惠林何云生陈剑民任克勤焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所

本文报道琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶高纯度IgG的制备,采用溴化氰活化的琼脂糖球珠亲和层析,将IgG中能与受体大肠杆菌结合的组分除去,使该IgG在应用于基因工程筛选中降低本底,重复性好,提高筛选效率。将其用作放射免疫探针和酶联免疫探针... 详细信息

本文报道琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶高纯度IgG的制备,采用溴化氰活化的琼脂糖球珠亲和层析,将IgG中能与受体大肠杆菌结合的组分除去,使该IgG在应用于基因工程筛选中降低本底,重复性好,提高筛选效率。将其用作放射免疫探针和酶联免疫探针,在筛选L-天门冬酰胺酶基因的正克隆中有其独到的优越性。

关键词：琥珀酸弧菌天门冬酰胺酶 IgG制备

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大肠杆菌L－天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达

中国药科大学学报 1996年第11期27卷 696-700页

作者：刘景晶李晶吴梧桐胡梅清中国药科大学生物化学教研室南京铁道医学院生物化学教研室

用一对与大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因（ＡｎｓＢ）两侧序列互补的寡核苷酸Ｅ１，Ｅ２作引物，以大肠杆菌野生株ＣＰＵ２１０００９的染色体ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增得到约１．２ｋｂ的ＤＮＡ片段，将此片段插入ｐＫＫ２３３－２的... 详细信息

用一对与大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因（ＡｎｓＢ）两侧序列互补的寡核苷酸Ｅ１，Ｅ２作引物，以大肠杆菌野生株ＣＰＵ２１０００９的染色体ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增得到约１．２ｋｂ的ＤＮＡ片段，将此片段插入ｐＫＫ２３３－２的ｔａｃ启动子下游，转化不同的大肠杆菌宿主菌株，结果表明以ＣＰＵ２１０００９为宿主菌时，转化子的酶表达量最高，重组Ｌ－天门冬酰胺酶占菌体总蛋白４８．３％，发酵液酶活力达４００ＩＵ／ｍｌ；比活为４８ＩＵ／ｍｇ蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示纯化后的重组Ｌ－天门冬酰胺酶分子量与天然酶相同，均为１４０ＫＤ。

关键词：药物大肠杆菌天门冬酰胺酶基因表达

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氨气敏电极终点速率法测定天门冬酰胺酶活性

临床检验杂志 1992年第3期10卷 114-116页

作者：陈铁河朱炳钗海军医学研究所防护医学研究室上海200433

作者建立了测定天门冬酰胺酶活性的氨气敏电极终点速率法.探讨了温度、pH、时间对测定结果的影响,以及不同pH 的洗涤液对氨气敏电极洗涤复位的速度差异.本法的测定下限为0.0167U/L 天门冬酰胺酶,与Berthelot 氨显色法的相关系数为0.995... 详细信息

作者建立了测定天门冬酰胺酶活性的氨气敏电极终点速率法.探讨了温度、pH、时间对测定结果的影响,以及不同pH 的洗涤液对氨气敏电极洗涤复位的速度差异.本法的测定下限为0.0167U/L 天门冬酰胺酶,与Berthelot 氨显色法的相关系数为0.995,回归系数为0.948,平均回收率为98.8%,批内变异系数为2.7%,批间变异系数3.2%.用酸性洗涤液洗涤氨气敏电极可将处理时间缩短到原来的四分之一.

关键词：天门冬酰胺酶活性测定

载天门冬酰胺酶自组装透明质酸-聚乙二醇/γ-环糊精纳米囊的体外活性和稳定性探究

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重庆医科大学学报 2016年第5期41卷 456-460页

作者：李瑶晏子俊李万玉胡雪原何丹张景勍重庆医科大学药物高校工程研究中心重庆400016

目的:制备载天门冬酰胺酶(asparaginase,AN)自组装透明质酸-聚乙二醇(hyaluronic acid-graft-poly(ethylene glycol),HA-g-PEG)/γ-环糊精(γ-cyclodextrin,γ-CD)纳米囊(HA-g-PEG/γ-CD nanocapsules loaded with AN,AHRPs),并对AHRPs及游离AN在体外的活性及稳定性进行研究。方法:采用自组装法制备了AHRPs,考察了AHRPs的透射电镜、粒径、Zeta电位、最适温度和最适p H,并通过贮存稳定性、抗胰蛋白酶水解能力、抗部分金属离子及有机化合物、热稳定性、酸碱稳定性和血浆稳定性等实验,对游离AN与AHRPs体外稳定性差异进行了一定的考察。结果:AHRPs的粒径为(410.30±3.20)nm,Zeta电位为(-31.40±1.65)m V,AHRPs和游离AN的最适温度分别为50℃和60℃,最适p H值均为7.5。稳定性实验结果显示,相同条件下,AHRPs的贮存稳定性、抗胰蛋白酶水解能力、抗金属离子和有机化合物、热稳定性、酸碱稳定性和血浆稳定性均优于游离AN。结论:AHRPs能同时提高游离AN在体外的活性及稳定性。

关键词：天门冬酰胺酶空心纳米囊稳定性最适p H 最适温度

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L-天门冬酰胺酶产生菌的快速筛选方法

华西药学杂志 1998年第2期13卷 108-109页

作者：潘培根胥劲刘锦琳康梅杨继虞曾蓉华西医科大学医学院成都610041 华西医科大学药学院成都610041

采用一种简易、快速、微量的奈斯勒试剂显色法，可直接从细菌固体培养物中筛选出产生L-天门冬酰胺酶的细菌。该法适用于从大量菌株中快速筛选L-天门冬酰胺酶产生菌。

关键词：天门冬酰胺酶产生菌快速筛选筛选菌种